Summary
이득 또는 기능 연구의 손실 중 하나를 수행하기위한 목적으로 murine 망막 세포에 플라스미드 DNA의 결합을위한 방법
Abstract
포유 동물 망막 개발 중에 표현 유전자의 기능적 특성은 중요한 도전 남아있다. 기능 knockouts의 제정 또는 조건부 손실을 생성하는 대상 유전자는 비용과 노동 집약뿐만 아니라 시간이 소요 남아 있습니다. 이러한 도전을 추가, 망막는 녹아웃 방식을 사용하면 의도하지 않은 유전자 confounds 이어지는 망막 밖에서 필수적인 역할을 할 수 있습니다 표명했다. 세포 운명 사양 및 / 또는 터미널 차별화의 역할을 파악하려고 할 때뿐만 아니라, ectopically 기능 실험의 이득에 유전자를 표현하는 능력은 매우 가치 수 있습니다.
우리는 electroporation에 의해 신생아 마우스 망막에의 DNA plasmids의 신속하고 효율적인 설립을위한 방법을 제시한다. 멤브레인 1,2,3,4 전체 자료의 전송을 촉진 플라즈마 막 투과성의 일시적 증가 특정 필드 강도 결과 위에 짧은 전기 자극의 응용 프로그램입니다. 획기적인 작품은 electroporation은 지질 이중층 1-5 높은 청구 DNA의 통과를 허용 친수성 플라즈마 막 모공의 형성을 유도하여 포유 동물 세포에 유전자 전달의 수단으로 활용 될 수 있다고 보여주었다. 지속적인 기술 개발은 망막, 본 6, 7, 8, 9, 10 설명되어있는 방법을 포함한 여러 마우스 조직에서 생체내 유전자 전달에 대한 방법으로 electroporation의 생존 결과입니다.
그 DNA가 신생아 (P0) 마우스 및 전기 펄스의 망막 색소 상피와 망막 사이에 위치하므로 DNA 솔루션은 트위터 전극을 사용하여 적용됩니다 subretinal 공간에 주입합니다. 마우스에 눈의 수평 배치가 필요한 부정 극 - DNA - 망막 - 긍정적인 극 정렬에 트위터 전극의 쉬운 방향을 허용합니다. 양도 유전자의 다양한 결합과 표현은 출생 후의 일 2 (P2)에 의해 확인할 수 있습니다. 망막에있는 세포의 중요한 측면 마이 그 레이션의 부족으로 인해 electroporated이 아닌 electroporated 영역은 생성됩니다. 비 electroporated 지역 내부 histological 컨트롤 적절한 역할을 수 있습니다.
망막 electroporation은 같은 편대의 편대 장으로 유비 쿼터스 발기인 아래 유전자를 표현하기 위해, 또는 shRNA 구조 또는 Cre 호텔 - recombinase를 사용하여 유전자 기능을 방해하는 데 사용할 수 있습니다. 보다 타겟이 명확한 표현은 세포 특정 유전자 발기인과 구조를 설계하여 얻을 수 있습니다. electroporated 세포의 시각화는 GFP를 표현 bicistronic 구조를 사용하여 달성하거나 GFP 식은 구조 공동 electroporating 것입니다. 또한, 여러 구조는 유전자 조합 효과 또는 다른 유전자의 기능을 동시에 이득과 손실의 연구 electroporated 수 있습니다. 망막 electroporation도 적절한 표현 구조 및 삭제 돌연변이를 생성하여 게놈 CIS - 규제 요소의 분석을 위해 활용할 수 있습니다. 이러한 실험은 세포 특정 유전자 발현 11 충분한이나 필요한 CIS - 규제 지역을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 잠재적인 실험은 구성 가능한 의해 제한됩니다.
Protocol
1. electroporation에 대한 플라스미드 준비
electroporation에 필요한 DNA의 농도는 5μg/μl입니다. 이것은 일반적으로 원하는 plasmids이 작동 금액에 DNA의 정화와 농도에 의해 다음 맥시 - 준비 (Qiagen) 또는 이와 동등한 방법을 사용하여 증폭해야합니다. 다음 단계는 작업 금액에 DNA의 준비를 설명합니다.
- 나누어지는 100 μg의 DNA (맥시 - 준비 또는 동급에서)와 조작의 용이성 100 μL에 볼륨을 희석.
- 페놀 추가, 페놀의 양은 약 60 %의 DNA / 볼륨 비율 (μg의 DNA : 총 볼륨)을 구하는 계산해야합니다 즉 : 100 μg의 DNA (100 μL)을 더한 67 μL 페놀 (100 μg : 167 μL)를. 철저하게 혼합, 이것은 DNA의 과도한 전단을 일으킬 수 있으므로 아래 피펫과하지 않습니다.
- 실온에서 14,000 rpm으로 5 분 DNA를 스핀.
- 뜨는 수집과 동일한 DNA를 사용하여 클로로포름 추가 단계 1.2 총 부피 비율, 혼합으로 실온에서 5 분간 14,000 rpm으로 단계 1.2 스핀에 설명되어 있습니다.
- , 표면에 뜨는를 수집 DNA 솔루션 3 M의 아세트산 나트륨의 10 % 뜨는 볼륨을 추가 부드럽게 믹스와 2.5 X 100 %의 에탄올의 표면에 뜨는 볼륨을 추가합니다. 역전로 섞는다. DNA가 혼합하는 동안 솔루션의 밖으로 침전한다.
- 14,000 RPM에서 10 분 동안 4 ° C DNA를 스핀.
- 4 70 % 에탄올 350 μl, 5 분 14,000 RPM의 회전과 함께 씻어 ° C.
- 공기 건조 펠렛 다음 5μg/μL 1 X PBS (세포 생물학 등급)에 DNA를 해산. 이것은 매우 어려운 PBS로 분해를 할 수있을 것입니다로 샘플을 overdry하지 마십시오.
- DNA 솔루션에 대한 빠른 그린 염색 (10 % 주식을) 추가 염료의 최종 농도는 주입 추적 역할을, 0.1 %이다.
2. DNA의 주입 Subretinal
다음 단계는 stereomicroscope의 도움과 함께 수행됩니다. 일단 연습 눈 개방, 절개 및 사출의 과정을 복구하기 위해 적절하게 anesthetized 강아지를위한 충분한 시간되지 않습니다 미만 1.5 분이 소요됩니다. 날카로운 30 게이지 바늘을 사용하면, 신중하게 융합 junctional 상피 (그림 1C)을 따라 절단하여 시선을 엽니다. 이것이 기본 안구의 절단을 초래할 수 있으므로 무리한 힘을 적용하지 마십시오. 이 주사를 가리 수 있습니다 출혈이 발생할 수 있으므로 눈꺼풀 접합의 시야 밖으로 절단하지 마십시오.
- 이 사망률을 초래할 수 있으므로 몇 분 (그림 1A)에 얼음 신생아 생쥐를 마취, 얼음에서 새끼를 매장하지 않습니다. 얼음 시간의 길이는 강아지, 일반적으로 오분에 강아지가 충분하지만, 개인이 매우 빠르게 반응하거나 적절한 마취를 위해 더 이상 노출해야 할 수도 있습니다으로 마우스를 신중하게 모니터링해야합니다에서 변수입니다. 철수 반사를 확인 hemostats와 발 핀치를 실시하고 있습니다.
- subretinal 공간 DNA의 삽입을 용이하게하기 위해 눈 먼저 열려 있어야합니다. 면봉 70 % 이소 프로필 알코올 준비 (타이코 보건)에 주입하고 두 눈꺼풀은 (그림 1B) 함께 융합 junctional 상피를 식별할 수있는 눈.
- 날카로운 30 게이지 바늘을 사용하면, 신중하게 융합 junctional 상피 (그림 1C)을 따라 절단하여 시선을 엽니다. 이것이 기본 안구의 절단을 초래할 수 있으므로 무리한 힘을 적용하지 마십시오. 이 주사를 가리 수 있습니다 출혈이 발생할 수 있으므로 눈꺼풀 접합의 시야 밖으로 절단하지 마십시오.
- 뭉툭한 종료 주사 바늘이 각막과 접합 (그림 1E) 근처 공막엔의 작은 절개를 30 guage 바늘의 팁을 사용하여 눈의 침투를 용이하게합니다. 이 렌즈의 펑크가 발생할 수 있으므로 너무 깊이 침투하지 마십시오.
- 각 사출 (; Exmire microsyringe, 이토 코프 바늘 외경 0.52 mm, 내경 0.13 mm)에 개별적으로 볼륨을 측정하는 주사기의 그라디언트를 사용하여 33 게이지 뭉툭한 종료 사출 바늘로 DNA 솔루션의 0.3 μl을 그립니다. 반대 scleral 벽의 저항이 생각 때까지 절개에 바늘을 삽입합니다. 바늘이 vitreal 챔버 (그림 2B)를 통해 전달되는 등 렌즈를 관통하지 않도록주의하십시오.
- 천천히 주사기의 플런저를 우울하게하는 검지 손가락 또는 엄지를 사용하여 subretinal 공간으로 DNA 솔루션의 0.3 μl를 주입. 실험자의 DNA 솔루션 subretinal 공간에 주입되는 속도는 DNA 솔루션 subretinal 공간 (그림 2C) 내에 확산되는 속도보다 휠씬하지 않도록 플런저 우울증의 속도를 제어하는 신중해야합니다. 그것이 DNA를 주입하지 않는거나 균일하게 확산되지 않는다고 초래할 수 있으므로 바늘이 반대 scleral 벽에 너무 꽉 누르면 안하는 것이 중요하므로 DNA 솔루션은 점성이다. 성공 주사도 발생합니다subretinal 공간의 부분에 DNA 솔루션의 확산. 주입 동물을 회전 때과 녹색 추적기 기본없이 망막의 지역은 분명해야합니다.
3. Electroporation
- Electroporation는 10mm 직경의 트위터 전극 (; BTX 악기 모델 # 522)를 사용하여 수행됩니다. 동물에 전극에서 전기 전도율을 극대화하고 긍정적인 자극 전극에 인접한 주입 눈과 부정 극에 인접한 비 주입 눈으로 전극 사이에 주입된 강아지의 머리를 장소하기 위해 PBS에 트위터 전극 소크 전극 (그림 3B).
- 펄스 발생기를 사용하여 다섯 사각형 펄스를 적용 : 각 펄스는 펄스 사이에 950 밀리초 간격과 80 볼트와 기간이 50 밀리초입니다.
- 그들은 얼음 마취에서 회복까지 electroporated 새끼는 현재 예열해야합니다. 이것은 온난 램프 아래에 또는 따뜻한 슬라이드 위에 새끼를 삽입하여 수행할 수 있습니다. 따뜻한 슬라이드를 사용하는 경우 적절한 패드가 금속 표면과 복구 강아지 사이에 위치 있는지 확인합니다. 복구되면 자신의 어머니에게 electroporated 새끼를 반환합니다.
4. 분석을 위해 눈 준비
- electroporated 망막의 수확 및 분석의 시간은 실험의 목표에 따라 수행됩니다. GFP 표현은 electroporation 후 삼일 조잡한 시각하실 수 있습니다. cryoembedding 다음과 같이 진행 sectioning하십시오.
- 원하는 timepoint에서 electroporated 동물을 희생. electroporated 눈을 밖으로 Disect 4에서 4 % paraformaldehyde에 수정 ° C를 50 분.
- 조심스럽게 공막엔, 각막, 수정체, 망막 맥락막 및 색소 상피 멀리 마이크로는 해부에 의해 눈의 망막을 제거하십시오. 해부 망막은 조잡한 electroporation의 효율성을 결정하는 형광 분석에 따라있을 수 있습니다. 4 숙박 30 % 자당 솔루션에 망막을 전송 ° C.
- OCT cryo - 퍼가기 -80에서 미디어 (사쿠라 Finetek 미국)와 상점 ° C.에 고정 망막 망막 이제 cryotome에 sectioned 유리 슬라이드에 캡처 수 있습니다.
5. 대표 결과 :
플라스미드 pCAG - EGFP 표정으로 electroporated P0 신생아 망막의 예는 다음은 electroporation (P3)와 그림 4에 electroporation (P14) 다음 십사일 다음 3 일 제공됩니다. electroporated 망막 조직의 영역은 실험에서 subretinal 공간으로 DNA 솔루션의 확산의 주입과 반반함에 발생한 조직 손상의 정도에 따라 실험 변수입니다. 일반적으로 electroporated 망막의 90-100% 성공적으로 통합하여 소개 플라스미드를 표현했습니다 세포 기능 것입니다. 그러나, 언제 조직 형태 및 electroporation 효율 electroporated 망막만이 40-60%을 고려해이 비교 분석에 적합합니다. 바늘 침투의 사이트에서 로제트 형성과 망막 분리는 거의 항상 관찰되며이 지역은 분석을 위해 사용하지 않아야합니다. 성공 DNA는 rosettes과 분리에서 무료 바늘 침투의 사이트를 효율적 측면 electroporated 조직에 microinjection 결과 중에 확산. Gliosis 또한 중요한 실험 우려하고 거의 항상 바늘 침투의 현장에서 발생합니다. 그러나, 로제트 형성과 망막 분리와 마찬가지로, gliosis는 옆으로 electroporated 조직에서 일반적으로 중요하지 않습니다. 이러한 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)로 Immunohistochemical 마커 분석 지역에서 반응 gliosis 수준이 허용 기준 이내 가을 여부를 확인하는 이용하실 수 있습니다. Sectioned 망막은 electroporated 망막의 형태는 그대로 그 EGFP 표현 라벨 개별 electroporated 세포에 나타난 유지 보여주는. 예제는 P0 electroporation (그림 4D - F) 다음 P0 electroporation (그림 4A - C) 14 일 다음과 같은 삼일 소개하는 부분이있다.
P3 망막에 electroporated 세포의 대부분은 망막의 neuroblastic 층 (NBL)에 위치하고 있으며, 망막 (그림 4B, C)의 차별화된 신경이나 glial 세포 중 하나의 독특한 형태학의 특성을 설명하지 않습니다. P14으로 electroporated 세포 바깥 핵 층 (ONL)와 망막의 내부 핵 계층 (INL)에서 찾을 수 있습니다. 또한 다양한 라벨 세포는 이제 INL, photoreceptors 및 멀러 glia의 interneurons (그림의 4E, F)를 포함한 차별화된 뉴런의 특징 형태학의 특징을 표시합니다.
그림 1. 신생아 (P0) 강아지 마우스 및 DNA 솔루션의 subretinal 주입을위한 안구의 오프닝의 아나스타샤. A) 신생아 강아지가에 위치anesthetization위한 얼음 조각의 침대. 주입하는 아이가 얼음에 대해 아래로 배치됩니다. B) 눈꺼풀의 융합 junctional 상피의 위치 (B, 화살표)은 안구 여는 컷 수 있습니다. C) 눈에 노출 융합 junctional 상피 (C, 화살표)을 따라 눈꺼풀의 커팅. D) 개설 눈이 융합 접합에서 절단 다음. E) 절개는 무딘 종료 마이크로 분사 주사기 쉽게 삽입을 용이하게하기 위해 각막 아래 공막엔에서 아래 눈 안으로 이루어집니다. 스케일 바, B, C, D, E : 4mm.
무딘 그림 2. 삽입은 subretinal 공간으로 마이크로 분사 주사기 및 DNA 플라스미드 솔루션의 주사를 종료했습니다. A) 만화의 약도는 subretinal 공간으로 주사기 팁의 눈 및 정착에 마이크로 사출 주사기의 정확한 삽입을 보여주는. 유리체 챔버에 DNA 솔루션의 사출, 렌즈에 소켓, 또는 주사로 눈을 통해 주사기의 통로는 electroporated 세포있다면 몇 가지와 함께 실패 실험의 결과 것입니다. subretinal 공간에 주사기 팁의 scleral 벽 및 정착에 만든 절개로 주사기의 B) 삽입. subretinal 공간에 DNA 솔루션 C) 사출. 스케일 바, B, C : 4mm. 다음과 같은 약어 : R - 망막, L - 렌즈, V - 유리, SRS - subretinal 공간,가 없어요 - 무딘가 주사기를 마쳤다.
그림 3. electroporation을 위해 마우스에 트위터 전극의 오리 엔테이션. A) 만화 개략도 electroporated 눈에 상대 트위터 전극의 긍정적이고 부정적인 심폐의 방향을 보여주는. 녹색 subretinal 공간에 주입 DNA의 위치를 나타냅니다. 점선 화살표는 긍정적인 전극을 향해 부정적인 충전 주입 DNA의 전기 움직임을 나타냅니다. DNA 전기 영동은 긍정적인 전극을 향해 지향하는 망막에 부정적인 전극에 인접한 subretinal 우주에서 발생합니다. B) 트위터의 긍정적인 외륜은 눈 microinjected하고 부정적인 외륜이 아닌 주입 눈에 인접한 위치의 DNA에 인접한 배치됩니다. 신생아 마우스 트위터 전극 배치의 C) 높은 배율 이미지. 점선 라인은 긍정적인 전극으로 DNA의 전기 운동의 방향을 나타냅니다. 스케일 바, C : 5mm.
그림 4. 신생아 마우스 망막 (P0)는 pCAG - EGFP와 electroporated 및 출생 후의 일 3 (P3)과 출생 후의 일 14 (P14)에서 분석했다. AC) P0에서 pCAG - EGFP와 electroporated sectioned P3의 망막의 공촛점 이미지. electroporated 세포의 대부분은 망막 neuroblastic 층 (NBL)에 앉아. P0에서 pCAG - EGFP와 electroporated sectioned P14 망막의 (DF) 공촛점 이미지. Electroporated 세포 바깥 핵 층 (ONL)와 망막의 내부 핵 계층 (INL)에서 확인할 수 있습니다. 스케일 바, AF : 50 μm의.
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Discussion
생체내에 electroporation은 DNA의 표현 plasmids와 망막 세포의 변화에 대한 신속하고 효율적인 방법을 나타냅니다. 이 방법은 실험자들이 ectopically ubiquitously 표현 발기인의 통제하에 관심있는 유전자를 도입하거나 관심있는 유전자를 대상으로 shRNA 구조를 사용하여 기능 연구의 손실을 수행하기 위해하여 기능 연구의 이득을 수행할 수 있습니다. 또한, 다중의 DNA plasmids은 실험자 여러 유전자 효과를 분석하거나 관심 두 번째 유전자를 도입하면서 한 유전자를 허물고 수 있도록 동시에 electroporated 수 있습니다. Cre 호텔 recombinase의 표현을 운전 plasmids의 Electroporation도 관심의 floxed 유전자를 포함하는 동물을 사용할 수 있습니다 모자이크 방식으로 유전자 발현을 제거하기 위해 이용하실 수 있습니다. 이 방법은 원리 대 외부 유전자 기능의 결정에 특히 유용합니다. 반대로 다시 기존의 녹아웃 마우스의 망막에 유전자의 electroporation은 실험자들이 knockouts에서 확인 phenotypes을 반대하려고 시도하는 구조 연구를 수행할 수 있습니다. 어떤 배경 변형의 마우스가 수행되고있는 연구의 요구 사항에 electroporation 대상에 대한 이용하실 수 있습니다. 그러나, 그것은 가능한 강력한 모성 행동을 보여주는 변종을 사용하는, 즉 스위스 웹스터 또는 CD1은 electroporated 새끼의 거부의 가능성을 최소화하기 위해, 최고입니다. 알비노 실험실 계통 microinjection 동안 DNA 솔루션의 확산이 쉽게 시각 수 있으므로 작업을보다 쉽게하고 있습니다. 빠른 그린 추적은 망막 색소 상피의 색소 차별 할 수 없기 때문에 이러한 C57BL/6J로 어둡게 색소 눈을 가진 변종이 더 도전하고 있습니다.
electroporated 세포의 숫자는 그러나 초기 태어난 세포 유형이 제한됩니다 생성하는 능력 전구 인구 electroporate 수있는 능력 광범위한 것입니다. photoreceptors, 바이폴라 세포, 멀러 glia, 그리고 amacrine 세포를 포함하여 늦은 출생 전지는 쉽게이 방법을 사용 electroporated 있습니다. 반대로 망막 신경절 세포, 수평 세포, 그리고 amacrine 세포의 하위 집합을 포함하여 초기 출생 전지는 일반적으로이 방법을 사용 electroporated하지 않습니다. 전체 배아 망막이, 해부를 체외에서 electroporated 후 explants으로 양식되는이 프로토콜을 수정 일찍 태어난 세포 수업 7 유전자 조절 명세를 확인하기 위해 이용하실 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH R01EY020560 - 01에 의해 의료 연구 대상에서 WM 켁 영 학술 의해 투자되었다. 저자는 망막 준비 및 주사의 이미징 동안 그의 도움 요셉 Bedont 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | JT Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare, Covidien | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Technologies | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Technologies | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | N/A |
References
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