Summary
Un método de cribado para detectar la oxidación celular entornos es medir la oxidación de la CM-H2DCFDA. Una vez oxidado dentro de una célula, CM-H2DCFDA cambios no fluorescentes en un compuesto fluorescente. Este cambio en la fluorescencia se mide mediante citometría de flujo e indica el número de células en un ambiente oxidativo.
Abstract
Un mecanismo frecuentemente sugerido inducida por el virus de daño neuronal es el estrés oxidativo. Los astrocitos tienen un papel importante en el control de estrés oxidativo del Sistema Nervioso Central (SNC). Los astrocitos ayudan a mantener un medio homeostático de las neuronas, así como la protección de las neuronas a partir de especies reactivas del oxígeno (ROS). CM-H2DCFDA es un indicador penetran en las células de la presencia de ROS. CM-H 2 DCFDA entra en la célula como un compuesto no fluorescente, y se convierte en fluorescente después de esterasas celulares eliminar los grupos de acetato, y el compuesto se oxida. El número de células, medido por citometría de flujo, que se encuentran para ser fluorescente verde es una indicación de la cantidad de células que se encuentran en un estado de oxidación. CM-H 2 DCFDA es susceptible a la oxidación por un gran número de diferentes ROS. Esta falta de especificidad, respecto de los cuales ROS puede oxidar CM-H 2 DCFDA, hace que este compuesto un regente valiosa para su uso en las primeras etapas de una investigación de la patogénesis, ya que este ensayo puede ser utilizado para la detección de un ambiente oxidativo celular, independientemente de que el oxígeno radical o una combinación de ROS son los responsables de las condiciones celulares. Una vez que se ha establecido que las ROS se presentan por la oxidación de la CM-H 2 DCFDA, entonces experimentos adicionales se puede realizar para determinar qué combinación de ROS o ROS están implicados en el proceso de patogénesis particular. Los resultados de este estudio demuestran que con la adición de peróxido de hidrógeno un aumento de la CM-H 2 DCFDA fluorescencia se detectó en relación con los controles de solución salina, lo que indica que este ensayo es una prueba muy útil para la detección de un ambiente oxidativo en las células G355-5, un la línea celular de astrocitos felino.
Protocol
1. De cultivo celular de astrocitos y felino, el tratamiento con H 2 O 2
- La línea de cultivo celular G355-5 en un frasco de 75 cm 2 con los medios de comunicación DMEM más nutrientes a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta el 60% de confluencia (~ 5 días). Vuelva a colocar los medios de comunicación cada 1-2 días o según sea necesario para mantener una cultura saludable.
- Retire el medio y agregar 2 ml de tripsina 0,25%. Levante las células mediante pipeteo durante 45 s - 1 min a temperatura ambiente (TA).
- Rápidamente la transferencia de la suspensión a un tubo cónico de 15 ml que contienen 10 ml de los medios de comunicación. Mezclar suavemente.
- Centrifugar a 300 xg, 23 ° C durante 3 minutos para obtener un pellet. Eliminar el sobrenadante sin perturbar el precipitado.
- Agregar 6-7 ml de medio fresco y volver a suspender las células.
- Añadir aproximadamente 1 ml de células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Agregar 3.2 ml de los medios de comunicación a cada pocillo e incubar hasta el 80-90% confluente.
- Prepare una solución de peróxido de 100μM (H 2 O 2) en los medios de comunicación.
- Retire el medio de cada pocillo y reemplazar con 2 ml de medio fresco (control), 2 ml de H 2 O 2 (tratamiento) o 2 ml de DPBS. Se incuba a 37 ° C CO, 5% 2 de 3 h.
- Quitar las soluciones y agregar 1 ml de tripsina para levantar las células. La transferencia de células a un tubo de 1,7 ml Eppendorf que contiene 0,5 ml de DPBS. Este paso se debe realizar en cada pocillo de forma individual con el fin de prevenir la muerte celular de incubación prolongado tripsina.
- Giran a 300 xg durante 3 minutos, desechar el. Sobrenadante y resuspender en 1 ml de DPBS
2. La tinción de ROS
- Todos los pasos para la tinción debería ser realizada con una exposición mínima de luz para evitar decoloración.
- Añadir 1 l de CCCP 50 mm para el control positivo. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 5 min.
- Añadir 5 l de una 10 mM CM-H 2 DCFDA solución a la H 2 O 2 grupos. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 15-30 min. No mancha, se añade a la muestra de suero salino.
- Lavar las muestras con 2 ml de DPBS para eliminar la mancha residual.
- Giran a 300 xg durante 3 minutos para obtener un pellet.
- Resuspender las células en 0,5 ml de DPBS. Añadir un PI l de cada muestra, con excepción de la solución salina.
- Transferencia de muestras a un tubo de citómetro de flujo de 5 ml.
- Ejecutar en el citómetro de flujo.
3. Citometría de flujo
- Corra las muestras en un FC500 Beckman Coulter (o equivalente) equipado con un láser de 488 nm de argón y los pasos siguientes bandas: 525, 775 y 620 nm, todos ± 20 nm.
- Prepare los controles adecuados: las células no teñidas, CM-H 2 DCFDA manchada sólo, único IP, doble manchadas (control negativo).
- Realizar un protocolo que tiene la histoplots siguiente: FS vs SS, PI vs CM-H DCFDA 2. También debe contar con los histogramas siguientes: el número de células frente a FL1, FL2 y FL3, que se corresponde con las manchas.
- Antes de ejecutar los ejemplos, revise el equipo, los líquidos y contenedores de residuos. Caliente el equipo por lo menos 20 min.
- Limpiar el equipo y realizar una calibración con las cuentas adecuadas de acuerdo a los estándares de los fabricantes.
- Seleccione el protocolo y ejecutar los ejemplos.
- Limpiar el equipo como se hizo anteriormente.
- Limpie la línea de vacío de acuerdo con las normas de los fabricantes.
- Apague la corriente y limpia la línea de la cabeza / de vacío.
- Desactivar el software y el ordenador.
4. Los resultados representativos:
Resultados de citometría de flujo se analizaron mediante FlowJo 7.6 y los controles de la mancha se utiliza para establecer objetivamente la compuerta. Sobre esta base, las células sanas a aparecer en la parte izquierda del gráfico y ROS (estrés oxidativo) se ha detectado como un cambio de celdas a la derecha. La figura 1 muestra los resultados de los efectos del peróxido de hidrógeno en astrocitos sanos felino. Los datos de FL1 se utilizó para medir la intensidad de la CM-H 2 DCFDA, lo que indica la presencia de ROS. Como era de esperar, una mayor cantidad de ROS se detectó en la muestra tratada con H 2 O 2. Esto se muestra en el histograma como un cambio en la intensidad de fluorescencia de izquierda a derecha. Al comparar las células sanas tratadas con DMEM contra DPBS, no hubo ningún cambio significativo en la cantidad de ROS (Fig. 2).
Figura 1. Los resultados de citometría de flujo de los niveles de estrés oxidativo en los astrocitos sanos felino y el efecto de H 2 O 2 en las células sanas. Los resultados indican que el H 2 O 2 aumenta los niveles de ROS en las células sanas en comparación con las células sin tratamiento (DMEM).
Figura 2. Resultados de citometría de flujo de los niveles de ROS detectado en las células sanas se incubaron durante 3 horas con DPBS.
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Discussion
A menudo se sugiere un mecanismo de daño neuronal inducido por el virus es el estrés oxidativo 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. Básicamente, se propone que a través de la exposición al virus de la glía (astrocitos y microglia) liberar los radicales de oxígeno reactivo, tal como hidróxido, el anión superóxido, óxido nítrico y / o peróxido de hidrógeno, que son tóxicos para las neuronas. Del mismo modo, el estrés oxidativo también ha sido sugerido como un importante mecanismo patológico de metanfetamina neurotoxicidad inducida por 2, 6, 17. Dado que nuestro grupo está interesado en los efectos de ambos virus y las drogas de abuso en el SNC, se decidió utilizar una prueba de detección rápida de determinar el momento de exceso de ROS en los astrocitos. La mayoría de glutatión neuronal producida por los astrocitos y luego entregado a las neuronas 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30. Por lo tanto, el papel de los astrocitos en el estrés oxidativo es importante para mantener un medio homeostático de las neuronas, así como la protección de las neuronas de ROS, y es la razón por la que cultivos de astrocitos células fueron escogidos para este estudio.
CM-H 2 DCFDA también se conoce como 2 ', 7'-diclorofluoresceína y H2DCF. CM-H 2 DCFDA es un indicador penetran en las células de la presencia de especies reactivas del oxígeno. CM-H 2 DCFDA entra en la célula como un compuesto no fluorescente, que se convierte en fluorescente después de esterasas celulares eliminar los grupos de acetato, y el compuesto se oxida. Una vez dentro de la célula y los grupos acetato se eliminan, la CM-H 2 DCFDA puede ser oxidado por una serie de especies ROS, incluyendo óxido nítrico, peroxinitrito aniones, el peróxido de hidrógeno, y hidroperóxidos orgánicos 3, 14, 25, resultando en un color verde fluorescentes producto 23, 28. Esta falta de especificar en el ROS, que pueden oxidar CM-H 2 DCFDA, hace que sea un reactivo útil en las primeras etapas de una investigación de la patogénesis, en el que se cree un mecanismo de estrés oxidativo de estar jugando un papel, pero no se sabe que radicales de oxígeno podrían estar involucrados, en lugar de prueba para cada uno por separado ROS. Una vez que se ha establecido que las ROS se presentan por la oxidación de la CM-H 2 DCFDA, entonces experimentos adicionales se puede realizar para determinar, que ROS o la combinación de Ross están involucrados en el proceso de patogénesis particular. Los resultados del presente estudio demuestran que con la adición de peróxido de hidrógeno un aumento de la CM-H 2 DCFDA fluorescencia se detectó en comparación con el control de solución salina, lo que indica que que este ensayo es valiosa prueba para la detección de un ambiente oxidante en el G355-5 células, una línea celular de astrocitos felino.
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Disclosures
Damos las gracias a los productos ReadiSorb por su generoso apoyo de estos estudios.
Acknowledgments
Damos las gracias a los productos ReadiSorb por su generoso apoyo de estos estudios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
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