Summary
Akut njurskada (AKI) hos människor är ett vanligt kliniskt problem som orsakas av skador på epitelceller som utgör njure nefroner, och Aki är förknippad med hög dödlighet på 50-70%
Abstract
Akut njurskada (AKI) kännetecknas av hög dödlighet från försämring av njurfunktionen under en period av timmar eller dagar som kulminerar i njursvikt 1. AKI kan orsakas av ett antal faktorer, inklusive ischemi, drog-baserade toxicitet, eller obstruktiv skada 1. Detta resulterar i en oförmåga att upprätthålla vätske-och elektrolytbalansen homeostas. Medan AKI har observerats i årtionden, effektiva kliniska terapier har ännu inte utvecklats. Fängslande, vissa patienter med AKI återhämta njurfunktion över tid, ett mystiskt fenomen som bara varit rudimentally präglats 1,2. Forskning med hjälp av däggdjur modeller av AKI har visat att ischemisk eller nefrotoxin-skadade njurar erfarenhet epitelceller död i nefronet tubuli 1,2, de funktionella enheterna i njurarna som består av ett antal specialiserade områden (segment) av epitelceller celltyper 3 . Inom nefroner är epitelceller celldöd högsta i proximala tubuli celler. Det finns bevis som tyder på celldöd följs av dedifferentiation, proliferation och migration av omgivande epitelceller, som kan återskapa nephron helt 1,2. Men det finns många obesvarade frågor om mekanismerna för renal epiteliala förnyelse, allt från de signaler som modulerar dessa händelser att orsakerna till den stora variationen av förmågor bland människor för att regenerera skadade njurar.
Den larver zebrafisk är en utmärkt modell för att studera njure epiteliala förnyelse som sin pronephric njure består av nefroner som bevaras med högre ryggradsdjuren, inklusive däggdjuren 4,5. Den nefroner av zebrafisk larver kan visualiseras med fluorescens tekniker på grund av den relativa öppenheten i den unga zebrafisk 6. Detta ger en unik möjlighet att bilden cell-och molekylärbiologi förändringar i realtid, till skillnad från däggdjur modeller där nefroner är otillgängliga eftersom njurarna är strukturellt komplexa system inlemmas i djuret. Nyligen genomförda studier har anställt aminoglykosid gentamicin som ett giftigt smittämnen för studier av AKI och efterföljande njursvikt: gentamicin och andra antibiotika har visat sig orsaka AKI hos människor, och forskare har formulerat metoder för att använda den här agenten för att utlösa njurskador i zebrafisk 7 , 8. Men effekterna av aminoglykosid toxicitet i zebrafisk larver är katastrofala och dödliga, som presenterar en svårighet när man studerar epiteliala förnyelse och funktion över tiden. Vår metod presenterar användning av riktade cell ablation som ett nytt verktyg för studier av epiteliala skada i zebrafisk. Laser ablation ger forskare möjlighet att framkalla celldöd i en begränsad population av celler. Olika delar av cellerna kan riktas baseras på morfologiska plats, funktion, eller till och med uttryck för en viss cell fenotyp. Således kommer laser ablation öka specificitet vad forskare kan studera, och kan bli ett kraftfullt nytt sätt att belysa mekanismerna för renal epiteliala förnyelse. Detta protokoll kan i stort sett tillämpas på målcellen populationer i andra organ i zebrafisk embryot för att studera skador och förnyelse av valfritt antal sammanhang av intresse.
Protocol
1. Mikroinjektion förfarande för att märka zebrafisk pronephros proximala tubuli epitel
För denna procedur används ett mikroinjektion system (Harvard Appartus, PLI90) med tryckluft levereras av en kompressor (Jun-Air, modell 6-4), och mikromanipulator apparater (Narishege delar MN151, IP3 och GJI) som är monteras på ett stereomikroskop station (Nikon, SMZ-Zoom 645) enligt tillverkarens anvisningar. Dextran konjugat lätt endocyteras av nefronet proximala tubuli, så förmånliga märkning av epitelceller befolkning 9.
- Exponering för metylenblått kan accentuera autofluorescens av gulesäcken och gör visualisering av nephron tubuli svårare.
- Höj befruktade embryon vid 28,5 ° C till en utveckling tidpunkterna mellan 48-55 timmar efter befruktning (HPF). Detta är den idealiska stadiet att utföra larver microinjections grund av den lätthet med vilken intramuskulär mikroinjektion kan utföras och eftersom njurfunktionen inträder vid denna tidpunkt.
- Ta bort chorion från okläckta zebrafisk hjälp av ett par fina tång. Skölj chorion skräp från petriskål och fyll skålen med 30 ml av modifierad E3 lösning.
- Förbered en injektion fack för embryon. Vår föredras injektion mögel är tillverkad av 1,5% agarose/E3, där trekantiga depressioner bildas så att embryot kan placeras på insidan för injektion. För att göra injektion mögel, flyter vi en plastform med kilformat utbuktningar (beskrivs i detalj tidigare 11) i en petriskål fylld med en bas på 1,5% agaros.
- Förbered nålar glas mikroinjektion genom att dra kapillärrör med en nål avdragare, som beskrivs i Zebrafish Bok 10. I korthet, dra glaset kapillärrör sedan använda fina metall tång för att klippa toppen av mikroinjektion nål för att göra en spets med en vass spets medan du tittar på nålspetsen under ett stereomikroskop. Förvara skär nålar täckt i en petriskål och placeras på modellera för att skydda den skurna kanten och undvika att damm samlas.
- Förbered injektionslösningen att märka den proximala tubuli. Lös upp 40 kD dextran-fluorescein konjugat (Invitrogen, D1845) vid en koncentration av 1 mg / ml i destillerat vatten.
- Att söva fisken, tillsätt 5 ml av 0,2% Tricaine pH 7,0 till petriskål innehåller zebrafisk larver i 30 ml av E3. Fisken bedövas när de inte längre uppvisar anslagskänslighet. Det är viktigt att fisken är helt bedövad eller kommer de att rycka på att försöka att injicera dem.
- Överför bedövas fisken till en injektion mögel magasin med hjälp av en plast överföring pipett. Placera djuret med huvudet i den djupaste delen av den trekantiga depression också, och på sidan så att stammen vilar längs den vinklade sidan av brunnen.
- Utför intramuskulär mikroinjektion. Ladda ett snitt nål med 2-3 mikroliter av dextran fluorescein, och injicera djuret i en koffert somit med cirka 1 NL lösning. Sikta på den övre delen av somit och undvika gulesäcken förlängning. Detta säkerställer att nefronet tubuli inte mekaniskt förstörs av mikroinjektion processen.
- Överföring injiceras zebrafisk till en ren petriskål och lägga modifierad E3 lösning. Skölj djuren 3 gånger med färska E3 för att avlägsna alla spår av Tricaine. Täck locket på petriskål med aluminiumfolie för att ge ljus-skydd för dextran, och skicka tillbaka djuren till 28 ° C inkubator över natten.
2. Riktade laser ablation av proximala tubuli celler
För denna procedur används ett stereomikroskop med epifluorescence att göra mål djur med dextran fluorescein klart märkt proximala tubuli och välja dessa för laser ablation. Sedan använder vi en pulsad systemet micropoint laser (Fotoniska Instruments, Inc) som har fäst ett sammansatt mikroskop (Nikon Eclipse 80i med epifluorescent bilaga), och kalibrerad för användning enligt tillverkarens anvisningar, att utföra nephron cell ablation. Vi har haft mest framgång i cell ablation med hjälp av en FITC-filter som gör det möjligt för forskare att visa fluorescerande tubuli regioner som brightfield belysning.
Inför detta förfarande förbereda immobilisering media för ablation genom att lösa 1,5% metylcellulosa på 0,02% tricaine/E3. Förvara alikvoter av metylcellulosa för omedelbar användning vid rumstemperatur eller vid 4 ° C för långtidsförvaring.
- Bedöva 72 HPF zebrafisk genom att tillsätta 5 ml av 0,2% Tricaine pH 7,0 till petriskål innehåller zebrafisk larver i 30 ml av E3. Fisken bedövas när de inte längre uppvisar anslagskänslighet. Det är viktigt att fisken är helt bedövad eller kommer de att rycka på att försöka utföra laser ablation. Undersök den injicerade djuren under lämplig fluorescerande inställning och välja djur där du enkelt kan visualisera den proximala tubuli.
- Överföring utvalda embryon till en separat skål med tricaine. Djur kan vara sövd för upp till 30 minuter innan du utför cell ablation. Om du poäng> 15 djur, återlämna dessa till en separat skål med färska modifierad E3 i väntan på ablation som varje cell ablation tar flera minuter.
- För att utföra ablation, överföra en sövda zebrafisk till en liten petriskål som innehåller 1,5% methylcellulose/0.02% tricaine i 2 minuter att tvätta embryo i immobilisering medier.
- Därefter överför embryot till ett glas depression bild med en nedgång på 1,5% methylcellulose/0.02% tricaine. Försiktigt placera djuret med en fin sond sådan att dess ventrala sidan är vänd bilden och rygg är vänd uppåt.
- Placera bilden på compund mikroskop scenen och fokusera på ryggsidan av djuret. Utför ablation av nephron celler i fokus genom att trycka på fotpedalen. Du kommer att se spridning av den fluorescens som nedsatt epitelceller är borttagen (Figur 1A).
- Försiktigt överföra borttagen djuret till en brunn i en 12 väl maträtt för kommande odling. Skölj E3 2-3 gånger för att tvätta bort metylcellulosa.
- Efter injektion, höja djuret till önskad tidpunkterna och utföra önskad analys enligt etablerade histologiska och molekylära tekniker för unga sebrafisk embryon (figur 2).
3. Representativa resultat:
De data som visas i figur 1 visar ablation tidsförloppet. Efter intramuskulär injektion med dextran-konjugat är proximala tubuli företrädesvis märkta. Injektion av dextran-FITC användes för att märka njuren för laser ablation och borttagen djur återinsprutas med dextran-Rhodamine vid ett extra tidpunkterna efter ablation till Reimage den proximala tubuli befolkningen. Expression analys tekniker som in situ hybridisering kan användas för att analysera förändringar i fasta prover vid enstaka tidpunkter efter cell ablation, som visas i figur 2.
Figur 1: Laser ablation förfarande följs av en snabb förnyelse av tubuli epitelet (AC) tidsförloppet för cellförändringar under och efter laser ablation av zebrafisk larv proximala tubuli vid tidpunkten för ablation (dag 3, panel A), eller en eller tre. dagar efter ablation (dag 4, panel B, dag 7, panel C). (Top) schemat visar position nephron med dextran-FITC (grön) och dextran-Rhodamine (röd), och (nederst) levande bilder av kontroll och laser-borttagen (LA) nephrons.
Figur 2:. Analys av genuttryck efter laser ablation Efter laser ablation på dag 3, var embryon fast och behandlas av hela montera in situ hybridisering att upptäcka avskrifter för slc20a1a, som markerar den proximala tubuli segment av nephron. (A) En kontroll embryo som inte utsattes för laser ablation, (B) ett embryo i vilket en stor sträcka av tubuli epitel var borttagen, och (C) ett embryo i vilket ett kort intervall tubuli epitel var borttagen. Svart linje visar omfattningen av den proximala tubuli i A för att ge referens, blå linjer ange omfattningen av laser ablation i paneler f.Kr. och * anger kontrollen (icke-borttagen) kontralateral nefronet i paneler BC.
Discussion
Den zebrafisk är en allmänt använd modell organism över många aspekter av vetenskap, är de tillämpningar som växer 6. Anställning av den zebrafisk modellsystem i studier av njursjukdomar som AKI har lett till viktiga observationer och kommer att fortsätta att vara en bra modell för att studera njurskada 7,8. Med en arvsmassa som har sekvenserat och många molekylära protokoll som, har det blivit allt lättare att utföra avancerade zebrafisk forskning som använder transgena modeller, gen ÖVERVÄLDIGANDE och studier misexpression. Den zebrafisk har en kort livscykel med stora generationen storlekar och väl definierade utvecklingsstadier. Dessutom zebrafisk embryonala och larvstadier är till stor del öppna, vilket gör imaging studier möjligt utan dissektion av organismen. Under embryots och larvstadier har zebrafisk en pronephric njure består av två nefroner, som förblir synliga under dessa utvecklande tidpunkter. Zebrafisk pronephric nefroner är enhetliga i struktur och funktion till sina däggdjur motsvarigheter, vilket gör det en bra modell för akut njursvikt studier 4,5.
Njuren är avgörande för överlevnaden av människor och andra ryggradsdjur, som tjänar som det organ som renar kroppen av flytande metaboliska avfall. Denna renande funktion vilar på förmågan av njuren nephrons att filtrera blodet, och sedan ändra filtratet att samla kvävehaltiga avfall för sekretion och samtidigt upprätthålla vätske-och elektrolytbalansen. Nephrons består av en blod-filter, epiteliala tubuli och rinna in i en kanal. De strukturella och funktionella integritet av alla tre delar är en integrerad del av nefronet funktion. Olika förolämpningar till njuren, inklusive exponering för nephrotoxins, ischemi, eller stopp i urinvägarna utflöde skrifter kan resultera i AKI 1. Patologin vid AKI förknippas ofta med akut tubulär nekros 1,2. Kliniska studier har visat att efterföljande njursvikt har en dödlighet som kan variera allt från 7 till 80% beroende på orsak och samband med njursvikt. Det är dock snabb diagnos och vändning av den underliggande orsaken till AKI förknippas alltmer med återvinning genom förnyelse av nekrotisk nephron tubuli. Nyligen öde kartläggning studier har visat att de stora cellen befolkningen som repopulates skadade nefronet tubuli är epitelceller som kommer från angränsande, oskadade områden 12. Dessa fynd har inte eliminerat möjligheten att nedsatt stam / progenitorceller får delta i processen, och oberoende rapporter har visat att benmärg härledda celler kan bidra till nedsatt föryngring 13. Det är tydligt att fortsatta undersökningar behövs för att bättre lösa cellulära källor av renal epiteliala förnyelse.
Både nefronet förnyelse och utveckling av delar fenomenet switchar i cellulär tillstånd mellan mesenkymala och epiteliala fenotyper. Under nefronet utveckling, mesenkymala stamceller differentieras till en stationär fenotyp är knutna till en basalmembranet att bilda tubulära epitel 3. De spekulerade migration av epitelceller efter akut njursvikt kräver en dedifferentiation till en mesenkymala fenotyp. Intressant, nya studier visar att mesenkymala celler i skadade njurar uppvisar ett uttryck profil som liknar en mesenkymala celler under utveckling 14. Olika rapporter har upptäckt förändringar i molekyler cell adhesion, proteiner matris, cytokiner och kemokiner. Efter den föreslagna mesenkymala till epiteliala övergången, celler ihop på ett basalmembran och starta på nytt den tubulära epitelceller aktiviteter. Fastställande av gener viktiga i denna process fortsätter att vara ett ämne för forskning för vårt laboratorium och andra. Mycket av arbetet med att klarlägga de viktigaste faktorerna i denna process återstår att göra, men betydande framsteg på området har hyllats av en studie av effekterna av gentamicin.
AKI och njursvikt orsakad av gentamicin är relevant med tanke på förekomsten av nefrotoxiska ämnen används inom medicinen 15. Används som behandling av gramnegativa bakteriella infektioner, leder administrering av aminoglykosider till akut skada i 10-25% av fallen. Drogen orsakar en uppsjö av negativa cellulära effekter, tillsammans resulterar i apoptos eller nekros i många tubulära celler. Studier har visat att läkemedlet binder företrädesvis till ett komplex bestående av Megalin och cubulin som är inblandad i endocytos. Dessa molekyler finns i överflöd i epitelceller i proximala tubuli, men de är inte begränsade till uttryck i dessa celler. Genom cellulär signalering leder till induktion av oxidativ stress, frigörande av kärlsammandragande, utarmning av cellulära ATP, hypoxi, hämning av phospholipases, gentamicin och liknande antibiotika orsakarapoptos och nekros i epitelceller. Dessutom antibiotika utlösa mesangial nedgång i nefronet blodet filtret (glomerulus), vilket resulterar i en nedgång i glomerulär filtrationshastighet och negativt förändra förmåga njurarna att filtrera blodet. Produktionen av reaktiva syreradikaler, molekyler immunstimulerande, och aktivering av phospholipases har diffusa effekter i nefronet, att skapa en katastrofal patologi som leder till akut njursvikt.
Medan gentamicin och liknande antibiotika studier har varit och kommer fortsätta att vara viktiga verktyg för njure föryngring forskning saknar de en precision som kan vara användbara för att lösa vissa frågor. Vårt system för att använda zebrafisk i samband med en laser ablation som beskrivs i detta protokoll svarar mot behovet av en sådan exakt forskningsverktyg. Laser ablation möjligt för forskare att framkalla celldöd i centrala delar av renala tubuli, allt från en liten (2-3) till stora (> 50-100) populationer, med oöverträffad precision. I detta protokoll använder vi en tidigare utvecklad metod för exponering av dextran-konjugat till företrädesvis etiketten proximala tubuli epiteliala populationer. Alternativt kan transgena zebrafisk linjer som uttrycker grönt fluorescerande proteinet i en eller flera regioner i tubuli användas. Till exempel cadherin17: EGFP transgena zebrafisk uppvisar stark fluorescens i distala tubuli regioner (men svag i proximala populationer), och kan vara värdefull för studier av förnyelse i andra tubuli segment 16. Synlighet nephron gör tidsförlopp videoinspelning av cellulära förändringar över tid. När den kombineras med studier genuttryck som hela montera in situ hybridisering och immunhistokemi kan forskarna upptäcka molekylära förändringar i nephron över tiden. Sammantaget kan sådana strategier börja formulera en mer dynamisk förståelse av de händelser som genomsyra när njurarna epitelceller förstörs.
Den största nackdel med vår laser ablation modell är att det kan rekapitulera partiella aspekter av fysiologiska förhållanden som sippra i mänskliga AKI. Den celldöd inducerad genom momentan fysiska skador skiljer sig från den kaskad av händelser som leder till nekros i celler, och som sådan den humorala faktorer i dessa olika mikromiljöer inte kan vara identiska. Dessutom finns det tecken på apoptos inducerad under njurskada, och det är inte känt om dessa konsekvenser genomsyra efter förolämpning med en laser. Men precis som cellodling är ett verktyg som bättre svar på några frågor som kräver en mycket kontrollerad miljö, kommer laser ablation fungera som en kontrollerad mycket in vivo modell av AKI. Som sådan samlat de insikter från renal epiteliala ablation studier i zebrafisk kommer sannolikt att främja upptäckten av grundläggande insikter som kan tillämpas på utredningar av andra njur-skador och potentiellt användas för att skapa bättre diagnostik på människor.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar medlemmar i Wingert labb för bra diskussioner om AKI biologi och zebrafisk tekniker, och C. Diep för att dela hans metylcellulosa recept. Författarna vill också uttrycka vår tacksamhet till de anställda i Notre Dame Centrum för Zebrafish forskning för att ge utmärkt pågående djurhållning hand om våra zebrafisk koloni. Finansiering från NIH-NIDDK beviljande av bidrag DK083512, och generösa laboratorium startbidrag från University of Notre Dame, stött detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo dishes | Falcon BD | 35-1005 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Injection needles | Sutter Instrument Co. | BF100-50-10 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 | |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 204, 13-711-23 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| Depression slide | Fisher Scientific | S175201 | |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
References
- Thadhani, R., Pascual, M., Bonventre, J. V. Acute renal failure. New Eng. J. Med. 334, 1448-1460 (1996).
- Bonventre, J. V. Dedifferentiation and proliferation of surviving epithelial cells in acute renal failure. J Am. Soc. Nephrol. 14, 55-61 (2003).
- Dressler, G. R. The cellular basis of kidney development. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 509-529 (2006).
- Wingert, R. A., Selleck, R., Yu, J., Song, H. D., Chen, Z., Song, A., Zhou, Y., Thisse, B., Thisse, C., McMahon, A. P., Davidson, A. J. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3, 1922-1938 (2007).
- Wingert, R. A., Davidson, A. J. The zebrafish pronephros: a model to study nephron segmentation. Kidney Int. 73, 1120-117 (2008).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Hentschel, D. M., Park, K. M., Cilenti, L., Zervos, A. S., Drummond, I. A., Bonventre, J. V. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288, 923-9229 (2005).
- Cosentino, C. ianciolo, Roman, C., Drummond, B. L., A, I., Hukriede, N. A. Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury. J Vis Exp. (42), e2079-e2079 (2010).
- Drummond, I. A., Majumdar, A., Hentschel, H., Elger, M., Solnica-Krezel, L., Schier, A. F., Neuhauss, S. C. F., Stemple, D. L., Zwartkruis, F., Rangini, Z., Driever, W., Fishman, M. C. Early development of the zebrafish pronephros and analysis of mutations affecting pronephric function. Development. 125, 4655-4657 (1998).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. , 3rd ed, University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394-e1394 (2009).
- Humphreys, B. D., Valerius, M. T., Kobayashi, A., Mugford, J. W., Soeng, S., Duffield, J., McMahon, A. P., Bonventre, J. V. Intrinsic epithelial cells repair the kidney after injury. Cell Stem Cell. 2, 284-291 (2008).
- Bussolati, B., Hauser, P. V., Carvalhosa, R., Camussi, G. Contribution of stem cells to kidney repair. Curr. Stem Cell Res. Therapy. 4, 2-8 (2009).
- Devarajan, P. Update on mechanisms of ischemic acute kidney injury. J. Am. Soc. Nephrol. 17, 1503-1520 (2006).
- Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view. Kid. Int. , (2010).
- Diep, C. Q., Ma, D., Holm, T., Naylor, R., Arora, N., Wingert, R., Bollig, F., Djordjevic, G., Lichman, B., Zhu, H. Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish. Nature. 470, 95-100 (2011).
