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Medicine

Método para Desenvolvimento de Drogas Anti-Câncer Novel utilizando explantes Tumor de espécimes cirúrgicos

Published: July 29, 2011 doi: 10.3791/2846

Summary

Aqui, nós estabelecemos um método para testar a eficácia de drogas com espécimes cirúrgicos dos tumores cerebrais, denominado "método de explante tumor". Com este método, podemos avaliar a eficácia da droga, sem quebrar o microambiente de tumores sólidos. Para validar a confiabilidade deste método, descrevemos dados representativos com nosso exemplar glioma tratadas com o agente de primeira linha atual quimioterápicos, a temozolomida.

Abstract

As terapias atuais para glioma maligno têm apenas efeito paliativo. Para o desenvolvimento de terapêuticas, um obstáculo é a discrepância de eficácia determinada por testes de drogas atual eficácia ea eficácia em pacientes. Assim, novos métodos e confiável para avaliar a eficácia da droga estão garantidos na fase pré-clínica. Na cultura in vitro de tecidos tumorais, incluindo linhagens de células, tem substanciais alterações fenotípicas, genéticas e epigenéticas de células de câncer causado pelo ambiente artificial de cultura de células, que podem não refletir a biologia dos tumores originais in situ. Modelos de xenoenxerto com os ratos imunodeficientes também têm limitações, isto é, a falta de sistema imunológico e interespécies discrepâncias genéticas e epigenéticas no microambiente. Aqui, nós demonstramos um novo método usando a espécimes cirúrgicos de glioma maligno como blocos de tumor não dissociado para avaliar os efeitos do tratamento. Para validar este método, os dados com o agente de primeira linha atual quimioterápicos, a temozolomida (TMZ), são descritos.

Utilizou-se o espécime recém-removido cirúrgico de gliomas malignos para nossos experimentos. Realizamos a injeção intratumoral de TMZ ou candidatos de outras drogas, seguido de incubação e análises sobre espécimes cirúrgicos. Aqui, procurou-se estabelecer um método de explante tumor de tecido como uma plataforma para determinar a eficácia de novas terapias anti-câncer para que possamos ser capazes de superar, pelo menos, algumas das limitações atuais e preencher o hiato existente entre o experimental atual dados ea eficácia em tumor de um paciente real. Este método pode ter o potencial de acelerar a identificação novos agentes quimioterápicos para tratamento de câncer sólido.

Protocol

1. Preparação dos meios de comunicação

  1. A mídia foi preparado com 10% FBS (16140-071 - GIBCO) em DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen) com solução de Agar 0,6% purificada, Granulado (1.01614.1000-EMD ). Condições estéreis foram mantidos durante todo o experimento.
  2. Para a preparação dos meios de comunicação 5mL de FBS (16140-071 - GIBCO) foi adicionado em 45ml de DMEM/F-12 (1X), Liquid 01:01 (10565-042 - Invitrogen), tornando volume final de 50ml. A mídia preparado foi mantido em banho-maria a 37 ° C de temperatura.
  3. A solução de ágar foi preparado pelo método de micro-ondas de calor. 0,3 gramas de ágar granulado foi dissolvido em 50 mL de água destilada usando microondas. A solução de ágar foi esfriar a 37 ° C de temperatura, mantendo-o em banho-maria.
  4. Usamos volume igual de mídia a partir do passo 1.2 e 1.3 e solução estoque preparada. A proporção de agar 0,6% (0,5 ml) e 10% FBS-D-MEM/F-12 media (0,5 mL) foi de 1:1, fazendo o volume total de 1 mL em cada poço de 6 placas bem.

2. Processamento de tecidos

  1. Glioblastoma multiforme (GBM) os tecidos foram recebidos imediatamente após a cirurgia do Departamento de Patologia. O tecido foi classificada como GBM do Departamento de Patologia.
  2. O tecido foi transferido para o patri-placa com a pinça com cuidado e lavados com 1XPBS gelada 5mL por 3 vezes.
  3. Cortes seriados dos espécimes foram cortados a partir das amostras dissecadas para criar blocos de tumor (aproximadamente 10 mm de diâmetro) com uma lâmina cirúrgica (Feather-2976 # 10) e fórceps (Fisher Scientific).
  4. Blocos foram transferidos para uma placa de 6 bem. Cada poço foi 1mL contendo de mídia mencionar no passo 1.4. O tecido tinha exposição suficiente para o ar para manter o tecido viável.
  5. Blocos de tumor foram injectados com ou DMSO (5%) ou TMZ (2,5 nM) e incubados por 16 horas a 37 ° C no ar umidificado contendo 5% de CO2. 0,1 ml de DMSO (5%) ou TMZ foi injetada três vezes em blocos de tumor em lugares diferentes para o tratamento consistente. A droga foi injetada com seringas de insulina 1mL 0.37X12.7mm 28G1 / 2 (Comfort ponto 26.027).
  6. Após 16 horas blocos foram lavados com 5 mL 1XPBS por 3 vezes. Depois de lavar os blocos foram fixados com 10ml de 10% v / v de formalina por 24 horas (Ricca empresa de produtos químicos) em tubos de 50 ml (Basix-5539802) e processados ​​para inclusão em parafina 4μm seções.
  7. A seção de formol fixa foi colocada em copo sobre a placa de mexer com o "HEAT NO" e processadas através das seguintes soluções por 30 minutos em cada solução. Etanol 30%, etanol a 50%, etanol 75%, etanol 80%, 95% de etanol, o etanol 100%, e xileno.
  8. O tecido foi apagado em toalhas de papel e colocados em parafina derretida (58 a 60 ° C, Fisher parafina Paraplast) por 30 minutos.
  9. O tecido foi incluso em moldes de parafina usando Surgipath Blue Ribbon, o tecido embutida foi resfriado a temperatura ambiente.
  10. Incluídos em parafina secções de tecido 4μm foram tomadas e colocadas em lâminas de Fisher Plus.

3. Imuno-histoquímica

Imuno-histoquímica foi realizada como descrito anteriormente 1.

  1. Desparafinização e reidratação Coloque os slides em um rack e executar os passos seguintes. Xileno por 3x5 minutos (3 vezes por 5 minutos), etanol 100% por alguns minutos 3x5, o etanol 95% por alguns minutos 1x5, o etanol 70% por alguns minutos 1x5, enxágüe em água corrente por 3 minutos.
  2. Recuperação antigênica com calor induzido epítopo slides recuperação Mergulhe em tampão citrato 1X (Thermo científico-AP9003-500) diluído em água destilada num copo de vidro. Ferver durante 15 minutos em um prato quente (certifique-se seções don "t cair do slide). Solução esfriar por 30 minutos em temperatura ambiente. Lavar as lâminas com PBS 1X para 3x5 minutos.
  3. Inibição de peróxido interna Mergulhar as lâminas em metanol (Fisher Scientific-A-452-4) com peróxido de hidrogênio 0,3% (Fisher Scientific-BP2633-500-diluído em água destilada) em um copo de vidro durante 15 minutos. Enxágüe em 1X PBS para 3x5 minutos.
  4. Cubra o bloqueio tecidos com soro de cabra 10% normal. Transferir os slides em uma caixa úmida e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. Lavar as lâminas com PBS 1X para 3x5 minutos.
  5. Seções anticorpo primário foram incubadas overnight a 4 ° C com o anticorpo primário em concentrações seguintes: caspase-3 humana específica (1:1.000, R & D de sistemas, AF835), Ki67 (1:1, Dako, 15626) diluído com PBS 1X. Enxágüe as lâminas em PBS 1X minutos 3x10 no dia seguinte.
  6. Reação anticorpo secundário Cubra os tecidos com 2-3 gotas de HRP anticorpo marcado secundário (envision sistemas). Colocar slides em uma caixa úmido e incubar por 1 hora à temperatura ambiente. Lavar com PBS 1X para 3x10 minutos.
  7. Detecção de desenvolver para o DAB cromógeno kit (Vector laboratórios-SK-4100) para detecção do anticorpo primário seguindo o protocolo do fabricante.
  8. Mergulhe a coloração contra slides com hematoxilina (10-15 s egundos, certifique-don "t overrun DAB sinal). Lavar com água corrente por 3 minutos.
  9. Mergulhe a desidratação os slides em ordem a seguir, o etanol 70% por 5 minutos, etanol 95% por 5 minutos, o etanol 100% por alguns minutos 3x5, 3x5 para Xileno minutos.
  10. Tampa de deslizamento das lâminas com o reagente de montagem Permount (Fisher Scientific-SP-15-100).
  11. Imagens foram obtidas utilizando microscópio de fluorescência Olympus (DP-72) .3.11). Em todos os experimentos, rotulagem específica foi confirmada pelo controle negativo, sem o anticorpo primário.

4. Resultados representativos:

Foram coletados espécimes cirúrgicos de glioblastoma multiforme (GBM). Os pacientes foram submetidos a primeira cirurgia sem quimioterapia prévia, incluindo temozolomida (TMZ). A imagem ponderada em T1 da RM com contraste gadolíneo na figura-1a demonstrou um tumor reforçada no lobo frontal direito antes da cirurgia. A imagem no pós-operatório (Figura 1b) confirmou a remoção subtotal da lesão após a cirurgia. Os tecidos cirúrgicos foram enviados para o Departamento de Patologia para o propósito diagnóstico clínico, e as amostras restantes foram processadas para a colheita de tecidos sob o Conselho de Revisão aprovada Institucional (IRB) protocolo na Ohio State University Medical Center. Hematoxilina e eosina (H & E) demonstraram a presença de necrose, células pseudopallisading e microvascular proliferação (Figura 1-c). Assim, esses tumores foram diagnosticados como histopatologicamente GBM. De nota, explantes tumor após incubação sem TMZ até 48 horas manteve a citoarquitetura do GBM. Em contraste, com incubação por 72 horas ou mais, percebemos o aumento do número de núcleos de condensação na amostra, sugerindo algumas das células do tumor de partida para apoptose. Como resultado, os tecidos do tumor após mais de incubação continha regiões irregulares que perdeu as células tumorais, que foram observadas preferencialmente e em torno de áreas de necrose (dados não mostrados).

A fim de investigar se estas amostras explante do tumor pode ser utilizado de forma confiável com a finalidade de testar a eficácia da droga, testamos o efeito do tratamento TMZ. A Figura 2 representa o fluxo das experiências neste estudo. Um estudo recente indicou que a injeção intratumoral de TMZ tem um efeito mais potente no controle de crescimento de glioma maligno do que a administração sistêmica da droga 2. Após a incubação por 16 horas, esses explantes foram incorporados com parafina e cortes seriados foram preparados para a coloração. Imuno-histoquímica dos tecidos tratados com TMZ GBM demonstrado uma redução substancial de células Ki-67 positivo tumor em comparação com as amostras de controle. Por sua vez, imuno-histoquímica com um marcador de apoptose, Caspase-3, não deu qualquer diferença significativa entre os espécimes tratados com TMZ glioma e as amostras controle (Figura-3).

Efeito do tratamento com TMZ foi ainda caracterizada pela combinação explante este ensaio em conjunto com qualquer cultura in vitro ou citometria de fluxo. Especificamente, buscou-se determinar o efeito sobre células-tronco como as células do tumor (SCLTC). Portanto, após o tratamento intratumoral com TMZ, foi realizado ensaio de esfera formando e citometria de fluxo destes explantes tumor. Os espécimes foram tratados com TMZ dissociada em células individuais única e estas células isoladas foram semeadas em uma densidade baixa (uma células por microlitro ou menos) em placas de 96 poços no soro livre de meio suplementado com bFGF e EGF. No grupo controle, a formação de esferas de tumor do tumor explantes foi observada após sete dias de incubação. Dado que a formação de esfera é uma propriedade da SCLTC 3 4, alterações no número de esferas por um tumor de tratamento da toxicodependência indica o efeito sobre SCLTC. Da mesma forma, a citometria de fluxo dos explantes tumor dissociado com um marcador de superfície celular, CD133, foi realizado para verificar o efeito sobre SCLTC. Se SCLTC nas células tumorais em GBM heterogêneos são seletivamente erradicados por um tratamento medicamentoso, pode-se prever que a citometria de fluxo deve detectar diminuição da fração CD133 positivo pelo tratamento (dados não mostrados).

Figura 1
Figura.1 imagens de ressonância magnética (MRI) de um GBM paciente. Figuras representativas de pré-operação Figura 1a-e pós-operação Figura 1b. Figura 1c é H & E de coloração de amostra fresca GBM tecido. Ampliação original, 40X.

Figura 2
Figura. 2 O fluxo experimental do experimento cultura bloco. Figura 2a. Imagem do GBM cirúrgica fresca recebeu do departamento de patologia. Figura 2b mostra Dissecção do bloco de tumor em 10 milímetros pequenos pedaços com a lâmina ajuda cirúrgico. Figura-2c é a droga de tratamento (TMZ) de blocos de tumor usando seringa de insulina.

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Figura. 3 Imunohistoquímica. Imunohistoquímica de blocos de tecido GBM injetados com DMSO ou TMZ com ativadas Caspase-3 e Ki67. Hematoxilina foi usado para a coloração nuclear. Ampliação original, 40X.

Discussion

Existe uma lacuna entre a eficácia da droga na corrente modelos pré-clínicos e experimentais a eficácia em pacientes. Mais especificamente, no campo da pesquisa de tumor cerebral, novos métodos e confiáveis ​​são necessárias que ajudariam preencher a lacuna existente entre a avaliação de drogas com os métodos atuais ea eficácia em pacientes. O ensaio descrito neste estudo é um recurso adicional, se não uma solução, para facilitar o preenchimento da discrepância dos dados experimentais e os resultados dos pacientes acometidos.

Em culturas de células in vitro preferencialmente expandir certos tipos de células tumorais independentemente das condições de cultura, e representam apenas uma subpopulação de todo o tumor. 5 Além disso, transformação genética e fenotípica da célula artificial de expansão ocorre e é inevitável com as culturas de longo prazo de células . Um dos principais obstáculos para o tratamento de glioma maligno é a heterogeneidade das células tumorais, tanto dentro de um único tumor e entre amostras de tumor 6, 7. Portanto, o enriquecimento seletivo de uma determinada população de células tumorais, independentemente de um tipo ou outro, não pode ser um meio adequado para determinar a eficácia de quaisquer agentes quimioterápicos sobre células tumorais heterogêneos. 8 9 modelo Qualquer animal de tumores cerebrais derivadas de uma subpopulação de células tumorais lançar luzes sobre a eficácia da droga em uma subpopulação, mas não todo o tumor.

Várias limitações, por outro lado, ainda permanecem neste método explante tumor. Uma tal limitação é o período relativamente curto de tratamento. Uma vez que células de tumores malignos são considerados para adquirir resistência para a maioria, senão todas, as terapias ao longo do tempo, o controle inicial do crescimento de células tumorais de curto prazo pode não ser reflectida pelo prognóstico do paciente a longo prazo, como foi relatado recentemente com um anti- angiogênico agente, 10 bevacizumab. Assim, a melhoria do protocolo para este ensaio explante para preservar tecidos por um longo período é necessário com outras investigações. Outra questão é um efeito específico de um medicamento testado em SCLTC no tumor. Dado que SCLTC são relativamente resistentes às terapias atuais para glioma maligno, identificação de novos medicamentos anti-cancerígenos que potently erradicar SCLTC se justifica. A este respeito, que atualmente procuram combinar este ensaio explante com a subseqüente em experimentos in vitro, tais como ensaio formando neurosphere (dados não mostrados). Esperamos para saber mais sobre os efeitos, se houver, de um candidato de drogas em SCLTC através destes ensaios combinados. Por fim, usando pequenos blocos de amostras de tumor pode não refletir a população de células inteiras tumor, como é o caso com as linhas convencionais tumor de células ou culturas primárias de espécimes cirúrgicos. Estas questões de lado, preservando estroma tumoral, incluindo o nicho vascular, é útil na caracterização dos fatores ambientais para as células do tumor. Portanto, este ensaio pode ter potencial para avaliar qualquer estratégias terapêuticas sob uma condição mais fisiologicamente relevantes.

Aqui, nós estabelecemos um ensaio para testes de drogas com eficácia explantes de espécimes cirúrgicos de GBM. Na verdade, com os espécimes testados cirúrgica, descobrimos que uma injeção direta de TMZ reduz a proliferação nas amostras de GBM. Este método de explantes de tecido é teoricamente aplicável a outros tumores sólidos e fornece ativo para determinar a eficácia da droga sobre o tumor de um paciente, que esperamos nos ajudar a evitar um novo fracasso em ensaios clínicos para o câncer.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

A American Cancer Society (MRSG-08-108-01), Vincent J. Sgro / A Associação Americana do tumor cerebral, ea Família Khan Fundação para eu Nakano.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat-Inactivated GIBCO, by Life Technologies 16140-071
D-MEM/F-12 (1X) Liquid 1:1 Invitrogen 10565-042
Agar-Agar Purified, Granulated EMD Millipore 1.01614.1000
DPBS for staining Invitrogen 14190
Hematoxyllin Richard-Allan Scientific 7211
10% w/v formalin Caspase-3 Ricca Chemical Company 3810
Caspase-3 R&D Systems AF835
Ki67 Dako 15626
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Envision system- anti-mouse Dako 2012-07
Envision system- anti-rabbit Dako 2011-12
DAB-kit Vector Laboratories SK-4100
Table 1. Materials.
6 Well Plate Greiner Bio-One 657160
Petri dish VWR international 25384-302
Serological pipette Axygen Scientific
Filter tips USA Scientific, Inc.
500 μm polyester mesh Netwell insert Costar 3480
Matrigel Matrix BD Biosciences 354230
BD 10 mL syringe BD Biosciences 309604
Hypodermic needle Aluminum Hub. Tyco Healthcare, Covidien 2000029
Tissue culture flask Corning
Centrifuge tubes Basix 5539800
Thin wall tubes Eton 1107A
Surgical Blade stainless steel Feather Safety Razor Co, Ltd. 2976#10
Insulin Syringe Comfort point 26027
50mL flat top screw cap tube Basix 5539802
Dissection microscope Tritech Research, Inc.
Fluorescence microscope Olympus Corporation DP-72
Forcep Fisher Scientific
Table 2. Equipment.

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References

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  10. de Groot, J. F. Tumor invasion after treatment of glioblastoma with bevacizumab: radiographic and pathologic correlation in humans and mice. Neuro Oncol. 12, 233-242 (2010).

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Medicina Edição 53 Glioblastoma multiforme glioma a temozolomida terapêutica design de drogas
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Joshi, K., Demir, H., Yamada, R.,More

Joshi, K., Demir, H., Yamada, R., Miyazaki, T., Ray-Chaudhury, A., Nakano, I. Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens. J. Vis. Exp. (53), e2846, doi:10.3791/2846 (2011).

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