Summary
Lésions rénales aiguës (IRA) chez les humains est un problème clinique fréquent causé par des dommages aux cellules épithéliales qui forment néphrons du rein, et Aki est associée à des taux de mortalité élevé de 50-70% 1. Suite à la destruction des cellules épithéliales, néphrons ont une capacité limitée à se régénérer, même si les mécanismes et les limites qui guident ce phénomène reste mal compris. Dans cet article, vidéo, nous décrivons notre technique pour l'ablation laser ciblée des cellules rénales néphron dans le rein d'embryon de poisson zèbre, ou pronéphros. Notre nouvelle méthode peut être utilisée en complément de la néphrotoxicité induite par les modèles d'AKI et acquérir une compréhension de haute résolution de la cellule et des altérations moléculaires qui sont associés à la régénération épithéliale dans le néphron de rein.
Abstract
Lésions rénales aiguës (IRA) est caractérisée par des taux de mortalité élevé de la détérioration de la fonction rénale sur une période de plusieurs heures ou jours qui culmine dans une insuffisance rénale. AKI peut être causée par un certain nombre de facteurs, notamment l'ischémie, de médicaments à base de toxicité, ou de blessures obstructive 1. Il en résulte une incapacité à maintenir l'homéostasie des fluides et d'électrolytes. Bien AKI a été observé pendant des décennies, efficaces thérapies cliniques doivent encore être développés. Curieusement, certains patients atteints d'IRA de récupérer des fonctions rénales au cours du temps, un mystérieux phénomène qui n'a été que 1,2 rudimentally caractérisée. Recherche utilisant des modèles de mammifères de AKI a montré que les reins ischémiques ou néphrotoxine-blessés expérience de la mort des cellules épithéliales dans les tubules du néphron 1,2, les unités fonctionnelles du rein qui se composent d'une série de régions spécialisées (segments) de types de cellules épithéliales 3 . Dans néphrons, mort des cellules épithéliales est plus élevée dans les cellules des tubules proximaux. Il est prouvé que suggère la destruction des cellules est suivie par dédifférenciation, la prolifération et la migration des cellules épithéliales environnantes, ce qui peut régénérer le néphron entièrement 1,2. Cependant, il ya beaucoup de questions sans réponse sur les mécanismes de la régénération épithéliale rénale, allant des signaux qui modulent ces événements pour des raisons de la variation éventail de capacités parmi les humains à se régénérer reins blessés.
Le poisson zèbre larvaires fournit un excellent modèle pour étudier la régénération épithéliale de rein comme son reins pronephric est composé de néphrons qui sont conservées avec les vertébrés supérieurs, y compris les mammifères 4,5. Les néphrons des larves de poisson zèbre peut être visualisée avec des techniques de fluorescence en raison de la relative transparence de la jeune zèbre 6. Ceci fournit une occasion unique de cellule d'image et les changements moléculaires en temps réel, contrairement aux modèles de mammifères, où néphrons sont inaccessibles parce que les reins sont des systèmes complexes structurellement intériorisée au sein de l'animal. Des études récentes ont utilisé la gentamicine aminoglycosides comme un agent toxique responsable pour l'étude des AKI et ultérieures insuffisance rénale: la gentamicine et d'autres antibiotiques ont été montré pour causer AKI chez les humains, et les chercheurs ont formulé des méthodes à utiliser cet agent pour déclencher des lésions rénales chez le poisson zèbre 7 , 8. Toutefois, les effets de la toxicité des aminoglycosides chez les larves de poisson zèbre sont catastrophiques et mortelle, qui présente une difficulté lorsque l'on étudie la régénération épithéliale et la fonction au cours du temps. Notre méthode présente l'utilisation de l'ablation des cellules ciblées comme un nouvel outil pour l'étude des lésions épithéliales chez le poisson zèbre. L'ablation laser donne aux chercheurs la capacité d'induire la mort cellulaire dans une population limitée de cellules. Domaines variables de cellules peuvent être ciblés en fonction de l'emplacement morphologiques, la fonction, ou même l'expression d'un phénotype cellulaire particulier. Ainsi, l'ablation laser va augmenter la spécificité de ce que les chercheurs peuvent étudier, et peut être une nouvelle approche puissante pour faire la lumière sur les mécanismes de régénération épithéliale rénale. Ce protocole peut être largement appliquée à cibler les populations de cellules dans d'autres organes dans l'embryon de poisson zèbre pour étudier les blessures et la régénération dans un certain nombre de contextes d'intérêt.
Protocol
1. Procédure de microinjection d'étiqueter le poisson zèbre pronéphros l'épithélium des tubules proximaux
Pour cette procédure, nous utilisons un système de micro-injection (APPAREIL Harvard, PLI90), à l'air comprimé fourni par un compresseur d'air (juin-Air, modèle 6-4), et un appareil micromanipulateur (Narishege pièces MN151, IP3, et GJI) qui sont assemblé à une station de stéréomicroscope (Nikon, SMZ-Zoom 645) que les instructions du fabricant. Dextran conjugués sont facilement endocytose par le tubule proximal du néphron, permettant marquage préférentiel de cette population de cellules épithéliales 9.
- L'exposition au bleu de méthylène peut accentuer l'autofluorescence de la vésicule ombilicale et rend la visualisation du néphron tubules plus difficile.
- Levez les embryons fécondés à 28,5 ° C à une date jalon de développement entre 48-55 heures après fécondation (HPF). Ceci est l'étape idéale pour effectuer microinjections larves en raison de la facilité avec laquelle les micro-injection intra-musculaire peut être effectuée, et parce que la fonction rénale commence à ce moment.
- Retirez le chorion de tout le poisson-zèbre non éclos en utilisant une paire de pinces fines. Rincer les débris chorion de la boîte de Pétri et remplissez le plat avec 30 ml de solution modifiés E3.
- Préparer un bac d'injection pour les embryons. Notre moule d'injection préféré est de 1,5% agarose/E3, dans lequel les dépressions triangulaires sont formés de telle sorte que l'embryon peut être placé à l'intérieur pour l'injection. Pour faire le moule d'injection, nous flottons un moule en plastique avec des saillies en forme de coin (décrite en détail précédemment 11) dans une boîte de Pétri remplie avec une base de 1,5% d'agarose.
- Préparer des aiguilles de microinjection de verre en tirant des tubes capillaires avec un extracteur d'aiguilles, comme décrit dans le livre 10 poisson zèbre. En bref, tirer les tubes capillaires en verre puis utiliser une pince métallique fine pour couper la pointe de l'aiguille de microinjection de faire un bout avec une pointe tout en regardant la pointe de l'aiguille sous un stéréomicroscope. Stocker les aiguilles coupées recouvert d'une boîte de Pétri et positionné sur la pâte à modeler pour protéger le bord coupé et prévenir l'accumulation de poussière.
- Préparer la solution d'injection à l'étiquette du tube contourné proximal. Dissoudre 40 kD dextran-fluorescéine conjugué (Invitrogen, D1845) à une concentration de 1 mg / mL dans l'eau distillée.
- Pour anesthésier les poissons, ajoutez 5 ml de 0,2% tricaïne pH 7,0 à la boîte de Pétri contenant des larves de poisson zèbre dans 30 ml de l'E3. Les poissons sont anesthésiés quand ils ne présentent plus la réponse au toucher. Il est vital que les poissons sont complètement anesthésiés ou ils seront sur la contraction de tenter de les injecter.
- Transférer les poissons anesthésiés à un plateau de moule d'injection à l'aide d'une pipette de transfert en plastique. Position de l'animal avec sa tête dans la partie la plus profonde de la dépression triangulaire, bien, et sur le côté de telle sorte que le tronc est posé le long du côté incliné du puits.
- Effectuer la microinjection intramusculaire. Charger une aiguille coupé avec 2-3 uL de dextran fluorescéine, et injecter de l'animal dans un somite tronc avec environ 1 nL de solution. Visez la partie supérieure du somite, et éviter l'extension du sac vitellin. Cela garantit que les tubules du néphron ne sont pas mécaniquement perturbées par le processus de micro-injection.
- Transfert zebrafish injecté à une boîte de Petri propre, et ajouter modifiés solution de l'E3. Rincez les animaux 3 fois avec l'E3 douce pour enlever toute trace de tricaïne. Couvrir le couvercle de la boîte de Pétri avec du papier d'aluminium pour fournir la lumière de protection pour le dextrane, et le retour des animaux à l'incubateur à 28 ° C la nuit.
2. Ablation laser ciblée des cellules des tubules proximaux
Pour cette procédure, nous utilisons un stéréomicroscope à épifluorescence pour marquer les animaux avec le dextran fluorescéine brillamment marqué tubules proximaux et sélectionnez ces derniers pour l'ablation laser. Ensuite, nous utilisons un système laser pulsé micropointe (Instrumentation photonique, Inc) qui a été relié à un microscope composé (Nikon Eclipse 80i avec l'attachement à épifluorescence) et calibré pour une utilisation selon les instructions du fabricant, pour effectuer l'ablation de cellules néphron. Nous avons eu le plus de succès dans l'ablation de cellules en utilisant un filtre FITC qui permet au chercheur de voir les régions tubule fluorescente sous un éclairage fond clair.
En prévision de cette procédure, préparer des milieux d'immobilisation pour l'ablation par dissolution de la méthylcellulose 1,5% dans 0,02% tricaine/E3. Aliquotes magasin de méthylcellulose pour une utilisation immédiate à la température ambiante, ou à 4 ° C pour stockage à long terme.
- Anesthésier le poisson zèbre 72 HPF en ajoutant 5 ml de pH 7,0 à 0,2% tricaïne la boîte de Pétri contenant des larves de poisson zèbre dans 30 ml de l'E3. Les poissons sont anesthésiés quand ils ne présentent plus la réponse au toucher. Il est vital que les poissons sont complètement anesthésiés ou ils seront sur la contraction de tenter d'effectuer l'ablation laser. Examiner les animaux injectés sous le réglage approprié fluorescentes et sélectionner les animaux dans laquelle vous pouvez facilement visualiser les tubules proximaux.
- Transfert des embryons sélectionnés pour un plat séparé contenant tricaïne. Les animaux peuvent être anesthésiés pour jusqu'à 30 minutes avant d'effectuer l'ablation de cellules. Si vous marquez> 15 animaux, le retour de ces d'un plat à part contenant fraîche E3 modifiés en attendant l'ablation comme chaque cellule de l'ablation prend plusieurs minutes.
- Pour effectuer l'ablation, transférer une zebrafish anesthésié pour une petite boîte de Petri contenant 1,5% methylcellulose/0.02% tricaïne pendant 2 minutes pour laver l'embryon dans les médias d'immobilisation.
- Ensuite, le transfert de l'embryon à une diapositive de dépression en verre contenant une baisse de 1,5% methylcellulose/0.02% tricaïne. Doucement la position de l'animal avec une sonde fine de telle sorte que sa face ventrale visages de la glissière et la face dorsale vers le haut.
- Placer la lame sur la platine du microscope compund, et se concentrer sur la face dorsale de l'animal. Effectuer une ablation des cellules néphron cadre d'autres priorités en appuyant sur la pédale. Vous verrez la dispersion de la fluorescence que les cellules épithéliales rénales sont une ablation (figure 1A).
- Délicatement le transfert de l'animal à l'ablation d'un puits dans un puits 12-vaisselle pour la culture suivante. Rincez les 2-3 E3 fois pour laver la méthylcellulose.
- Après l'injection, élever l'animal à l'timepoint désirée et effectuer des analyses souhaitées établies selon des techniques histologiques et moléculaires pour les jeunes embryons de poissons zèbres (figure 2).
3. Les résultats représentatifs:
Les données qui sont présentées dans la figure 1 indiquent les timecourse ablation. Après injection intramusculaire de dextran-conjugués, le tubule proximal est préférentiellement étiquetés. L'injection de dextran-FITC a été utilisé pour étiqueter les reins pour l'ablation laser, et les animaux ont été réinjectées avec ablation dextrane-rhodamine moins un point de temps d'ablation supplémentaires suivantes pour réimager la population des tubules proximaux. Techniques d'analyse d'expression, comme l'hybridation in situ peut être utilisée pour analyser les changements dans les échantillons fixés à timepoints unique à la suite d'ablation de cellules, comme le montre la figure 2.
Figure 1: procédure d'ablation par laser est suivie d'une régénération rapide de l'épithélium tubulaire (AC) Timecourse des changements cellulaires pendant et après l'ablation laser des tubules proximaux larves de poisson zèbre au moment de l'ablation (jour 3, partie A), ou un ou trois. L'ablation jours après (jour 4, partie B; jour 7, partie C). (Haut) schémas montrent la position du néphron, avec le dextran-FITC (vert) et dextrane-rhodamine (rouge), et (en bas) des images en direct de contrôle et ablation laser (LA) néphrons.
Figure 2:. Analyse de l'expression des gènes suivants ablation laser Après l'ablation laser au jour 3, les embryons ont été fixées et traitées par le mont toute hybridation in situ pour détecter des transcriptions pour slc20a1a, qui marquent le segment tubule contourné proximal du néphron. (A) Un embryon de contrôle qui n'a pas été soumis à l'ablation laser, (B) un embryon dans lequel une grande étendue de l'épithélium tubulaire a été enlevé, et (C) un embryon dans lequel un court intervalle de l'épithélium tubulaire a été ablation. La ligne noire indique la mesure du tube contourné proximal de A à fournir une référence, des lignes bleues indiquent l'étendue de l'ablation laser dans les panneaux de la Colombie-Britannique, et * indique le témoin (non-ablation) néphron controlatérale dans les panneaux de la Colombie-Britannique.
Discussion
Le poisson zèbre est un organisme modèle largement utilisé dans de nombreux aspects de la science, dont les applications sont de plus en plus 6. L'emploi du système modèle de poisson zèbre à l'étude des maladies du rein comme Aki a conduit à d'importantes observations et continuera à être un bon modèle pour étudier 7,8 lésions rénales. Avec un génome a été séquencé et de nombreux protocoles moléculaires mis en place, il est devenu de plus en plus faciles à effectuer des recherches sophistiquées qui utilise le poisson zèbre modèles transgéniques, inactivation génique et des études misexpression. Le zèbre a une courte durée de vie avec des tailles de génération de grands et bien défini les stades de développement. Par ailleurs, les stades embryonnaire et larvaire de poisson zèbre sont largement transparentes, ce qui rend possible des études d'imagerie sans dissection de l'organisme. Tout au long de stades embryonnaire et larvaire, le poisson zèbre a un rein pronephric composé de deux néphrons, qui restent visibles pendant ces timepoints développement. Zebrafish néphrons pronephric sont analogues dans la structure et la fonction à leurs homologues de mammifères, ce qui en fait un bon modèle pour les études d'insuffisance rénale aiguë 4,5.
Le rein est cruciale pour la survie des humains et autres vertébrés, servant de l'organe qui nettoie le corps des déchets métaboliques liquide. Cette fonction de nettoyage repose sur la capacité des néphrons du rein à filtrer le sang, puis modifiez le filtrat de collecter les déchets azotés pour la sécrétion et de maintenir simultanément l'équilibre hydro-électrolytique. Néphrons sont composés d'un filtre du sang, des tubules épithéliaux, et s'écouler dans un conduit. L'intégrité structurale et fonctionnelle de chacune des trois parties fait partie intégrante de néphrons fonctionnels. Diverses lésions du rein, notamment l'exposition à néphrotoxines, l'ischémie, ou une obstruction des voies urinaires sorties peuvent entraîner une insuffisance rénale aiguë. La pathologie de l'IRA est souvent associée à 1,2 nécrose tubulaire aiguë. Des études cliniques ont montré que l'insuffisance rénale qui s'ensuit a un taux de mortalité qui peut varier de 7 à 80% selon la cause et le contexte de l'insuffisance rénale. Cependant, un diagnostic rapide et l'inversion de la cause sous-jacente de AKI est de plus associé à la récupération par l'intermédiaire de régénération des tubules du néphron nécrotiques. De récentes études ont montré la cartographie sort que la population cellulaire majeur qui repeuple tubules néphron endommagés sont des cellules épithéliales qui proviennent de zones adjacentes indemne 12. Ces résultats n'ont pas éliminé la possibilité que les rénale cellules souches / progénitrices peuvent participer au processus, et des rapports indépendants ont suggéré que les cellules dérivées de moelle osseuse peut contribuer à la régénération rénale 13. Il est clair que la poursuite des investigations sont nécessaires pour mieux résoudre les sources cellulaires de régénération épithéliale rénale.
La régénération et le développement néphron deux parts le phénomène d'interrupteurs en état cellulaire entre les phénotypes mésenchymateuses et épithéliales. Au cours du développement des néphrons, les cellules progénitrices mésenchymateuses se différencient en un phénotype stationnaire, attachés à une membrane basale pour former l'épithélium tubulaire 3. Le phénomène migratoire des spéculé cellules épithéliales suivantes insuffisance rénale aiguë nécessite une dédifférenciation dans un phénotype mésenchymateux. Fait intéressant, des études récentes suggèrent que les cellules mésenchymateuses dans les reins endommagés présentent un profil d'expression semblable à une cellule mésenchymateuse lors du développement 14. Divers rapports ont détecté des changements dans les molécules d'adhésion cellulaire, protéines de la matrice, des cytokines et chimiokines. Suite à la mésenchymateuses proposé pour la transition cellules épithéliales, montés sur une membrane basale et relancer les activités tubulaires épithéliales. Déterminer les gènes importants dans ce processus continue d'être un sujet de recherche pour notre laboratoire et d'autres. La plupart des travaux d'élucider les facteurs clés dans ce processus reste à faire, mais des progrès significatifs dans le domaine a été annoncée par l'étude des effets de la gentamicine.
AKI et une insuffisance rénale causée par la gentamicine est pertinent compte tenu de la prévalence des composés néphrotoxiques utilisées en médecine 15. Utilisé comme traitement pour les bactéries gram-négatives des infections bactériennes, l'administration des aminosides conduit à des lésions aiguës de 10-25% des cas. Le médicament provoque une pléthore d'effets négatifs sur cellulaire, ainsi traduit par apoptose ou nécrose dans de nombreuses cellules tubulaires. Des études ont montré que le médicament se lier préférentiellement à un complexe formé par la mégaline et cubulin qui est impliqué dans l'endocytose. Ces molécules sont présentes en abondance dans les cellules épithéliales du tube contourné proximal, si elles ne sont pas limités à l'expression dans ces cellules. Grâce à la signalisation cellulaire entraînant l'induction d'un stress oxydatif, la libération de vasoconstricteurs, l'épuisement des ATP cellulaire, l'hypoxie, l'inhibition des phospholipases, les antibiotiques gentamicine et provoquer similairesapoptose et nécrose des cellules épithéliales. En outre, les antibiotiques déclenchent la contraction mésangiale dans le sang néphron filtre (glomérule), résultant en une baisse du taux de filtration glomérulaire et négativement altérer la capacité du rein à filtrer le sang. La production d'espèces réactives de l'oxygène, de molécules immunostimulantes, et l'activation des phospholipases avoir des effets diffus dans le néphron, la création d'une catastrophe de pathologie qui conduit à une insuffisance rénale aiguë.
Alors que la gentamicine et des études similaires aux antibiotiques ont été et continueront d'être des outils importants pour la recherche de régénération du rein, il leur manque une précision qui peut être utile pour traiter certaines questions. Notre système de l'utilisation du poisson zèbre en conjonction avec une méthode d'ablation laser décrit dans ce protocole répond au besoin d'un tel outil de recherche précis. L'ablation laser permet aux chercheurs d'induire la destruction des cellules dans les domaines d'intervention du tubule rénal, allant d'un petit (2-3) à grande (> 50-100) des populations, avec une précision inégalée. Dans ce protocole, nous utilisons une méthode précédemment développée de l'exposition au dextrane-conjugués de manière préférentielle l'étiquette populations épithéliales des tubules proximaux. Sinon, le poisson-zèbre transgénique lignes qui expriment la protéine fluorescente verte dans un ou plusieurs régions du tubule pourraient être utilisés. Par exemple, cadherin17: eGFP transgéniques présentent une forte fluorescence poisson zèbre dans les régions tubule distal (bien que faible dans les populations proximale), et pourrait être précieuse pour les études de régénération dans les segments des tubules d'autres 16. La visibilité du néphron permettra l'enregistrement vidéo time-lapse de modifications cellulaires au cours du temps. Couplé avec les études d'expression génique tels que le mont toute hybridation in situ ou immunohistochimie, les chercheurs peuvent détecter des altérations moléculaires dans le néphron au fil du temps. Pris ensemble, ces stratégies peuvent commencer à formuler une compréhension plus dynamique des événements qui transpirent quand cellules épithéliales rénales sont détruits.
La mise en garde importante de notre modèle d'ablation laser est qu'il peut reprendre des aspects partiels de l'état physiologique qui transpirent dans les humains AKI. La mort cellulaire induite par les dommages physiques instantanée est différente de la cascade d'événements qui conduit à la nécrose des cellules, et en tant que tels des facteurs humoraux dans ces différents microenvironnements peuvent pas être identiques. En outre, il existe des preuves de l'apoptose induite lors de lésions rénales, et il ne sait pas si de telles conséquences transpirent l'insulte suivante avec un laser. Cependant, tout comme la culture cellulaire est un outil qui mieux répond à quelques questions qui nécessitent un environnement hautement contrôlé, l'ablation laser sera un très contrôlée modèle in vivo de l'IRA. En tant que tel, les idées recueillies auprès rénale Des études d'ablation épithéliales chez le poisson zèbre sera probablement favoriser la découverte des idées fondamentales qui peuvent être appliquées à des enquêtes sur d'autres lésions rénales et potentiellement utilisé pour créer de meilleurs diagnostics chez les humains.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire pour les discussions utiles Wingert de AKI la biologie et les techniques de poisson zèbre, et C. Diep pour le partage de sa recette méthylcellulose. Les auteurs souhaitent également exprimer notre gratitude aux membres du personnel du Centre Notre-Dame pour la recherche de poisson zèbre pour fournir d'excellents soins élevage en cours pour notre colonie de poisson zèbre. Le financement de l'attribution de subvention NIH-NIDDK DK083512, et le laboratoire généreux fonds de démarrage de l'Université de Notre-Dame, ont soutenu ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo dishes | Falcon BD | 35-1005 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Injection needles | Sutter Instrument Co. | BF100-50-10 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 | |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 204, 13-711-23 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| Depression slide | Fisher Scientific | S175201 | |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
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