Summary
Qui, abbiamo stabilito un metodo per verificare l'efficacia della droga con campioni chirurgici di tumori al cervello, chiamata "metodo dell'espianto del tumore". Con questo metodo, siamo in grado di valutare l'efficacia del farmaco senza rompere il microambiente dei tumori solidi. Per convalidare l'affidabilità di questo metodo, si descrivono i dati rappresentativi con i nostri campioni di glioma trattati con l'attuale prima linea agente chemioterapico, temozolomide.
Abstract
Le terapie attuali per glioma maligno hanno solo effetto palliativo. Per lo sviluppo terapeutico, un ostacolo è la discrepanza di efficacia determinate con prove correnti dell'efficacia dei farmaci e l'efficacia sui pazienti. Così, nuovi metodi e affidabile per valutare l'efficacia dei farmaci sono garantiti in fase pre-clinica. Coltura in vitro di tessuti tumorali, tra cui le linee cellulari, ha notevoli alterazioni fenotipiche, genetiche ed epigenetiche delle cellule di cancro causata da ambiente artificiale delle colture cellulari, che potrebbero non corrispondere la biologia dei tumori in situ originale. Modelli di xenotrapianto con i topi immunodeficienti inoltre hanno dei limiti, cioè, la mancanza del sistema immunitario e interspecie discrepanze genetiche ed epigenetiche nel microambiente. Qui, dimostrare un nuovo metodo utilizzando i campioni chirurgici di glioma maligno come blocchi del tumore non dissociato per valutare gli effetti del trattamento. Per convalidare questo metodo, i dati con l'attuale prima linea agente chemioterapico, temozolomide (TMZ), sono descritti.
Abbiamo usato il fresco campione chirurgico di rimozione glioma maligno per i nostri esperimenti. Abbiamo eseguito l'iniezione intratumorale di TMZ o candidati di altre droghe, seguita da incubazione e analisi su campioni chirurgici. Qui, abbiamo cercato di stabilire un tumore metodo espianto di tessuto come una piattaforma per determinare l'efficacia di nuovi agenti anti-cancro della terapia allo scopo che noi possiamo essere in grado di superare, almeno, alcuni dei limiti attuali e colmare il divario esistente tra la sperimentazione current dati e l'efficacia sul tumore di un paziente effettivo. Questo metodo può avere il potenziale per accelerare identificare nuovi agenti chemioterapici per la cura dei tumori solidi.
Protocol
1. Preparazione dei terreni
- Il supporto è stato preparato utilizzando il 10% FBS (16140-071 - GIBCO) in DMEM/F-12 (1X), liquido 1:1 (10565-042 - Invitrogen) con la soluzione Agar 0,6% depurata, granulato (1.01614.1000-EMD ). Condizioni sterili sono stati mantenuti tutto l'esperimento.
- Per la preparazione di 5 ml media di FBS (16140-071 - GIBCO) è stato aggiunto a 45ml di DMEM/F-12 (1X), liquido 1:1 (10565-042 - Invitrogen) rendendo volume finale di 50 mL. I media preparato è stato tenuto a bagnomaria a 37 ° C di temperatura.
- La soluzione di agar è stato redatto utilizzando il metodo di calore a microonde. 0,3 grammi di agar granulato è stato dissolto in 50mL di acqua distillata usando microonde. La soluzione è stata raffreddare agar a 37 ° C di temperatura, mantenendo in bagno d'acqua.
- Abbiamo usato uguale volume di mezzi di comunicazione a partire dal punto 1.2 e 1.3 e la soluzione madre preparata. Il rapporto del 0,6% agar (0,5 ml) e 10% FBS-D-MEM/F-12 media (0,5 ml) è stato 1:1, rendendo il volume totale di 1 ml in ciascun pozzetto di 6 piastre.
2. Lavorazione dei tessuti
- Glioblastoma Multiforme (GBM) tessuti sono stati ricevuti immediatamente dopo l'intervento del Dipartimento di Patologia. Il tessuto è stato classificato come GBM dal Dipartimento di Patologia.
- Il tessuto è stato trasferito al patri-plate con pinze con cura e lavati con ghiacciata 1XPBS 5 ml per 3 volte.
- Sezioni seriali dei campioni sono stati tagliati dai campioni sezionato per creare blocchi di tumore (circa 10 mm di diametro) con una lama chirurgica (Feather-2976 # 10) e pinza (Fisher Scientific).
- I blocchi sono stati trasferiti in un piatto ben 6. Ogni pozzo è stato contenente 1 ml di media menzione al punto 1.4. Il tessuto era abbastanza esposizione all'aria per mantenere i tessuti vitali.
- Sezioni tumorali sono state iniettate sia con DMSO (5%) o TMZ (2,5 nM) e incubate per 16 ore a 37 ° C in aria umidificata contenente il 5% di CO2. 0,1 ml di DMSO (5%) o TMZ è stato iniettato 3 volte in blocchi di tumore in diversi luoghi per il trattamento coerente. Il farmaco è stato iniettato con siringa per insulina da 1 ml 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Comfort punto-26027).
- Dopo 16 ore i blocchi sono stati lavati con 5 1XPBS ml per 3 volte. Dopo aver lavato i blocchi sono stati fissati con 10 ml di 10% v / v formalina per 24 ore (Ricca azienda chimica) in 50 mL (Basix-5539802) e trattati per paraffina 4 _m sezioni.
- La sezione formalina fisso è stato posto in coppa sul piatto mescolate con "NO HEAT" ed elaborate attraverso le seguenti soluzioni per 30 minuti in ogni soluzione. 30% etanolo, 50% etanolo, 75% etanolo, 80% etanolo, 95% etanolo, 100% etanolo e xilene.
- Il tessuto è stato cancellato su carta assorbente e posto in paraffina fusa (58 a 60 ° C, Fisher paraffina Paraplast) per 30 minuti.
- Il tessuto è stato incorporato in stampi usando Surgipath paraffina Blue Ribbon, il tessuto incapsulato è stato raffreddato a temperatura ambiente.
- Paraffina sezioni di tessuto incluso 4 _m sono stati prelevati e posti su Fisher diapositive Plus.
3. Immunoistochimica
L'immunoistochimica è stata effettuata come descritto in precedenza 1.
- Deparaffinizzazione e Place reidratazione i vetrini in un rack ed eseguire i seguenti passaggi. Xilene per 3x5 minuti (3 volte per 5 minuti), 100% di etanolo per i minuti 3x5, etanolo al 95% per i minuti 1x5, etanolo al 70% per i minuti 1x5, sciacquare in acqua corrente per 3 minuti.
- Recupero dell'antigene con calore indotto epitopo recupero Immergere i vetrini in tampone citrato 1X (Thermo scientifico-AP9003-500) diluita in acqua distillata in un bicchiere di vetro. Fate bollire per 15 minuti su una piastra riscaldante (assicurarsi sezioni don "t cadere la diapositiva). Raffreddare la soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare i vetrini con PBS 1X per 3x5 minuti.
- L'inibizione di perossido interno Immergere i vetrini in metanolo (Fisher Scientific-A-452-4) con perossido di idrogeno 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-diluito in acqua distillata) in un bicchiere di vetro per 15 minuti. Sciacquare in PBS 1X per 3x5 minuti.
- Blocco Coprire i tessuti con il 10% di siero normale di capra. Trasferire i vetrini in una scatola umida per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare i vetrini con PBS 1X per 3x5 minuti.
- Sezioni anticorpo primario sono state incubate overnight a 4 ° C con l'anticorpo primario a concentrazioni seguenti: umane specifiche caspasi-3 (1:1000, sistemi di R & S, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) diluito con PBS 1X. Sciacquare i vetrini in PBS 1X minuti 3x10 il giorno successivo.
- Reazione anticorpo secondario Coprire i tessuti con 2-3 gocce di anticorpo secondario marcato con HRP (immaginare sistemi). Mettere le diapositive di una scatola umida per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare con PBS 1X per 3x10 minuti.
- Sviluppare il rilevamento per il cromogeno DAB kit (Vector laboratori-SK-4100) per l'individuazione di anticorpi primario in seguito al protocollo del produttore.
- Colorazione contatore Immergere i vetrini con ematossilina (10-15 s econdi, assicurarsi don "t superamento del segnale DAB). Risciacquare con acqua corrente per 3 minuti.
- Immergere disidratazione le diapositive nel seguente ordine, etanolo al 70% per 5 minuti, etanolo al 95% per 5 minuti, 100% di etanolo per i minuti 3x5, xilene per 3x5 minuti.
- Coprire scivolare i vetrini con permount reagente di montaggio (Fisher Scientific-SP-15-100).
- Le immagini sono state scattate con microscopio a fluorescenza Olympus (DP-72) .3.11). In tutti gli esperimenti, specifiche di etichettatura è stata confermata dal controllo negativo senza anticorpo primario.
4. Rappresentante dei risultati:
Abbiamo raccolto campioni chirurgici di glioblastoma multiforme (GBM). I pazienti sono stati sottoposti il primo intervento senza precedenti chemioterapie compresi temozolomide (TMZ). Il T1 pesate immagine di risonanza magnetica con gadolinio miglioramento nella figura-1a ha dimostrato un tumore rafforzata nel lobo frontale destro prima dell'intervento chirurgico. L'immagine postoperatoria (figura 1b) ha confermato la rimozione subtotale della lesione dopo l'intervento. I tessuti chirurgici sono stati inviati al Dipartimento di Patologia a scopo diagnosi clinica, e gli esemplari rimasti sono stati elaborati per il prelievo del tessuto sotto il Consiglio ha approvato Institutional Review (IRB) protocollo presso la Ohio State University Medical Center. Ematossilina ed eosina (H & E) colorazione dimostrato la presenza di necrosi, le cellule pseudopallisading, e la proliferazione microvascolare (Figura 1-c). Così, questi tumori sono stati diagnosticati come istopatologicamente GBM. Di nota, gli espianti tumorali dopo l'incubazione senza TMZ fino a 48 ore mantenuto la citoarchitettura di GBM. Al contrario, con incubazione per 72 ore o più, abbiamo notato l'aumento del numero di nuclei condensato nei campioni, suggerendo alcune delle cellule tumorali iniziano a apoptosi. Come risultato, i tessuti tumorali dopo incubazione più contenute le regioni macchia di leopardo che ha perso le cellule tumorali, che sono stati osservati e preferenzialmente in prossimità delle aree necrotiche (dati non riportati).
Al fine di indagare se questi campioni espianto tumore può attendibilmente essere utilizzati a scopo di test di droga efficacia, abbiamo testato l'effetto del trattamento TMZ. Figura-2 rappresenta il flusso degli esperimenti in questo studio. Uno studio recente ha indicato che l'iniezione intratumorale di TMZ ha un effetto più potente sul controllo della crescita del glioma maligno di quella della somministrazione sistemica di questo farmaco 2. Dopo l'incubazione per 16 ore, questi espianti sono stati integrati con paraffina e le sezioni di serie sono state preparate per la colorazione. Immunoistochimica di TMZ trattati con tessuti GBM dimostrato una riduzione sostanziale di Ki-67-positive cellule tumorali rispetto ai campioni di controllo. A sua volta, immunoistochimica con un marker apoptosi, caspasi-3, non ha dato alcuna differenza significativa tra i campioni trattati con TMZ glioma e campioni di controllo (figura-3).
Effetti del trattamento con TMZ è stata ulteriormente caratterizzata dalla combinazione di questo saggio espianto insieme sia in coltura in vitro o di citometria a flusso. In particolare, abbiamo cercato di determinare l'effetto sulla cellule staminali come le cellule tumorali (SCLTC). Pertanto, a seguito del trattamento intratumorale con TMZ, abbiamo effettuato test sfera formazione e citometria a flusso di questi espianti tumorali. Il TMZ campioni sono stati trattati con dissociate in singole celle singole e le singole cellule sono state seminate a bassa densità (1 cellule per microlitro o inferiore) in piastre da 96 pozzetti in mezzo privo di siero integrato con bFGF e FEG. Nel gruppo di controllo, la formazione di sfere tumore dal espianti tumore è stata osservata dopo 7 giorni di incubazione. Dato che la formazione sfera è una proprietà di SCLTC 3 4, alterazioni nel numero di sfere del tumore da un trattamento farmacologico indica l'effetto sulla SCLTC. Allo stesso modo, citometria a flusso degli espianti tumore dissociato con un pennarello superficie cellulare, CD133, è stato effettuato per verificare l'effetto sulla SCLTC. Se SCLTC nelle cellule tumorali eterogenei in GBM sono selettivamente sradicato da un trattamento farmacologico, si potrebbe prevedere che la citometria a flusso dovrebbe rilevare diminuzione della CD133-positivi frazione di trattamento (dati non riportati).
Figure.1 immagini di risonanza magnetica (MRI) di un paziente GBM. Personaggi rappresentante di pre-operazione Figura-1a e post-operazione Figura-1b. Figura 1c è colorazione H & E di nuovo campione del tessuto GBM. Ingrandimento originale, 40X.
Figura. 2 Il flusso sperimentale dell'esperimento blocco della cultura. Figura-2a. Immagine di fresco GBM chirurgico ricevuto dal dipartimento di patologia. Figura 2b mostra Dissezione del blocco del tumore in 10 millimetri piccoli pezzi con la lama aiuto chirurgico. Figura-2c è la (TMZ) il trattamento farmacologico di sezioni tumorali con siringa da insulina.
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Figura. 3 Immunoistochimica. Immunoistochimica di blocchi di tessuto GBM iniettato con DMSO o TMZ con attivato Caspasi-3 e Ki67. Ematossilina è stato utilizzato per la colorazione nucleare. Ingrandimento originale, 40X.
Discussion
C'è un divario tra l'efficacia della droga nelle attuali modelli sperimentali pre-clinici e l'efficacia nei pazienti. Più in particolare, nel campo della ricerca tumore cerebrale, nuovi metodi e affidabili, sono necessari aiuterebbe colmare il divario esistente tra la valutazione della droga con i metodi attuali e l'efficacia nei pazienti. Il dosaggio descritti in questo studio è un ulteriore vantaggio, se non una soluzione, per facilitare il riempimento della discrepanza dei dati sperimentali e l'esito dei pazienti affetti.
Colture cellulari in vitro preferenzialmente espandere alcuni tipi di cellule tumorali indipendentemente dalle condizioni di coltura, e rappresentano solo una sottopopolazione di l'intero tumore. 5 Inoltre, la trasformazione genetica e fenotipica della cellula artificiale espansione si verifica ed è inevitabile, con il lungo termine colture cellulari . Uno degli ostacoli principali per il trattamento di glioma maligno è l'eterogeneità delle cellule tumorali, sia all'interno di un singolo tumore e tra i campioni tumorali 6, 7. Pertanto, l'arricchimento selettivo di una certa popolazione di cellule tumorali, a prescindere di un tipo o un altro, non può essere un mezzo appropriato per determinare l'efficacia di eventuali agenti chemioterapici sulle cellule tumorali eterogenei. 8 9 Tutti i modelli animali di tumori al cervello derivato da una sottopopolazione di cellule tumorali capannone luci efficacia del farmaco su una sottopopolazione, ma non l'intero tumore.
Diverse limitazioni, d'altra parte, restano ancora in questo metodo dell'espianto tumore. Una tale limitazione è il periodo relativamente breve di trattamento. Dal momento che le cellule tumorali maligne sono considerati di acquisire resistenza alla maggior parte, se non tutte, le terapie nel tempo, controllo iniziale di breve termine la crescita delle cellule del tumore non può essere riflessa dalla prognosi a lungo termine dei pazienti, come è stato recentemente segnalato con un anti- antiangiogenico, bevacizumab 10. Così, il miglioramento del protocollo per questo dosaggio espianto di conservare i tessuti per un periodo più lungo è richiesto con ulteriori indagini. Un'altra questione è uno specifico effetto di un farmaco testato su SCLTC nel tumore. Dato che SCLTC sono relativamente resistenti alle terapie correnti per glioma maligno, identificazione di nuovi farmaci anti-cancro che potentemente sradicare SCLTC è garantito. A questo proposito, che attualmente cerca di combinare questo test con la conseguente espianto in esperimenti in vitro, come neurosfere test di formatura (dati non riportati). Ci aspettiamo di saperne di più circa gli effetti, se del caso, di un candidato farmaco su SCLTC attraverso questi test combinato. Infine, con piccoli blocchi di campioni tumorali potrebbero non riflettere l'intera popolazione delle cellule tumorali, come è il caso con le linee cellulari tumorali convenzionali o colture primarie da campioni chirurgici. Questi problemi a parte, conservando stroma del tumore, tra cui la nicchia vascolari, è utile per caratterizzare i fattori ambientali per le cellule tumorali. Pertanto, questo test potrebbe avere un potenziale per valutare eventuali strategie terapeutiche in una condizione più fisiologicamente rilevanti.
Qui, abbiamo istituito un test per testare l'efficacia dei farmaci con espianti di campioni chirurgici di GBM. Infatti, con i campioni testati chirurgico, abbiamo trovato che l'iniezione diretta di TMZ riduce la proliferazione nei campioni GBM. Questo metodo espianto tessuto è teoricamente applicabile ad altri tumori solidi e fornisce asset per determinare l'efficacia della droga sul tumore di un paziente, che si spera ci aiutano a evitare un altro fallimento negli studi clinici per i tumori.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
L'American Cancer Society (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro / L'American Association tumore al cervello, e la famiglia Khan Foundation per I Nakano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat-Inactivated | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | |
| D-MEM/F-12 (1X) Liquid 1:1 | Invitrogen | 10565-042 | |
| Agar-Agar Purified, Granulated | EMD Millipore | 1.01614.1000 | |
| DPBS for staining | Invitrogen | 14190 | |
| Hematoxyllin | Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| 10% w/v formalin Caspase-3 | Ricca Chemical Company | 3810 | |
| Caspase-3 | R&D Systems | AF835 | |
| Ki67 | Dako | 15626 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Envision system- anti-mouse | Dako | 2012-07 | |
| Envision system- anti-rabbit | Dako | 2011-12 | |
| DAB-kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Table 1. Materials. | |||
| 6 Well Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Petri dish | VWR international | 25384-302 | |
| Serological pipette | Axygen Scientific | ||
| Filter tips | USA Scientific, Inc. | ||
| 500 μm polyester mesh Netwell insert | Costar | 3480 | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 354230 | |
| BD 10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Hypodermic needle Aluminum Hub. | Tyco Healthcare, Covidien | 2000029 | |
| Tissue culture flask | Corning | ||
| Centrifuge tubes | Basix | 5539800 | |
| Thin wall tubes | Eton | 1107A | |
| Surgical Blade stainless steel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976#10 | |
| Insulin Syringe | Comfort point | 26027 | |
| 50mL flat top screw cap tube | Basix | 5539802 | |
| Dissection microscope | Tritech Research, Inc. | ||
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | DP-72 | |
| Forcep | Fisher Scientific | ||
| Table 2. Equipment. | |||
References
- Hemmati, H. D. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).
- Heimberger, A. B. Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats. Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).
- Nakano, I. Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells. J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).
- Laks, D. R. Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Phillips, H. S. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).
- He, J. Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation. J Proteome Res. , (2010).
- Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines]. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).
- Vik-Mo, E. O. Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions. Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).
- Hovinga, K. E. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- de Groot, J. F. Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice. Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).
