Summary
Lesão renal aguda (IRA) em seres humanos é um problema clínico comum causado por danos às células epiteliais que compõem néfrons nos rins, e AKI está associada com altas taxas de mortalidade de 50-70% 1. Após a destruição das células epiteliais, néfrons têm uma capacidade limitada de regeneração, embora os mecanismos e as limitações que orientam este fenômeno ainda são pouco compreendidas. Neste artigo de vídeo, descrevemos nossa técnica de ablação a laser alvo de células renais dos néfrons nos rins embrião zebrafish, ou pronephros. Nosso novo método pode ser utilizado para complementar a nefrotoxicidade induzida por modelos de LRA e obter uma compreensão de alta resolução da célula e alterações moleculares que estão associados com a regeneração epitelial no néfron rim.
Abstract
Lesão renal aguda (IRA) é caracterizada por altas taxas de mortalidade da deterioração da função renal por um período de horas ou dias que culmina com insuficiência renal 1. AKI pode ser causada por uma série de fatores incluindo a toxicidade isquemia, drogas de base, ou lesão obstrutiva 1. Isso resulta em uma incapacidade de manter a homeostase de fluidos e eletrólitos. Enquanto AKI tem sido observada há décadas, eficazes terapias clínicas ainda precisam ser desenvolvidos. Curiosamente, alguns pacientes com LRA recuperar funções renal ao longo do tempo, um fenômeno misterioso que tem sido caracterizada apenas rudimentally 1,2. Pesquisa utilizando modelos de mamíferos de AKI tem mostrado que os rins isquêmicos ou feridos nefrotoxina-experiência da morte de células epiteliais no néfron túbulos 1,2, as unidades funcionais do rim, que são compostos de uma série de regiões especializadas (segmentos) de tipos de células epiteliais 3 . Dentro de néfrons, a morte das células epiteliais é maior nas células do túbulo proximal. Há evidências que sugerem que a destruição das células é seguido por desdiferenciação, proliferação e migração de células epiteliais vizinhas, o que pode regenerar o néfron inteiramente 1,2. No entanto, há muitas perguntas não respondidas sobre os mecanismos de regeneração epitelial renal, que vão desde os sinais que modulam a esses eventos para razões para a grande variação das habilidades entre os seres humanos para regenerar rins feridos.
O peixe-zebra larval fornece um excelente modelo para estudo da regeneração do rim epiteliais como seu rim pronephric é composto de néfrons, que são conservados com vertebrados superiores, incluindo mamíferos 4,5. Os néfrons de larvas de peixe-zebra pode ser visualizado com as técnicas de fluorescência por causa da relativa transparência do zebrafish jovens 6. Isso proporciona uma oportunidade única de célula de imagem molecular e mudanças em tempo real, em contraste com os modelos de mamíferos, onde néfrons são inacessíveis porque os rins são sistemas estruturalmente complexos internalizados no animal. Estudos recentes têm empregado a gentamicina aminoglicosídeo como um agente tóxico causador de estudo do AKI e insuficiência renal subseqüente: gentamicina e outros antibióticos foram mostrados para causar lesão renal aguda em seres humanos, e os pesquisadores formularam métodos para usar este agente para provocar danos nos rins em zebrafish 7 , 8. No entanto, os efeitos de toxicidade aminoglicosídeo em larvas do peixe são catastróficas e letais, que apresenta uma dificuldade quando se estuda a regeneração epitelial e função ao longo do tempo. Nosso método apresenta a utilização da ablação de células alvo como uma nova ferramenta para o estudo de lesões epiteliais em zebrafish. Ablação a laser dá aos pesquisadores a capacidade de induzir a morte celular em uma população limitada de células. Áreas que variam de células podem ser direcionados com base na localização morfológica, função ou até mesmo a expressão de um fenótipo celular particular. Assim, a ablação a laser vai aumentar a especificidade do que os pesquisadores podem estudar, e pode ser uma abordagem nova e poderosa para lançar luz sobre os mecanismos de regeneração do epitélio renal. Este protocolo pode ser amplamente aplicada a populações de células-alvo em outros órgãos no embrião do zebrafish para estudar lesão e regeneração em qualquer número de contextos de interesse.
Protocol
1. Procedimento de microinjeção para rotular o zebrafish pronephros epitélio do túbulo proximal
Para este procedimento, usamos um sistema microinjeção (Harvard aparatos, PLI90), com ar pressurizado fornecido por um compressor de ar (Jun-Air, modelo 04/06), e aparelhos micromanipulador (Narishege partes MN151, IP3 e GJI) que são montada em um posto de estereomicroscópio (Nikon, SMZ-Zoom 645) como as instruções do fabricante por. Conjugados dextrano são prontamente endocytosed pelo túbulo proximal do néfron, permitindo rotulagem preferencial desta população de células epiteliais 9.
- Exposição ao azul de metileno pode acentuar a autofluorescência do saco vitelino e torna a visualização do néfron túbulos mais difícil.
- Levantar os embriões fertilizados em 28,5 ° C para um ponto no tempo de desenvolvimento entre 48-55 horas após a fertilização (hpf). Esta é a fase ideal para realizar microinjeções larvas por causa da facilidade com que microinjeção intramuscular pode ser executada, e porque a função renal começa neste momento.
- Remover o córion de qualquer zebrafish unhatched usando um par de fórceps bem. Enxágüe os restos do córion placa de Petri e encha o prato com 30 mL de solução modificada E3.
- Prepare uma bandeja de injeção para os embriões. Nosso molde de injeção preferido é feito de 1,5% agarose/E3, em que depressões triangulares são formados de tal modo que o embrião pode ser posicionado dentro injectável. Para fazer o molde de injeção, nós flutuamos um molde de plástico com saliências em forma de cunha (descrito em detalhes anteriormente 11) em uma placa de Petri cheia com uma base de agarose 1,5%.
- Prepare agulhas microinjeção de vidro puxando tubos capilares com um extrator de agulhas, como descrito no Livro Zebrafish 10. Em breve, puxe a tubos capilares de vidro, em seguida, utilize uma pinça de metal fina para cortar a ponta da agulha microinjeção de fazer uma ponta com uma ponta afiada durante a visualização da ponta da agulha sob um estereomicroscópio. Armazenar as agulhas corte coberto por uma placa de Petri e posicionados em massa de modelar para proteger a borda de corte e evitar o acúmulo de poeira.
- Prepare a solução de injeção para rotular o túbulo proximal. Dissolver 40 kD dextran-fluoresceína conjugada (Invitrogen, D1845), na concentração de 1 mg / mL em água destilada.
- Para anestesiar o peixe, adicionar 5 mL de 0,2% tricaina pH 7.0 para a placa de petri contendo as larvas do peixe em 30 mL de E3. Os peixes são anestesiados quando eles já não apresentam a resposta ao toque. É vital que os peixes são completamente anestesiados ou eles vão se contorcer em cima tentando injetá-las.
- Transferir os peixes anestesiados com uma bandeja de molde de injeção usando uma pipeta de transferência de plástico. A posição do animal com a cabeça na parte mais profunda da depressão triangular bem, e em seu lado de tal forma que o tronco está apoiado ao longo do lado do bem angulado.
- Executar microinjeção intramuscular. Carregar uma agulha de corte com 2-3 mL de dextran fluoresceína, e injetar o animal em um somito tronco com aproximadamente 1 nL de solução. Apontar para a parte superior do somito, e evitar a gema de extensão sac. Isso garante que os túbulos de néfrons não são mecanicamente interrompidos pelo processo de microinjeção.
- Transferência de zebrafish injetado para uma placa de Petri limpa e adicione modificada solução E3. Enxágüe os animais 3 vezes com E3 fresca para remover todos os vestígios de tricaina. Cobrir a tampa da placa de Petri com papel de alumínio para fornecer a luz de proteção para o dextran, e devolver os animais aos 28 ° C incubadora durante a noite.
2. Ablação a laser alvo de células do túbulo proximal
Para este procedimento, usamos um estereomicroscópio com epifluorescência para marcar animais com dextran marcado com fluoresceína brilhantemente túbulos proximal e selecionar esses para ablação laser. Então, nós usamos um sistema laser pulsado Micropoint (Instrumentos Fotônicos, Inc), que foi acoplada a um microscópio composto (Nikon Eclipse 80i com anexo de epifluorescência), e calibrado para uso como instruções do fabricante, para realizar a ablação néfron celular. Tivemos o maior sucesso na ablação de células usando um filtro que permite FITC o pesquisador para ver as regiões dos túbulos fluorescente sob iluminação de campo claro.
Antes de este procedimento, prepare media imobilização para a ablação por dissolução de metilcelulose 1,5% em 0,02% tricaine/E3. Alíquotas loja de metilcelulose para uso imediato em temperatura ambiente, ou a 4 ° C para armazenamento de longo prazo.
- Anestesiar o peixe-zebra hpf 72 pela adição de 5 mL de 7,0 a 0,2% pH tricaina para a placa de petri contendo as larvas do peixe em 30 mL de E3. Os peixes são anestesiados quando eles já não apresentam a resposta ao toque. É vital que os peixes são completamente anestesiados ou eles vão se contorcer em cima tentar executar a ablação laser. Examine os animais injetado sob a configuração apropriada fluorescentes e selecionar animais em que você pode facilmente visualizar os túbulos proximal.
- Transferência de embriões selecionados para um prato separado contendo tricaina. Os animais podem ser anestesiados por até 30 minutos antes de realizar a ablação de células. Se você pontuação> 15 animais, o retorno destes para um prato separado contendo E3 modificada fresco, enquanto se aguarda a ablação como cada célula ablação leva alguns minutos.
- Para realizar a ablação, a transferência de um peixe-zebra anestesiados para uma pequena placa de Petri contendo 1,5% tricaina methylcellulose/0.02% por 2 minutos para lavar o embrião na mídia imobilização.
- Em seguida, transferir o embrião para uma lâmina de vidro contendo depressão uma queda de 1,5% methylcellulose/0.02% tricaina. Suavemente a posição do animal com uma sonda fina de tal forma que seu lado ventral enfrenta o slide e no lado dorsal é voltada para cima.
- Coloque o slide no palco microscópio compund, e foco no lado dorsal do animal. Realização da ablação das células do néfron em foco, pressionando o pedal. Você vai ver a dispersão da fluorescência como as células epiteliais são ablated renal (Figura 1A).
- Suavemente transferência do animal ablated a um poço em um 12 bem-prato para cultura subseqüente. Lavar a E3 2-3 vezes para lavar a metilcelulose.
- Após a injeção, elevar o animal ao ponto no tempo desejado e realizar a análise desejada conforme estabelecido técnicas histológicas e molecular de embriões zebrafish jovens (Figura 2).
3. Resultados representativos:
Os dados que são mostrados na Figura 1 indicam a timecourse ablação. Após a injeção intramuscular com dextran-conjugados, o túbulo proximal é preferencialmente rotulados. Injeção de Dextran-FITC foi usado para rotular o rim para ablação a laser, e os animais foram ablated reinjetado com dextran-rodamina menos uma ablação timepoint adicionais a seguir para recriar a população túbulo proximal. Técnicas de análise de expressão como a hibridização in situ pode ser usado para analisar as mudanças em amostras fixadas em intervalo de tempo após a ablação única célula, como mostrado na Figura 2.
Figura 1: procedimento de ablação a laser é seguido de rápida regeneração do epitélio tubular (AC) Timecourse de alterações celulares durante e após a ablação a laser de túbulos larva zebrafish proximal no momento da ablação (dia 3, o painel A), ou um ou três. dia pós-ablação (dia 4, painel B, dia 7, painel C). (Top) esquemas mostrar a posição do néfron, com dextran-FITC (verde) e dextran-rodamina (vermelho), e (em baixo) imagens ao vivo de controle e laser-ablated (LA) néfrons.
Figura 2:. Análise da expressão gênica após a ablação a laser Após ablação a laser no dia 3, os embriões foram fixados e processados por montar toda a hibridização in situ para detectar transcrições para slc20a1a, que marcam o segmento de túbulo convoluto proximal do néfron. (A) Um embrião de controle que não foi submetido a ablação a laser, (B) um embrião em que uma grande extensão do epitélio dos túbulos foi ablated, e (C) um embrião em que um intervalo curto de epitélio dos túbulos foi ablated. Linha preta indica a extensão do túbulo proximal em A para fornecer referência, linhas azuis indicam a extensão da ablação a laser em painéis BC, e * indica que o controle (não-ablated) néfron contralateral em painéis BC.
Discussion
O peixe-zebra é um organismo modelo amplamente utilizado ao longo de muitos aspectos da ciência, cujas aplicações estão crescendo 6. O emprego do sistema de modelo peixe-zebra no estudo de doenças renais como AKI tem levado a importantes observações e continuará a ser um bom modelo para estudar lesão renal 7,8. Com um genoma que foi seqüenciado e muitos protocolos molecular no lugar, tornou-se cada vez mais fácil realizar pesquisas zebrafish sofisticado que utiliza modelos transgênicos, knockdown do gene e estudos misexpression. O peixe-zebra tem um ciclo de vida curto, com tamanhos geração grande e bem definida estágios de desenvolvimento. Além disso, os estágios embrionário e larval do peixe-zebra são praticamente transparente, fazendo estudos de imagem possível sem dissecção do organismo. Ao longo da fase embrionária e larval, o peixe-zebra tem um rim pronephric composto de duas néfrons, que permanecem visíveis durante estes timepoints desenvolvimento. Néfrons zebrafish pronephric são análogas em estrutura e função com os seus homólogos de mamíferos, tornando-se um bom modelo para estudos de insuficiência renal aguda 4,5.
O rim é crucial para a sobrevivência dos seres humanos e outros vertebrados, servindo como o órgão que limpa o corpo de resíduos metabólicos líquido. Esta função cleansing repousa sobre a capacidade dos néfrons dos rins de filtrar o sangue, e em seguida, modificar o filtrado para coletar resíduos nitrogenados para a secreção e, simultaneamente, manter o equilíbrio de líquidos e eletrólitos. Néfrons são compostos de um filtro de sangue, túbulos epiteliais, e drenam para um duto. A integridade estrutural e funcional de todas as três partes é essencial para a função néfron. Vários insultos ao rim, incluindo a exposição à nefrotoxinas, isquemia, ou obstrução das vias do fluxo urinário podem resultar em AKI 1. A patologia da AKI é freqüentemente associada com 1,2 necrose aguda tubular. Estudos clínicos têm demonstrado que se seguiu insuficiência renal tem uma taxa de mortalidade que pode variar 7-80%, dependendo da causa e do contexto da falha renal. Entretanto, o diagnóstico rápido e reversão da causa subjacente da AKI é cada vez mais associados com a recuperação através da regeneração dos túbulos do néfron necrótico. Estudos de mapeamento recente destino têm mostrado que a população de células grandes que preenche os túbulos de néfrons danificadas são células epiteliais que se originam de adjacentes, áreas uninjured 12. Essas descobertas não eliminaram a possibilidade de que renal tronco / progenitoras células podem participar do processo, e relatórios independentes têm sugerido que células da medula óssea derivados podem contribuir para a regeneração renal 13. É claro que as investigações continuaram são necessários para melhor resolver as fontes celulares de regeneração do epitélio renal.
Tanto a regeneração néfron e desenvolvimento compartilhar o fenômeno da muda em estado de celular entre os fenótipos mesenquimal e epitelial. Durante o desenvolvimento do néfron, as células progenitoras mesenquimais se diferenciam em um fenótipo estacionário, inerentes a uma membrana basal para formar o epitélio tubular 3. O fenômeno migratório especularam de células epiteliais após insuficiência renal aguda necessita de uma desdiferenciação em um fenótipo mesenquimal. Curiosamente, estudos recentes sugerem que as células mesenquimais nos rins danificados apresentam um perfil de expressão semelhante a uma célula mesenquimal durante o desenvolvimento 14. Vários relatórios têm detectado mudanças nas moléculas de adesão celular, proteínas, citocinas e quimiocinas. Após a mesenquimais proposta para a transição do epitélio, as células remontar sobre uma membrana basal tubular e reiniciar atividades epiteliais. Determinar os genes importantes neste processo continua a ser um tópico de pesquisa para o nosso laboratório e outros. Grande parte do trabalho para elucidar os fatores-chave neste processo a ser feito, mas um progresso significativo no campo tem sido anunciado pelo estudo dos efeitos da gentamicina.
AKI e insuficiência renal causada pela gentamicina é relevante considerando a prevalência de compostos nefrotóxicos usados na medicina 15. Usado como um tratamento para bactérias gram-negativas infecções bacterianas, a administração de aminoglicosídeos leva a lesão aguda em 10-25% dos casos. A droga causa uma infinidade de efeitos negativos no celular, em conjunto, resultando em apoptose ou necrose em muitas células tubulares. Estudos descobriram que a droga se ligam preferencialmente a um complexo formado por megalina cubulin e que está envolvido na endocitose. Estas moléculas são encontradas em abundância nas células epiteliais do túbulo proximal, embora eles não se limitam a expressão nestas células. Através de sinalização celular, resultando na indução do estresse oxidativo, liberação de vasoconstritores, a depleção de ATP celular, hipóxia, a inibição de fosfolipases, antibióticos gentamicina e similares causaapoptose e necrose em células epiteliais. Além disso, os antibióticos desencadear contração mesangial no sangue néfron filtro (glomérulo), resultando em uma queda na taxa de filtração glomerular e negativamente alterando a capacidade dos rins de filtrar o sangue. A produção de espécies reativas de oxigênio, moléculas imunoestimulador, e ativação de fosfolipases têm efeitos difusos no néfron, criando uma patologia catastrófico que leva à insuficiência renal aguda.
Enquanto gentamicina e estudos similares aos antibióticos têm sido e continuarão a ser ferramentas importantes para a pesquisa de regeneração renal, falta-lhes uma precisão que pode ser útil no tratamento de questões certas. Nosso sistema de usar o peixe-zebra em conjunto com um método de ablação por laser descrito neste protocolo responde à necessidade de tal ferramenta de pesquisa tão precisa. Ablação a laser permite que os pesquisadores para induzir a destruição das células em áreas focais do túbulo renal, que vão desde um pequeno (2-3) e grandes (> 50-100) populações, com uma precisão inigualável. Neste protocolo, utilizamos um método previamente desenvolvido de exposição ao dextran-conjugados preferencialmente rótulo populações túbulo proximal epiteliais. Alternativamente, linhagens transgênicas zebrafish que expressam a proteína verde fluorescente em uma ou mais regiões do túbulo poderia ser usado. Por exemplo, cadherin17: eGFP zebrafish transgênicos apresentam fluorescência forte em regiões do túbulo distal (embora fraco em populações proximal), e pode ser valiosa para estudos de regeneração em segmentos túbulo outros 16. A visibilidade do néfron permitirá lapso de tempo de gravação de vídeo de alterações celulares ao longo do tempo. Quando combinada com estudos de expressão gênica, como montar toda a hibridização in situ ou imuno-histoquímica, os pesquisadores podem detectar alterações moleculares no néfron ao longo do tempo. Tomados em conjunto, essas estratégias podem começar a formular uma compreensão mais dinâmica dos eventos que transpire quando as células epiteliais renais são destruídas.
A ressalva importante de nosso modelo de ablação a laser é que ele pode recapitular aspectos parciais das condições fisiológicas que acontecem no AKI humana. A morte celular induzida por dano físico instantânea é diferente da cascata de eventos que leva à necrose das células, e como tal os fatores humoral nestes microambientes diferentes não podem ser idênticas. Além disso, existe evidência de apoptose induzida durante a lesão renal, e não se sabe se tais conseqüências transpire insulto a seguir com um laser. No entanto, assim como a cultura de células é uma ferramenta que as melhores respostas a algumas perguntas que necessitam de um ambiente altamente controlado, ablação a laser servirá como altamente controlada in vivo modelo de LRA. Como tal, os insights obtida a partir renal estudos ablação epitelial em zebrafish provavelmente vai promover a descoberta de conhecimentos fundamentais que podem ser aplicadas a investigações de outras lesões renais e potencialmente usada para criar um melhor diagnóstico em seres humanos.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a membros do laboratório Wingert para discussões úteis do AKI biologia e técnicas de peixe-zebra, e Diep C. para compartilhar a sua receita de metilcelulose. Os autores também gostaria de expressar nossa gratidão aos membros do pessoal da Notre Dame Centro de Pesquisa Zebrafish para prestação de cuidados de manejo em curso excelente para a nossa colônia zebrafish. Financiamento da concessão da subvenção NIH-NIDDK DK083512, generosa e laboratoriais start-up de financiamento da Universidade de Notre Dame, apoiou este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embryo dishes | Falcon BD | 35-1005 | |
| Dissection forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5010 | |
| Injection needles | Sutter Instrument Co. | BF100-50-10 | |
| Ultrapure agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| 40 kilodalton (kD) Dextran-fluorescein | Invitrogen | D1845 | |
| Plastic transfer pipet | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 204, 13-711-23 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0262 | |
| Depression slide | Fisher Scientific | S175201 | |
| 12-well dish | Corning | 3512 |
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