Summary
여기, 우리는 뇌 종양의 수술 표본, 칭했다 "종양 explant 방법"으로 약물 효능 검사를위한 방법을 만들었습니다. 이 방법을 통해, 우리는 고체 종양의 microenvironment을 위반하지 않고 약물 효능을 평가할 수 있습니다. 이 방법의 신뢰성을 검증하기 위해, 우리는 현재 첫 라인 chemotherapeutic 에이전트 temozolomide과 치료의 glioma의 표본과 함께 대표 데이터를 설명합니다.
Abstract
악성 glioma에 대한 현재의 치료법은 완화 효과가 있습니다. 치료 개발 들어, 하나의 장애물은 현재 약물 효능 검사와 환자에 대한 효능에 의해 결정 효능의 차이가 있습니다. 따라서, 약물 효능을 평가하기위한 소설과 신뢰할 수있는 방법은 미리 임상 단계에 보증하고 있습니다. 전지 라인을 포함하여 종양 조직,의 체외 문화에서 세포 배양의 인공 환경에 의한 암 세포의 실질적, phenotypic 유전 및 epigenetic 변경을 가지고있는 원위치에 원래 종양의 생물학을 반영하지 않을 수 있습니다. immunodeficient 생쥐와 이종 이식 모델은 즉, 면역 시스템의 부족을 제한하고 microenvironment의 유전 및 epigenetic 불일치를 interspecies. 여기, 우리는 치료 효과를 평가하는 undissociated 종양을 차단 등 악성 glioma의 수술 표본을 사용하여 새로운 방법을 보여줍니다. 이 방법의 유효성을 검사하려면, 현재 첫 라인 chemotherapeutic 에이전트 temozolomide (TMZ)와 데이터가 설명되어 있습니다.
우리는 우리의 실험에 대한 악성 glioma의 갓 제거 수술 표본을 사용. 우리는 수술 표본에 부화 및 분석 다음 TMZ 또는 다른 약물 후보의 intratumoral 주사를 수행했습니다. 여기, 우리는, 적어도 현재 제한의 일부를 극복하고 현재 실험 사이의 기존의 간격을 채울 수있을 수 있도록 소설 안티 - 암 요법의 효능을 결정하는 플랫폼으로 종양 조직 explant 방법을 확립하기 위해 노력해 데이터 및 실제 환자의 종양에 효능. 이 방법은 고체 암 치료를 위해 소설 chemotherapeutic 에이전트를 식별 촉진하는 잠재력을 가지고 있습니다.
Protocol
1. 미디어 준비
- 과립은 (1.01614.1000 - EMD, 0.6 %의 아가르 솔루션은 정화와 - DMEM/F-12에서 (1X), 액체 1시 1분 (Invitrogen 10565-042) - 미디어는 10% FBS을 (GIBCO 16140-071)을 사용하여 준비했습니다 ). 무균 조건은 실험을하는 동안 유지되었다.
- FBS의 미디어 5mL의 준비를 위해 (16140-071 - GIBCO) - 50mL의 최종 볼륨을 만드는 액체 1시 1분는 (Invitrogen 10565-042), DMEM/F-12 (1X)의 45mL에 추가되었습니다. 준비 미디어는 37 ° C의 온도에서 물을 욕조에 보관되었다.
- 한천 솔루션은 열 전자렌지 방법을 사용하여 준비되었습니다. 0.3 그램 과립 한천은 전자 레인지를 사용하여 50mL 증류수에 용해되었다. 한천 솔루션은 물 목욕으로 그것을 유지하여 37 ° C의 온도로 냉각되었다.
- 우리는 단계로 1.2와 1.3 준비 재고 솔루션에서 미디어의 동일한 음량을 사용합니다. 0.6 %의 한천 (0.5mL)와 10 %의 FBS-D-MEM/F-12 미디어 (0.5mL)의 비율은 6 잘 접시의 각 잘 1 ML의 전체 볼륨을 만드는 1시 1분했다.
2. 조직 처리
- Glioblastoma Multiforme (GBM) 조직은 즉시 병리학학과에서 수술 후 받았습니다. 조직은 병리학학과에서 GBM으로 분류되었다.
- 조직은 신중하게 집게를 사용하여 patri - 판에 전송 3 시간에 얼음처럼 차가운 5mL의 1XPBS로 세탁했다.
- 표본의 시리얼 부분은 수술 블레이드 (깃털 - 2976 # 10)과 forcep (피셔 과학)와 종양 블록 (직경 약 10mm)을 만들기 위해 해부를 샘플에서 절단되었다.
- 블록은 6 잘 접시에 양도했다. 미디어의 각 잘 포함되었다 1mL 단계 1.4에 대한 언급. 조직 조직은 가능한 유지하는 공기 충분한 노출을했다.
- 종양 블록은 다음 DMSO (5 %) 또는 TMZ (2.5 NM) 중 하나와 함께 주입 37 16 시간 동안 incubated되었습니다 ° C 5 % CO2를 포함 humidified 공기 인치 DMSO의 0.1mL (5 %) 또는 TMZ는 지속적인 치료를 위해 다른 장소에서 종양 블록 3 회 주입했다. 약물은 28G1 / 2 0.37X12.7mm 인슐린 주사기 1mL (컴포트 포인트 26,027)를 사용하여 주입했다.
- 16시간 후 블록이 3 회 5 ML 1XPBS로 세탁했다. 블록을 세탁 후 50 ML 튜브 24 시간 동안 V / V 포르말린 10 % (리카 화학 회사) (Basix - 5539802)의 10mL로 고정되었으며 4μm 섹션을 임베디드 파라핀에 대한 처리.
- 포르말린 고정 부분은 'NO 열 "로 저어 접시에 비커에 배치하고 각 솔루션에 30 분 동안 다음과 같은 솔루션을 통해 처리되었습니다. 30 % 에탄올, 50 % 에탄올, 75 % 에탄올, 80 % 에탄올, 95 % 에탄올, 100 % 에탄올, 그리고 크실렌.
- 조직은 종이 타올에 blotted 30 분 (58-60 ° C, 피셔 Paraplast의 파라핀) 용해 파라핀에 배치되었다.
- 조직 Surgipath 블루 리본 파라핀을 사용하여 금형에 박혀 있었어, 임베디드 조직은 상온으로 냉각되었다.
- 파라핀 임베디드 4μm 조직 섹션은 촬영과 피셔 플러스 슬라이드에 배치했다.
3. Immunohistochemistry
앞에서 설명한 것처럼 Immunohistochemistry이 수행되었다 1.
- Deparaffinization 및 rehydration 플레이스 랙에 슬라이드와 다음 단계를 수행합니다. 3x5 분 (5 분 3 회), 3x5 분 100 % 에탄올, 1x5 분 95 % 에탄올, 1x5 분 70 % 에탄올에 대한 크실렌은 3 분 동안 수돗물을 실행에 린스.
- 유리 비커에 증류수에 희석 1X 구연 산염 버퍼 (온습 과학 - AP9003 - 500)에 열을 유발 에피토프 검색 담가 슬라이드와 항원 검색. 뜨거운 접시 (확인 섹션 돈 'T는 슬라이드를 버린다고 벼르고)에서 15 분 동안 끓여. 상온에서 30 분 쿨 솔루션. 3x5 분 1X PBS로 슬라이드를 씻어.
- 내부 과산화수소의 억제는 15 분 동안 유리 비이커에 0.3 %의 과산화수소 (피셔는 증류수에 언티픽 BP2633 - 500 - 희석)와 메탄올의 슬라이드 (피셔 사이 언티픽 - 452 - 4) 몰두. 3x5 분 1X PBS로 씻어.
- 10% 정상 염소 혈청과 조직을 커버 차단. 습기 상자에 슬라이드를 전송하고 실온에서 1 시간 품어. 3x5 분 1X PBS로 슬라이드를 씻으십시오.
- 인간의 구체적인 Caspase - 3 (1:1,000, R & D 시스템, AF835), Ki67은 (1:1, Dako, 15626) 1X PBS로 희석 : 기본 항체 섹션은 ° C 기본 항체와 함께 다음과 같은 농도에서 4 박 incubated했다. 다음날 1X PBS 3x10 분 안에 슬라이드를 씻어.
- 차 항체 반응은 HRP 분류 이차 항체로부터 2-3 방울 (구상 시스템)와 함께 조직을 커버. 습기 상자에 슬라이드를 넣고 실온에서 1 시간 품어. 3x10 분 1X PBS로 씻으십시오.
- 검색은 제조 업체의 프로토콜을 다음과 주요 항체의 검출을위한 chromogen DAB 키트 (벡터 연구소 - SK - 4100)를 개발할 수 있습니다.
- 카운터 얼룩은 (hematoxylin으로 슬라이드를 담가 10-15 S econds는) 확실히 돈 "T 오버런 DAB 신호를 확인하십시오. 3 분 수돗물을 실행하는 린스.
- 탈수 담가 다음과 같은 순서로 슬라이드, 3x5 분 크실렌 5 분, 5 분 95 % 에탄올, 3x5 분 100 % 에탄올에 대한 70 %의 에탄올.
- permount 설치 시약 (피셔 사이 언티픽 SP - 15-100)으로 슬라이드를 살짝 커버.
- 이미지 올림푸스 형광 현미경 (DP - 72) .3.11)를 사용하여 촬영되었다. 모든 실험에서는 특정 상표는 기본 항체없이 대조군에 의해 확인되었다.
4. 대표 결과 :
우리는 glioblastoma multiforme의 (GBM)의 수술 표본을 수집했습니다. 환자는 temozolomide (TMZ)를 포함한 사전 chemotherapies없이 첫 번째 수술을 받았습니다. 그림 - 1A의 가돌리늄 강화와 MRI의 T1 - 가중 이미지는 수술 전에 오른쪽 전두엽에있는 향상된 종양을 보여주었다. 수술 이미지 (그림 - 1B)은 수술 후 병변의 제거를 확인 소계. 외과 조직은 임상 진단 목적으로 병리의학과로 전송되었고, 나머지 표본은 승인 기관 심사위원회 (IRB) 오하이오 주립 대학 메디컬 센터에서 프로토콜에서 조직 조달로 처리되었습니다. Hematoxylin과 Eosin (H & E) 염색법은 괴사의 존재, pseudopallisading 세포 및 microvascular 증식 (그림 1 - C)을 보여주었다. 따라서,이 종양은 histopathologically GBM으로 진단되었다. 노트, 최대 48 시간 TMZ없이 부화에 따라 종양 explants은 GBM의 cytoarchitecture를 유지. 대조적으로, 72 시간 또는 그 이상 부화와 함께, 우리는 종양 세포의 일부가 시작 제안, 표본의 응축 핵의 증가 수를 발견 apoptosis을 받다. 그 결과, 더 이상 부화 다음과 종양 조직은 우선적으로 괴사 영역 (데이터가 표시되지 않음)에서 주변 관찰되었다 종양 세포를 분실 곳곳에 지역이 포함되어 있습니다.
이러한 종양 explant 샘플이 안정적으로 약물 효능 검사의 목적으로 활용할 수있다면 조사를 위해, 우리는 TMZ 치료의 효과를 테스트. 그림 2는 본 연구의 실험의 흐름을 나타냅니다. 최근 연구 TMZ의 intratumoral 주입이 약 2 체계 관리의보다 악성 glioma의 성장 제어에 대한 자세한 강력한 효과를내는 것으로 지적했다. 16시간에 대한 부화 후, 이러한 explants은 파라핀 및 시리얼 부분이 얼룩을 위해 준비했던 내장했다. TMZ - 처리 GBM 조직의 Immunohistochemistry은 컨트롤 샘플과 비교 기 - 67 - 긍정적인 종양 세포의 상당한 감소를 보여주었다. 차례로, apoptosis 마커, Caspase - 3와 immunohistochemistry이 TMZ - 대우 glioma의 표본과 컨트롤 샘플 (그림 - 3) 사이에 상당한 차이를 얻을하지 않았다.
TMZ 치료 효과는 더욱 체외 문화 또는 유동세포계측법의 하나와 함께이 explant 분석을 결합하여 특징했다. 특히, 우리는 줄기 세포와 같은 종양 세포 (SCLTC)에 미치는 영향을 결정하는 모색. 따라서 TMZ와 치료 intratumoral 다음, 우리는 구체 형성 분석하고 이러한 종양 explants의 유동세포계측법을 수행. TMZ - 처리 표본 개별 단일 세포로 dissociated되었으며 이러한 단일 세포는 bFGF와 EGF와 보충 혈청이없는 배지에서 96 - 웰 플레이트 (1 microliter 당 셀 또는 낮은) 낮은 밀도에서 씨앗을 품고 있었다. 컨트롤 그룹에서 종양 explants에서 종양 분야의 형성은 칠일 보육 후에 관찰되었다. 영역 형성이 SCLTC 3 4의 속성임을 감안할 때, 약물 치료에 의해 종양 분야의 숫자에 변경이 SCLTC에 효과를 나타냅니다. 마찬가지로, 세포 표면 마커, CD133과 dissociated 종양의 explants의 유동세포계측법는 SCLTC에 대한 효과를 확인하기 위해 실시되었다. GBM의 이종 종양 세포에 SCLTC가 선택 약물 치료에 의해 일으킬 수있는 요소들은 미리 제거하는 경우, 하나는 유동세포계측법 치료 (데이터가 표시되지 않음)에 의해 CD133 양성 분획의 감소를 감지해야합니다 예측할 수 있습니다.
환자 GBM의 Figure.1 자기 공명 영상 (MRI). 사전 작업 그림 - 1A 및 수술 그림 - 1B의 대표 인물. 그림 - 1C 신선한 GBM 조직 샘플의 H & E 염색법이다. 원본 확대, 40X.
그림. 블록 문화 실험 2 실험 흐름. 그림 - 2A. 신선한 외과 GBM의 이미지는 병리의학과에서 받았다. 그림 - 2B가 도움 수술 칼날로 10mm 작은 조각으로 종양이 블록의 절개를 보여줍니다. 그림 - 2C는 인슐린 주사기를 사용하여 종양 블록의 약물 (TMZ) 치료입니다.
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그림. 활성화 Caspase - 3와 Ki67과 DMSO 또는 TMZ와 함께 주입 GBM 조직 블록 3 Immunohistochemistry. Immunohistochemistry. Hematoxylin은 핵 얼룩을 위해 사용되었다. 원본 확대, 40X.
Discussion
현재 사전 임상 실험 모델에서 약물 효능과 환자의 효능 사이에는 큰 차이가있다. 보다 구체적으로, 뇌 종양 연구 분야, 소설 및 신뢰할 수있는 방법은 현재의 방법으로 약물 평가 및 환자의 효능 사이의 기존의 격차를 작성 데 도움이 될 것이 필요합니다. 본 연구에서 설명하는 분석은 영향을받는 환자의 실험 데이터 및 결과의 불일치를 작성 촉진 않을 경우 솔루션 추가 자산입니다.
체외 세포 배양에 우선적에 관계없이 문화 조건의 특정 종양 세포 유형을 확장하고, 또한 전체 종양만을 subpopulation. 5 대표, 인공 세포 확장의 유전자와 phenotypic 변화가 발생하고 장기 세포 배양과 피할 수있다 . 악성 glioma을 치료하는 가장 큰 장애물 중 하나는 단일 종양 이내에 종양 샘플 6, 7 사이에 두 종양 세포의 이질입니다. 따라서,에 관계없이 한 종류 또는 다른 사람의 종양 세포의 특정 인구의 선택적 농축은 이기종 종양 세포에 대한 chemotherapeutic 요원의 효험을 결정하는 적절한 수단하지 않을 수 있습니다.의 subpopulation에서 파생된 뇌 종양의 8 9 모든 동물 모델 종양 세포는 subpopulation에서 약물 효험에 조명을 흘리다가 아니라 전체 종양.
몇 가지 제한이, 다른 한편으로는, 여전히이 종양 explant 방법에 남아 있습니다. 하나는 이러한 제한은 치료의 비교적 짧은 기간입니다. 악성 종양 세포가 전부는 아니 시간이 지남에 따라 치료법이, 단기 종양 세포 성장의 초기 컨트롤이 장기 환자의 예후 (豫 后)에 의해 반영되지 않을 수있다면, 대부분의 저항를 얻기위한 것으로 간주되므로, 같은 최근과 방지 신고 angiogenic 대리인, bevacizumab 10. 따라서, 긴 기간 동안 조직을 유지하기 위해이 explant 분석을위한 프로토콜의 개선은 추가 조사가 필요합니다. 또 다른 질문은 종양의 SCLTC에서 테스트 약물의 구체적인 효과입니다. SCLTC 악성 glioma, potently SCLTC가 보증됩니다 근절 소설 안티 - 암 의약품의 식별에 대한 현재 치료 상대적으로 강한 것을 감안할 때. 이러한 점에서, 우리는 현재와 같은 neurosphere 형성 분석 (데이터가 표시되지 않음)로 체외 실험에서 이후이 explant 분석을 결합을 추구합니다. 우리는이 결합을 통해 assays SCLTC에 약물 후보의 경우, 효과에 대한 자세한 내용을 보려면 기대하고 있습니다. 마지막으로, 종양 샘플을 작은 블록을 사용하면 같은 수술 표본에서 기존의 종양 세포 라인 또는 기본 문화권의 경우는, 전체 종양 세포의 인구를 반영하지 않을 수 있습니다. 별도로 이러한 문제, 혈관 틈새를 포함한 종양의 기질을, 보존하는 것은 종양 세포에 대한 환경 요인을 특성화에 도움이됩니다. 따라서이 분석은 더 생리학 관련 조건에 따른 치료 전략을 평가하는 가능성이있을 수 있습니다.
여기, 우리는 GBM의 수술 표본의 explants과 약물 효능 검사에 대한 분석을 설립했습니다. 사실, 테스트 수술 표본과 함께, 우리는 TMZ의 직접 분사는 GBM 샘플의 확산을 줄일 수있는 것으로 나타났습니다. 이 조직 explant 방법은 다른 고체 암에 이론적으로 적용하고 아마 우리가 암에 대한 임상 실험에서 다른 실패를 피하 도움이 될 것입니다 환자의 종양에 대한 약물 효험을 결정하기 위해 자산을 제공합니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
미국 암 협회 (MRSG - 08-108 - 01), 빈센트 J. 스그로 / 미국 뇌종양 협회, 그리고 나카노에 대한 칸 가족 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat-Inactivated | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | |
| D-MEM/F-12 (1X) Liquid 1:1 | Invitrogen | 10565-042 | |
| Agar-Agar Purified, Granulated | EMD Millipore | 1.01614.1000 | |
| DPBS for staining | Invitrogen | 14190 | |
| Hematoxyllin | Richard-Allan Scientific | 7211 | |
| 10% w/v formalin Caspase-3 | Ricca Chemical Company | 3810 | |
| Caspase-3 | R&D Systems | AF835 | |
| Ki67 | Dako | 15626 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Envision system- anti-mouse | Dako | 2012-07 | |
| Envision system- anti-rabbit | Dako | 2011-12 | |
| DAB-kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Table 1. Materials. | |||
| 6 Well Plate | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Petri dish | VWR international | 25384-302 | |
| Serological pipette | Axygen Scientific | ||
| Filter tips | USA Scientific, Inc. | ||
| 500 μm polyester mesh Netwell insert | Costar | 3480 | |
| Matrigel Matrix | BD Biosciences | 354230 | |
| BD 10 mL syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Hypodermic needle Aluminum Hub. | Tyco Healthcare, Covidien | 2000029 | |
| Tissue culture flask | Corning | ||
| Centrifuge tubes | Basix | 5539800 | |
| Thin wall tubes | Eton | 1107A | |
| Surgical Blade stainless steel | Feather Safety Razor Co, Ltd. | 2976#10 | |
| Insulin Syringe | Comfort point | 26027 | |
| 50mL flat top screw cap tube | Basix | 5539802 | |
| Dissection microscope | Tritech Research, Inc. | ||
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation | DP-72 | |
| Forcep | Fisher Scientific | ||
| Table 2. Equipment. | |||
References
- Hemmati, H. D. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 15178-15183 (2003).
- Heimberger, A. B. Temozolomide delivered by intracerebral microinfusion is safe and efficacious against malignant gliomas in rats. Clin Cancer Res. 6, 4148-4153 (2000).
- Nakano, I. Maternal embryonic leucine zipper kinase is a key regulator of the proliferation of malignant brain tumors, including brain tumor stem cells. J Neurosci Res. 86, 48-60 (2008).
- Laks, D. R. Neurosphere formation is an independent predictor of clinical outcome in malignant glioma. Stem Cells. 27, 980-987 (2009).
- Phillips, H. S. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell. 9, 157-173 (2006).
- He, J. Glycoproteomic Analysis of Glioblastoma Stem Cell Differentiation. J Proteome Res. , (2010).
- Ma, Y. H., Xu, Q. S., Zheng, J. S., Zhou, Y. Q., Zhan, R. Y. Expression of stem cell markers and proliferative labeling on glioma cell lines]. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 37, 333-334 (2008).
- Vik-Mo, E. O. Brain tumor stem cells maintain overall phenotype and tumorigenicity after in vitro culturing in serum-free conditions. Neuro Oncol. 12, 1220-1230 (2010).
- Hovinga, K. E. Inhibition of notch signaling in glioblastoma targets cancer stem cells via an endothelial cell intermediate. Stem Cells. 28, 1019-1029 (2010).
- de Groot, J. F. Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice. Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).
