Summary
هنا أنشأنا وسيلة لاختبار نجاعة الدواء مع العينات الجراحية للأورام الدماغ ، ويسمى "طريقة يزدرع ورم سرطاني". مع هذا الأسلوب ، يمكننا تقييم نجاعة الأدوية دون كسر المكروية من الأورام الصلبة. للتحقق من مصداقية هذه الطريقة ، ونحن تصف بيانات عينة ممثلة مع دبقي لدينا تعامل مع وكيل أول السطر الحالي العلاج الكيميائي ، temozolomide.
Abstract
العلاجات الحالية للدبقي الخبيثة لها تأثير سوى المسكنات. من أجل التنمية العلاجية ، واحدة عقبة تتمثل في التفاوت في فعالية الحالية التي تحددها اختبارات كفاءة وفعالية الدواء على المرضى. وبالتالي ، هناك ما يبرر أساليب جديدة وموثوق بها لتقييم نجاعة الأدوية في مرحلة ما قبل السريرية. المختبر في الثقافة من الأنسجة السرطانية ، بما في ذلك خطوط الخلية ، وإجراء تعديلات جوهرية المظهرية والوراثية ، وجينية من خلايا السرطان الناجمة عن بيئة اصطناعية للثقافة الخلية ، والتي قد لا تعكس بيولوجيا الأورام في الموقع الأصلي. نماذج طعم أجنبي مع الفئران العوز المناعي أيضا قيود ، أي عدم وجود نظام المناعة ، والتناقضات بين الأنواع الجينية وجينية في المكروية. هنا ، ونحن يبرهن على وجود طريقة جديدة باستخدام العينات الجراحية للدبقي ورم خبيث وكتل لتقييم آثار undissociated العلاج. للتحقق من صحة هذه الطريقة ، يتم وصف البيانات مع وكيل أول السطر الحالي العلاج الكيميائي ، temozolomide (TMZ).
استخدمنا عينة طازجة إزالة الجراحية للدبقي الخبيثة لتجاربنا. أجرينا حقن intratumoral من المرشحين TMZ أو المخدرات الأخرى ، تليها الحضانة والتحليل على عينات الجراحية. هنا ، سعينا إلى إقامة نسيج الورم يزدرع الأسلوب كمنصة لتحديد فعالية العلاجات المضادة للسرطان الرواية بحيث أننا قد تكون قادرة على التغلب عليها ، على الأقل ، بعض القيود الحالية وملء الفجوة القائمة بين التجريبية الحالية البيانات وفعالية على الورم الفعلية للمريض. هذا الأسلوب قد لديها القدرة على تسريع تحديد عوامل العلاج الكيميائي لمعالجة سرطان رواية الصلبة.
Protocol
1. إعداد وسائل الاعلام
- وقد أعدت وسائل الإعلام باستخدام 10 ٪ FBS (16140-071 -- GIBCO) في DMEM/F-12 (1X) ، السائل 1:1 (10565-042 -- Invitrogen) مع 0.6 ٪ حل آجار منقى ، حبيبات (1.01614.1000 - EMD ). وبقيت ظروف معقمة في كافة مراحل التجربة.
- لإعداد وسائل الاعلام من 5mL FBS (16140-071 -- GIBCO) تم إضافتها إلى 45mL من DMEM/F-12 (1X) ، السائل 1:1 (10565-042 -- Invitrogen) مما يجعل الحجم النهائي لل50mL. تم الإبقاء على وسائل الإعلام على استعداد في حمام الماء عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
- وقد أعد الحل آغار طريقة استخدام الحرارة الميكروويف. تم حله 0.3 غرام في 50mL آغار حبيبات الماء المقطر باستخدام الميكروويف. كان الحل آغار تبرد إلى 37 درجة مئوية درجة الحرارة عن طريق الحفاظ عليه في حمام مائي.
- استخدمنا حجم مساو من وسائل الإعلام من الخطوة 1.2 و 1.3 و أعد حل الأسهم. كانت نسبة 0.6 ٪ من أجار (0.5mL) و 10 ٪ FBS-D-MEM/F-12 سائل الإعلام (0.5mL) 01:01 ، مما يجعل مجموع حجم 1 مل في كل بئر من 6 لوحات جيدا.
2. معالجة الأنسجة
- وقد وردت ورم أرومي دبقي الأشكال (GBM) الأنسجة فورا بعد الجراحة من قسم علم الأمراض. وقد صنفت الأنسجة والخليج للحاسبات الآلية من قسم علم الأمراض.
- تم نقل الأنسجة لباتري لوحة باستخدام الملقط بعناية وغسلها 1XPBS 5mL الجليد الباردة لمدة 3 مرات.
- وقطعت أجزاء التسلسلي للعينات من عينات تشريح لإنشاء كتل الورم (تقريبا 10 مليمتر في القطر) بشفرة الجراحية (الريشة - 2976 # 10) وforcep (فيشر العلمية).
- تم نقل كتل في لوحة 6 جيدا. كل 1mL جيدا والتي تحتوي على وسائل الإعلام ذكر في الخطوة 1.4. وكان النسيج التعرض للهواء بما فيه الكفاية للحفاظ على النسيج قابلة للحياة.
- ثم تم حقن الورم إما مع كتل DMSO (5 ٪) أو زد (2.5 نانومتر) وحضنت لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في الهواء مرطب يحتوي على 5 ٪ CO2. تم حقن 0.1mL من DMSO (5 ٪) أو زد 3 مرات في كتل الأورام في أماكن مختلفة للعلاج متسقة. تم حقن الدواء باستخدام الحقنة 1mL الأنسولين 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (الراحة 26027 نقطة).
- بعد 16 ساعة تم غسلها مع كتل 5 1XPBS مل لمدة 3 مرات. بعد غسل كتل كانت ثابتة مع 10ML 10 ٪ V / V الفورمالين لمدة 24 ساعة (Ricca الشركة الكيميائية) في أنابيب مل 50 (BASIX - 5539802) ، والمجهزة للالبارافين 4μm جزءا لا يتجزأ من المقاطع.
- وضعت المقطع الفورمالين ثابتة في الدورق على لوحة مع تحريك "لا حرارة" ، ومعالجتها من خلال الحلول التالية لمدة 30 دقيقة في كل حل. 30 ٪ من الإيثانول ، والايثانول 50 ٪ ، 75 ٪ من الإيثانول ، والايثانول 80 ٪ ، 95 ٪ من الإيثانول ، والإيثانول بنسبة 100 ٪ ، والزايلين.
- وقد نشف النسيج على مناشف ورقية وضعت في البارافين ذاب (58 إلى 60 درجة مئوية والبارافين Paraplast فيشر) لمدة 30 دقيقة.
- وكان جزءا لا يتجزأ من النسيج في قوالب باستخدام Surgipath البارافين الشريط الأزرق ، جزءا لا يتجزأ من نسيج تبريده إلى درجة حرارة الغرفة.
- وقد اتخذت جزءا لا يتجزأ من البارافين أقسام الأنسجة 4μm ووضعها على الشرائح بلس فيشر.
3. المناعية
تم تنفيذ المناعية كما هو موضح سابقا. 1
- Deparaffinization ومكان الإماهة الشرائح في رفوف وتنفيذ الخطوات التالية. الزيلين ل3x5 دقيقة (3 مرات لمدة 5 دقائق) ، والإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 3x5 ، والإيثانول 95 ٪ لمدة 1x5 ، والإيثانول 70 ٪ لمدة 1x5 ، شطف في ادارة مياه الصنبور لمدة 3 دقائق.
- استرجاع المستضد مع الشرائح بفعل الحرارة حاتمة تزج في استرجاع العازلة سيترات 1X (الحرارية العلمي AP9003 - 500) المخفف في الماء المقطر في الكأس الزجاجي. يغلي لمدة 15 دقيقة على طبق ساخن (تأكد من المقاطع ارتداء "ر تسقط الشريحة). برد حل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اشطف الشرائح مع 1X PBS ل3x5 دقيقة.
- تثبيط بيروكسيد الداخلية تزج الشرائح في الميثانول (فيشر العلمية - A - 452 - 4) مع بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 0.3 ٪ (فيشر العلمية - BP2633 - 500 - المخفف في الماء المقطر) في كوب من الزجاج لمدة 15 دقيقة. شطف في برنامج تلفزيوني عن 1X 3x5 دقيقة.
- حظر غطاء من الأنسجة مع 10 ٪ مصل الماعز العادية. نقل الشرائح في مربع الرطبة واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تغسل الشرائح مع 1X PBS ل3x5 دقيقة.
- وحضنت الأقسام الضد الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية بتركيزات التالية : 3 كاسباس محددة الإنسان (1:1،000 ، R & D أنظمة ، AF835) ، Ki67 (1:1 ، داكو ، 15626) المخفف مع 1X PBS. شطف الشرائح في برنامج تلفزيوني 1X 3x10 دقيقة في اليوم التالي.
- الثانوية تفاعل الأجسام المضادة مع غطاء للأنسجة 2-3 قطرات من الأجسام المضادة المسماة HRP الثانوي (تصور الأنظمة). وضع الشرائح في مربع الرطبة واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يغسل مع برنامج تلفزيوني عن 1X 3x10 دقيقة.
- الكشف عن وضع عدة DAB مولد اللون (ناقلات المختبرات - SK - 4100) للكشف عن الأجسام المضادة الأولية التالية بروتوكول الشركة المصنعة.
- تلطيخ مكافحة تزج الشرائح مع الهيماتوكسيلين (10-15 ق econds ، تأكد من ارتداء "ر تجاوز إشارة DAB). شطف مع ادارة مياه الصنبور لمدة 3 دقائق.
- تزج الجفاف الشرائح في الترتيب التالي ، والإيثانول 70 ٪ لمدة 5 دقائق ، والإيثانول 95 ٪ لمدة 5 دقائق ، والإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 3x5 ، 3x5 الزيلين لدقائق.
- زلة تغطية الشرائح مع permount كاشف تركيب (فيشر العلمية - SP - 15 - 100).
- أخذت الصور باستخدام المجهر مضان أوليمبوس (DP - 72).3.11). في جميع التجارب ، وأكد وضع العلامات المحددة التي تحكم سلبي دون الضد الابتدائي.
4. ممثل النتائج :
جمعنا عينات الجراحية للورم أرومي دبقي الأشكال (GBM). وخضع المرضى لأول عملية جراحية من دون الكيميائي قبل بما في ذلك temozolomide (TMZ). أظهرت صورة T1 المرجحة من التصوير بالرنين المغناطيسي مع تعزيز الجادولينيوم في الشكل - 1A ورم المعززة في الفص الجبهي الأيمن قبل الجراحة. وأكد صورة بعد العملية الجراحية (الشكل - 1B) المجموع الفرعي إزالة الآفة بعد الجراحة. أرسلت الأنسجة جراحية لقسم علم الأمراض لغرض التشخيص السريري ، وتمت معالجة العينات المتبقية لشراء الأنسجة تحت وافق مجلس المراجعة المؤسساتي (IRB) البروتوكول في ولاية أوهايو المركز الطبي لجامعة. وأظهرت الهيماتوكسيلين يوزين (H & E) تلطيخ وجود نخر ، وخلايا pseudopallisading والاوعية الدموية الدقيقة الانتشار (الشكل 1 ج). وبالتالي ، تم تشخيص هذه الأورام وhistopathologically GBM. من المذكرة ، حافظت explants الورم التالية الحضانة دون TMZ تصل إلى 48 ساعة في التهندس الخلوي من الخليج للحاسبات الآلية ، وفي المقابل ، مع الحضانة لمدة 72 ساعة أو أكثر ، لاحظنا زيادة عدد النوى مكثف في العينات ، مما يشير إلى بعض الخلايا السرطانية بدأت الخضوع لموت الخلايا المبرمج. نتيجة لذلك ، أنسجة الورم التالية الواردة يعد حضانة المناطق العشوائية التي فقدت الخلايا السرطانية ، والتي لوحظت بشكل تفضيلي في وحول مناطق نخرية (لا تظهر البيانات).
نحن اختبار من أجل التحقيق إذا موثوق هذه العينات يزدرع الورم ستستخدم لغرض اختبار نجاعة الأدوية ، وتأثير العلاج TMZ. الرقم 2 يمثل تدفق التجارب في هذه الدراسة. وأشارت دراسة حديثة أن حقن intratumoral من TMZ له تأثير أكثر فعالية في مجال مكافحة نمو دبقي الخبيثة من أن الإدارة الشاملة لهذا الدواء 2. بعد حضانة لمدة 16 ساعة ، وكانت جزءا لا يتجزأ من هذه explants مع البارافين وأعدت المقاطع التسلسلي للتلوين. تظاهر المناعية للأنسجة GBM TMZ المعالجة إجراء تخفيض كبير في الخلايا السرطانية كي - 67 - إيجابية مقارنة مع عينات السيطرة. في المقابل ، لم المناعية مع علامة موت الخلايا المبرمج ، كاسباس 3 ، لم تسفر عن أي اختلاف كبير بين عينات دبقي TMZ المعالجة ومراقبة العينات (الشكل 3).
وتميزت كذلك تأثير العلاج مع TMZ عن طريق الجمع بين هذا الاختبار مع يزدرع سواء في الثقافة أو المختبر التدفق الخلوي. على وجه التحديد ، سعينا إلى تحديد تأثير على خلايا تشبه الخلايا الجذعية السرطانية (SCLTC). لذا ، وبعد العلاج مع intratumoral TMZ ، أجرينا فحص مجال التشكيل والتدفق الخلوي لهذه explants الورم. وكانت العينات TMZ المعاملة نأت إلى خلايا فردية واحدة وكانت هذه الخلايا المصنف واحد في كثافة منخفضة (1 في الخلية ميكروليتر أو أقل) في لوحات 96 - جيدا في المصل خالية المتوسطة وتستكمل مع bFGF EGF. في السيطرة على المجموعة ، لوحظ تشكيل الورم من المجالات explants الورم بعد حضانة لمدة 7 أيام. نظرا إلى أن تشكيل المجال هو خاصية من SCLTC 3 4 ، وتعديلات في عدد من المجالات الورم قبل العلاج من تعاطي المخدرات يشير إلى التأثير على SCLTC. وبالمثل ، لم يتم القيام التدفق الخلوي من ورم explants فصلها مع خلية علامة السطح ، CD133 ، للتحقق من تأثير على SCLTC. إذا تم القضاء على SCLTC انتقائي في الخلايا السرطانية غير متجانسة في الخليج للحاسبات الآلية عن طريق العلاج من تعاطي المخدرات ، يمكن للمرء أن يتنبأ بأن التدفق الخلوي ينبغي أن يكشف عن انخفاض في نسبة CD133 إيجابية من العلاج (لا تظهر البيانات).
Figure.1 صور الرنين المغناطيسي (MRI) من الخليج للحاسبات الآلية المريض. شخصيات ممثل عملية ما قبل الشكل ، وآخر عملية 1A - 1B - الشكل. الرقم - 1C هو H & E تلطيخ العذبة GBM عينة الأنسجة. التكبير الأصلي ، 40X.
الرقم. 2 تدفق التجريبي لتجربة الثقافة كتلة الشكل - 2A. تلقى صورة GBM جراحية جديدة من قسم علم الأمراض. الرقم - 2B يظهر تشريح كتلة الورم إلى أجزاء صغيرة مع 10MM مساعدة شفرة جراحية. الرقم - 2C هو الدواء (TMZ) معاملة كتل الورم باستخدام حقنة الانسولين.
ه 3 "/>
الرقم. 3 المناعية. المناعية من كتل الأنسجة GBM حقنوا DMSO أو TMZ مع 3 - Caspase المنشط وKi67. كان يستخدم لتلوين الهيماتوكسيلين النووية. التكبير الأصلي ، 40X.
Discussion
هناك فجوة بين نجاعة الأدوية في نماذج ما قبل السريرية التجريبية الحالية وفعالية في المرضى. بشكل أكثر تحديدا ، في مجال البحوث السرطانية في الدماغ ، هناك حاجة أساليب جديدة وموثوق بها من شأنها أن تساعد سد الفجوة القائمة بين التقييم والمخدرات مع الطرق الحالية وفعالية في المرضى. المقايسة الموصوفة في هذه الدراسة هو ميزة إضافية ، إن لم يكن حلا ، لتسهيل ملء التناقض في البيانات التجريبية ونتائج المرضى المتضررين.
في ثقافات الخلية المختبر توسيع تفضيلي بعض أنواع الخلايا السرطانية بغض النظر عن الظروف والثقافة ، وتمثل سوى subpopulation الورم بأكمله. 5 وبالإضافة إلى ذلك ، والتحول الجيني والمظهري للتوسع الخلية الاصطناعية ويحدث أمر لا مفر منه مع ثقافات الخلية على المدى الطويل . واحدة من العقبات الرئيسية لعلاج دبقي الخبيثة هو عدم التجانس من الخلايا السرطانية ، سواء داخل الورم واحد وبين عينات الورم 6 ، 7. لذلك ، تخصيب انتقائية لبعض السكان من الخلايا السرطانية ، وبغض النظر عن نوع واحد أو لآخر ، قد لا تكون وسيلة مناسبة لتحديد فعالية العلاج الكيميائي وكلاء أي على خلايا الورم غير المتجانسة. 8 9 فأي نموذج حيواني من أورام المخ مستمدة من subpopulation من تسليط الأضواء على الخلايا السرطانية على نجاعة الأدوية subpopulation ، ولكن ليس الورم بأكمله.
العديد من القيود ، من ناحية أخرى ، لا تزال هذه الطريقة في يزدرع الورم. واحد مثل هذا التقييد هو فترة قصيرة نسبيا من العلاج. منذ تعتبر خلايا الورم الخبيث لاكتساب المقاومة لمعظم ، إن لم يكن كلها ، والعلاجات مع مرور الوقت ، قد لا تستطيع السيطرة الأولي للنمو على المدى القصير الخلية السرطانية التي تنعكس على المريض التشخيص على المدى الطويل ، كما ذكرت مؤخرا مع مكافحة وكيل عائية ، 10 بيفاسيزوماب. وبالتالي ، يتعين تحسين بروتوكول لهذا الاختبار ازدراع للحفاظ على الأنسجة لفترة أطول مع مزيد من التحقيقات. سؤال آخر هو الأثر المحدد للدواء اختباره على SCLTC في الورم. بالنظر إلى أن SCLTC مقاومة نسبيا للالعلاجات الحالية لدبقي الخبيثة ، وتحديد من الأدوية المضادة للسرطان أكثر قدرة القضاء على الرواية التي لها ما يبررها SCLTC. في هذا الصدد ، ونحن نسعى حاليا إلى الجمع بين هذا الاختبار يزدرع مع اللاحقة في التجارب المختبرية ، مثل مقايسة تشكيل neurosphere (لا تظهر البيانات). نتوقع لمعرفة المزيد عن آثار ، إن وجدت ، لمرشح على المخدرات من خلال هذه المقايسات SCLTC مجتمعة. أخيرا ، قد تستخدم كتل صغيرة من عينات الورم لا تعكس خلية الورم بأكمله السكان ، كما هو الحال مع خطوط الخلايا السرطانية أو الثقافات التقليدية الأولية من عينات جراحية. هذه القضايا جانبا ، والحفاظ على سدى الورم ، بما في ذلك مكانة الأوعية الدموية ، ومفيد في تشخيص العوامل البيئية لخلايا الورم. لذا ، قد يكون هذا الفحص لديها القدرة على تقييم أي استراتيجيات علاجية تحت شرط أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية.
هنا أنشأنا مقايسة لاختبار نجاعة الدواء مع explants العينات الجراحية في الخليج للحاسبات الآلية. في الواقع ، مع العينات الجراحية اختبار ، وجدنا أن الحقن المباشر للTMZ يقلل من انتشار الأسلحة النووية في عينات الخليج للحاسبات الآلية. هذا الأسلوب ينطبق يزدرع الأنسجة نظريا السرطانات الصلبة الأخرى ، ويوفر الأصول لتحديد فعالية الدواء في ورم المريض ، الأمر الذي سيساعد على أمل تفادي فشل آخر لنا في التجارب السريرية لأمراض السرطان.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الجمعية الأميركية للسرطان (MRSG - 08 - 108 - 01) ، فنسنت J. Sgro / استئصال ورم من الدماغ والرابطة الأمريكية ، ومؤسسة الأسرة خان ناكانو أنا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat-Inactivated | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | |
| D-MEM/F-12 (1X) Liquid 1:1 | Invitrogen | 10565-042 | |
| Agar-Agar Purified, Granulated | EMD Millipore | 1.01614.1000 | |
| DPBS for staining | Invitrogen | 14190 | |
| Hematoxyllin | Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| 10% w/v formalin Caspase-3 | Ricca Chemical Company | 3810 | |
| Caspase-3 | R&D Systems | AF835 | |
| Ki67 | Dako | 15626 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Envision system- anti-mouse | Dako | 2012-07 | |
| Envision system- anti-rabbit | Dako | 2011-12 | |
| DAB-kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Table 1. Materials. | |||
| 6 Well Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Petri dish | VWR international | 25384-302 | |
| Serological pipette | Axygen Scientific | ||
| Filter tips | USA Scientific, Inc. | ||
| 500 μm polyester mesh Netwell insert | Costar | 3480 | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 354230 | |
| BD 10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Hypodermic needle Aluminum Hub. | Tyco Healthcare, Covidien | 2000029 | |
| Tissue culture flask | Corning | ||
| Centrifuge tubes | Basix | 5539800 | |
| Thin wall tubes | Eton | 1107A | |
| Surgical Blade stainless steel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976#10 | |
| Insulin Syringe | Comfort point | 26027 | |
| 50mL flat top screw cap tube | Basix | 5539802 | |
| Dissection microscope | Tritech Research, Inc. | ||
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | DP-72 | |
| Forcep | Fisher Scientific | ||
| Table 2. Equipment. | |||
References
- Hemmati, H. D. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).
- Heimberger, A. B. Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats. Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).
- Nakano, I. Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells. J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).
- Laks, D. R. Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Phillips, H. S. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).
- He, J. Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation. J Proteome Res. , (2010).
- Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines]. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).
- Vik-Mo, E. O. Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions. Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).
- Hovinga, K. E. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- de Groot, J. F. Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice. Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).
