Summary
Een methode voor de integratie van plasmide DNA in het netvlies van muizen cellen voor het verrichten van een winst-of verlies van functie studies
Abstract
De functionele karakterisering van genen die tot expressie tijdens de zoogdieren het netvlies ontwikkeling blijft een belangrijke uitdaging. Gene targeting op constitutieve of voorwaardelijke verlies van functie knockouts genereren blijft kosten en arbeidsintensief, maar ook tijdrovend. Toe te voegen aan deze uitdagingen, retina uitgedrukte genen kan een essentiële rol buiten het netvlies leidt tot onbedoelde verwart hebben bij het gebruik van een knock-out aanpak. Verder kan de mogelijkheid om ectopisch drukken een gen in een winst van functie experiment uiterst waardevol bij een poging om een rol in het lot van de cel specificatie en / of terminale differentiatie te identificeren.
We presenteren een methode voor een snelle en efficiënte integratie van DNA plasmiden in de neonatale muis netvlies door middel van elektroporatie. De toepassing van korte elektrische impulsen boven een bepaalde veldsterkte resulteert in een voorbijgaande stijging in het plasma membraan permeabiliteit, het vergemakkelijken van de overdracht van het materiaal over het membraan 1,2,3,4. Baanbrekende werk aangetoond dat elektroporatie kunnen worden gebruikt als een methode van de genetische overdracht in cellen van zoogdieren door het induceren van de vorming van hydrofiele plasmamembraan poriën waardoor de doorgang van sterk geladen DNA door middel van de lipide bilaag 5. Voortdurende technische ontwikkeling heeft geresulteerd in de levensvatbaarheid van elektroporatie als een methode voor in vivo genoverdracht in meerdere muis weefsels waaronder het netvlies, de methode die is hierin 6, 7, 8, 9, 10 beschreven.
DNA-oplossing wordt geïnjecteerd in de subretinale ruimte, zodat DNA wordt geplaatst tussen de retinale pigment epitheel en het netvlies van de neonatale (P0) muis en elektrische pulsen worden toegepast met behulp van een pincet elektrode. De zijdelingse plaatsing van de ogen in de muis zorgt voor de gemakkelijke oriëntatie van de pincet elektrode om de nodige negatieve pool-DNA-netvlies-positieve pool uitlijning. Uitgebreide integratie en expressie van genen die overgedragen kunnen worden geïdentificeerd door postnatale dag 2 (P2). Vanwege het ontbreken van significante zijwaartse migratie van cellen in het netvlies, zijn geëlektroporeerd en niet-geëlektroporeerd regio's gegenereerd. Niet-geëlektroporeerd regio's kunnen dienen als interne histologische controles waar nodig.
Retinale elektroporatie kan worden gebruikt om een gen onder een alomtegenwoordige promotor, zoals CAG uit te drukken, of om gen-functie met behulp van shRNA construeert of Cre-recombinase verstoren. Meer gerichte expressie kan worden bereikt door het ontwerpen van constructies met cel specifiek gen promoters. Visualisatie van geëlektroporeerde cellen is bereikt met behulp van bicistronische bouwt uiten van GFP of door de co-electroporating een GFP-expressie-construct. Bovendien kunnen meerdere constructies worden geëlektroporeerde voor de studie van de combinatorische gen effecten of gelijktijdige winst en verlies van functie van verschillende genen. Netvlies elektroporatie kan ook worden gebruikt voor de analyse van genomische cis-regulatorische elementen door het genereren van juiste expressie constructen en deletiemutanten. Dergelijke experimenten kunnen worden gebruikt om de cis-regulerende gebieden voldoende of vereist zijn voor cel-specifieke genexpressie 11 te identificeren. Mogelijke experimenten zijn alleen beperkt door de bouw beschikbaarheid.
Protocol
1. Plasmide voorbereiding voor elektroporatie
De DNA-concentratie die nodig is voor elektroporatie is 5μg/μl. Dit vereist meestal het gewenste plasmiden te worden versterkt met behulp van een Maxi-prep (Qiagen) of gelijkwaardige methode, gevolgd door een zuivering en concentratie van het DNA naar de werkende bedrag. De volgende stappen beschrijven de voorbereiding van DNA naar de werkende bedrag.
- Aliquot 100 ug DNA (van Maxi-prep of gelijkwaardig) en verdun het volume op 100 ul voor het gemak van manipulatie.
- Voeg fenol, de hoeveelheid fenol die moet worden berekend om een ongeveer 60% DNA / volume verhouding (pg DNA: totaal volume) te verkrijgen namelijk: 100 ug DNA (in 100 ul) plus 67 pi fenol (100 ug: 167 pi). Meng grondig, niet pipet op en neer, omdat dit kan overmatige afschuiving van het DNA kunnen veroorzaken.
- Spin van het DNA gedurende 5 minuten bij 14.000 RPM bij kamertemperatuur.
- Verzamel supernatant en voeg chloroform met dezelfde DNA: totaal volume-verhouding in stap 1.2; mix zoals beschreven in stap 1.2 en draaien op 14.000 rpm gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verzamel de supernatant, 10% supernatans volume van 3 M natriumacetaat toe aan het DNA-oplossing toe te voegen, meng en voeg 2,5 X het supernatant volume van 100% ethanol. Meng door inversie. DNA moet neerslaan uit de oplossing tijdens het mengen.
- Spin het DNA bij 4 ° C gedurende 10 minuten bij 14000 RPM.
- Spoelen met 350 ul van 70% ethanol, draaien op 14.000 rpm gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- De lucht droog de pellet dan ontbinding van de DNA in een X PBS (Celbiologie graad) naar 5μg/μL. Niet Kreukherstellend monster als dit maakt het erg moeilijk op te lossen in PBS.
- Voeg snel groen kleurstof (10% voorraad) om de DNA-oplossing, de uiteindelijke concentratie van de kleurstof is 0,1%, op te treden als een injectie tracer.
2. Subretinale injectie van DNA
De volgende stappen worden uitgevoerd met de hulp van een stereomicroscoop. Zodra beoefend het proces van het oog openen, incisie, en injectie duurt minder dan 1,5 minuut, die niet genoeg tijd is voor een goed verdoofd pup om te herstellen. Met behulp van een scherpe 30-gauge naald, voorzichtig openen van de ogen door te snijden langs de gesmolten junctionele epitheel (figuur 1C). Doe niet te veel kracht, omdat dit kan resulteren in het snijden van de onderliggende oog. Vermijd het snijden buiten het bereik van het ooglid kruising, omdat dit zal resulteren in bloeden waar de injectie kan verduisteren.
- Verdoven van de pasgeboren muizen op ijs gedurende enkele minuten (Fig. 1A), niet begraven pups in het ijs, omdat dit kan leiden tot sterfte. De lengte van de tijd op het ijs is variabel van pup tot pup, meestal vijf minuten is voldoende, maar muizen moeten zorgvuldig worden gecontroleerd als individuen kunnen heel snel in te spelen of kan langere blootstelling nodig heeft om juiste verdoving zorgen. Voer een poot knijpen met hemostats om te controleren of voor de terugtrekking reflex.
- Om de injectie van DNA te vergemakkelijken van de subretinale ruimte in het oog moet eerst worden geopend. Wattenstaafje het oog te worden geïnjecteerd met een 70% isopropyl alcohol prep (Tyco Healthcare) en identificeren van de gesmolten junctionele epitheel, waar de twee oogleden bij elkaar komen (Fig. 1B).
- Met behulp van een scherpe 30-gauge naald, voorzichtig openen van de ogen door te snijden langs de gesmolten junctionele epitheel (figuur 1C). Doe niet te veel kracht, omdat dit kan resulteren in het snijden van de onderliggende oog. Vermijd het snijden buiten het bereik van het ooglid kruising, omdat dit zal resulteren in bloeden waar de injectie kan verduisteren.
- De penetratie van de ogen vergemakkelijken door de stompe eindigde injectienaald gebruik maken van de tip van een 30-guage naald maakt een kleine incisie in de sclera de buurt van de kruising met het hoornvlies (fig. 1E). Niet te diep doordringen, omdat dit kan leiden tot een punctie van de lens.
- Teken 0,3 ul van DNA-oplossing in een 33 meter stompe eindigde injectienaald met behulp van de spuit gradiënten om het volume te meten, voor elke injectie (naald buitendiameter 0,52 mm, inwendige diameter 0,13 mm, Exmire micro-, Ito corp). Steek de naald in de incisie tot aan de weerstand van de tegenstander sclerale muur wordt gevoeld. Wees voorzichtig om te voorkomen dat het penetreren van de lens als de naald wordt door de vitreale kamer (Fig. 2B).
- Injecteer langzaam 0,3 ul van DNA-oplossing in de subretinale ruimte met behulp van de wijsvinger of duim op de zuiger drukken. De onderzoeker moet voorzichtig zijn om de snelheid van de plunjer depressie, zodat de snelheid waarmee de DNA-oplossing wordt geïnjecteerd in de subretinale ruimte niet de snelheid waarmee de DNA-oplossing verspreidt zich binnen subretinale ruimte (fig. 2C) overtreffen controle. De DNA-oplossing is stroperig dus is het belangrijk dat de naald niet te strak gedrukt tegen de tegenstander sclerale muur als dit kan resulteren in het DNA niet wordt geïnjecteerd of niet verspreiden gelijkmatig. Een succesvol injectie zal resulteren in een nogverspreiding van de DNA-oplossing in een deel van de subretinale ruimte. Regio's van het netvlies met en zonder achterliggende groene tracer moet worden duidelijk bij het draaien van de geïnjecteerde dier.
3. Elektroporatie
- Elektroporatie is uitgevoerd met behulp van een 10 mm diameter pincet elektrode (Model # 522; BTX Instruments). Genieten van de pincet elektrode in PBS om de elektrische geleidbaarheid te maximaliseren van de elektrode naar het dier en plaats het hoofd van de geïnjecteerde pup tussen de elektroden met de geïnjecteerde oog grenzend aan de positieve pool elektrode en de niet-gespoten oog grenzend aan de negatieve pool elektrode (Fig. 3B).
- Van toepassing zijn vijf vierkante pulsen met behulp van een pulsgenerator: elke puls is 80 volt en 50 milliseconden in duur met een 950 milliseconde interval tussen impulsen.
- De geëlektroporeerde pups moet nu worden opgewarmd tot ze herstellen van het ijs anesthesie. Dit kan gedaan worden door het plaatsen van de pups onder een warming lamp of op de top van een dia warmer. Als u een dia warmer ervoor te zorgen dat een geschikt pad is geplaatst tussen het metalen oppervlak en de herstellende pup. Na reparatie terug de geëlektroporeerd pups aan hun moeder.
4. De voorbereiding van de ogen voor de analyse
- De tijd van oogsten en de analyse van de geëlektroporeerd netvlies wordt uitgevoerd met inachtneming van de doelstellingen van het experiment. GFP expressie kan worden schromelijk gevisualiseerd 3 dagen na elektroporatie. Voor cryoembedding en snijden als volgt te werk.
- Offeren geëlektroporeerde dieren op de gewenste tijdpunt. Disect de geëlektroporeerd ogen corrigeren en in 4% paraformaldehyde bij 4 ° C gedurende 50 minuten.
- Verwijder voorzichtig het netvlies van het oog door micro-ontleden weg de sclera, hoornvlies, de lens, choroidea en retinale pigment epitheel. De ontleed netvliezen kunnen worden geanalyseerd onder fluorescentie aan grove bepalen van de efficiëntie van elektroporatie. Breng de retina tot 30% sucrose-oplossing overnacht bij 4 ° C.
- Freeze netvliezen in oktober cryo-embedding media (Sakura Finetek USA) en bewaar bij -80 ° C. Netvliezen kunnen nu coupes op een cryotome en veroverde op glas dia's.
5. Representatieve resultaten:
Voorbeelden van P0 neonatale netvliezen geëlektroporeerd met een pCAG-EGFP expressie-plasmide worden gepresenteerd op 3 dagen na de elektroporatie (P3) en 14 dagen na elektroporatie (P14) in figuur 4. Het gebied van geëlektroporeerde retinaal weefsel is variabel van experiment om te experimenteren afhankelijk van de mate van weefselschade opgelopen tijdens de injectie en de gelijkmatigheid van de verspreiding van de DNA-oplossing in de subretinale ruimte. Typisch 90-100% van geëlektroporeerd netvlies zal beschikken over cellen die met succes hebben opgenomen en sprak de invoering plasmide. Echter, wanneer factoring in weefsel morfologie en elektroporatie efficiency slechts 40-60% van de geëlektroporeerd netvlies zal geschikt zijn voor een vergelijkende analyse. Rosette vorming en loslaten van het netvlies op de plaats van naald is bijna altijd waargenomen en deze regio mag niet gebruikt worden voor analyse. Succesvolle DNA verspreid tijdens de micro-injectie resulteert in een efficiënt geëlektroporeerd weefsel lateraal op de site van naald vrij van rozetten en onthechting. Gliosis is ook een belangrijke experimentele zorg en ontstaat vrijwel altijd op de plaats van de naald. Echter, zoals met rozet vorming en loslaten van het netvlies, gliosis is meestal niet significant in lateraal geëlektroporeerd weefsel. Immunohistochemische markers zoals gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) kan worden gebruikt om te bepalen of het niveau van reactieve gliosis bij de analyse van de regio's binnen aanvaardbare drempels. Doorsnede netvliezen waaruit blijkt dat de morfologie van de geëlektroporeerd netvlies intact blijft en dat EGFP expressie labels individuele geëlektroporeerde cellen worden gepresenteerd. Voorbeelden 3 dagen na een P0 elektroporatie (Fig. 4A-C) en 14 dagen na een P0 elektroporatie (fig. 4D-F) worden gepresenteerd.
In P3 netvliezen de meerderheid van de geëlektroporeerde cellen bevinden zich in de neuroblastic laag (NBL) van het netvlies, en niet aan te tonen duidelijke morfologische kenmerken van een van de gedifferentieerde neurale of gliale cellen van het netvlies (Fig. 4B, C). Door P14 geëlektroporeerde cellen kan worden gevonden in de buitenste nucleaire laag (ONL) en de binnenste nucleaire laag (INL) van het netvlies. Verder zijn de verschillende gelabelde cellen nu weer karakteristieke morfologische kenmerken van gedifferentieerde neuronen waaronder interneuronen van het INL, fotoreceptoren, en Müller glia (Afb. 4E, F).
Figuur 1. Anesthesie van een pasgeboren (P0) muis pup en de opening van oog voor subretinale injectie van DNA-oplossing. A) Neonatale pup geplaatst opeen bed van gebroken ijs voor de verdoving. Oog te injecteren wordt geplaatst naar beneden tegen het ijs. B) De plaats van de gesmolten junctionele epitheel (B, pijl) van de oogleden te snijden voor de opening van de ogen. C) Het snijden van de oogleden langs de gesmolten junctionele epitheel (C, pijl) om de ogen bloot te leggen. D) De geopende ogen na het snijden in de gesmolten kruising. E) wordt een incisie gemaakt in het oog beneden in de sclera onder het hoornvlies om gemakkelijke insertie van de stomp eindigde micro-injectiespuit te vergemakkelijken. Schaal van bars, B, C, D, E: 4mm.
Figuur 2. Inbrengen van de stomp eindigde micro-injectie spuit en injectie van DNA-plasmide-oplossing in de subretinale ruimte. A) Cartoon schematisch het aantonen van de juiste plaatsing van de micro-injectiespuit in het oog en de afwikkeling van de spuit in de subretinale ruimte. Injectie van de DNA-oplossing in het glasvocht kamer, zal de passage van de spuit door het oog in het stopcontact, of een injectie in de lens resulteren in mislukte experimenten met weinig of geen geëlectroporeerd cellen. B) De penetratie van de spuit in de incisie gemaakt in de sclerale muur en de vereffening van de spuit in de subretinale ruimte. C) injectie van de DNA-oplossing in de subretinale ruimte. Schaal van bars, B, C: 4mm. Afkortingen als volgt: R-netvlies, L-lens, V-glasvocht, SRS-subretinale ruimte, BES-stomp eindigde spuit.
Figuur 3. Oriëntatie van de pincet elektrode op de muis voor elektroporatie. A) Cartoon schematisch het aantonen van de oriëntatie van de positieve en negatieve peddels van de pincet elektrode ten opzichte van de geëlektroporeerd oog. Groen staat voor de locatie van het geïnjecteerde DNA in de subretinale ruimte. Gestippelde pijlen geven de elektroforetische beweging van negatief geladen DNA geïnjecteerd naar de positieve elektrode. DNA-elektroforese komt uit de subretinale ruimte grenzend aan de negatieve elektrode in het netvlies, die gericht is op de positieve elektrode. B) De positieve peddel van de pincet is geplaatst naast het DNA gemicroinjecteerd oog en de negatieve paddle grenst geplaatst om de niet-gespoten oog. C) Hoge vergroting afbeelding van tweezer elektrode plaatsing op de neonatale muis. Stippellijnen geven de richting van de elektroforetische beweging van DNA naar de positieve elektrode. Schaalbalk, C: 5mm.
Figuur 4. Neonatale muis netvlies (P0) geëlektroporeerd met pCAG-EGFP en geanalyseerd op postnatale dag 3 (P3) en postnatale dag 14 (P14). AC) confocale beelden van een doorsnede P3 netvlies geëlektroporeerd met pCAG-EGFP bij P0. De meerderheid van de geëlektroporeerde cellen zitten in de retinale neuroblastic laag (NBL). (DF) confocale beelden van een doorsnede P14 netvlies geëlektroporeerd met pCAG-EGFP bij P0. Geëlektroporeerde cellen kunnen worden geïdentificeerd in de buitenste nucleaire laag (ONL) en de binnenste nucleaire laag (INL) van het netvlies. Schaal Bars, AF: 50 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo elektroporatie staat voor een snelle en efficiënte methode voor de transformatie van retinale cellen met DNA expressie plasmiden. Deze methode laat de experimentator te winnen van de functie studies uitvoeren door ectopisch de introductie van een gen van interesse onder de controle van een alom uitgesproken organisator of verlies van functie studies uit te voeren door gebruik te maken shRNA constructies gericht op genen van belang. Bovendien kunnen meerdere DNA plasmiden gelijktijdig worden geëlektroporeerde, waardoor de experimentator om meerdere genen effecten te analyseren of om neer te slaan een gen, terwijl de invoering van een tweede gen van belang. Elektroporatie van plasmiden rijden expressie van Cre-recombinase kan ook worden gebruikt om genexpressie te elimineren in een mozaïek manier waar de dieren met een floxed gen van belang zijn beschikbaar. Deze methode is bijzonder waardevol voor de bepaling van de intrinsieke versus extrinsieke functie van een gen. Omgekeerd elektroporatie van een gen terug in het netvlies van de conventionele knock-out muizen kan de onderzoeker uit te voeren studies probeert te redden fenotypes die in knockouts te keren. Muizen van elke achtergrond stam kan worden gebruikt voor elektroporatie onderworpen aan de voorschriften van de studie die wordt uitgevoerd. Echter, het is het beste, waar mogelijk, stammen die sterk moederlijk gedrag vertonen te gebruiken, dat wil zeggen Zwitserse Webster of CD1, om het minimaliseren van de mogelijkheid van een afwijzing van geëlektroporeerd pups. Albino laboratoriumstammen zijn makkelijker om mee te werken, omdat de verspreiding van de DNA-oplossing tijdens de micro-injectie kan gemakkelijk worden gevisualiseerd. Stammen met donker gepigmenteerde ogen, zoals C57BL/6J meer uitdaging, omdat het snel groen tracer kan niet worden gediscrimineerd het pigment van de retinale pigment epitheel.
Het aantal geëlektroporeerde cellen is echter uitgebreid de mogelijkheid om progenitor populaties bevoegde electroporate voor het genereren van de vroegste geboren celtypen is beperkt. Laat-geboren-cellen met inbegrip van fotoreceptoren, bipolaire cellen, Müller glia, en amacrine cellen zijn gemakkelijk geëlektroporeerd met deze methode. Omgekeerd, zijn vroeg geboren cellen inclusief retinale ganglioncellen, horizontale cellen, en subsets van amacrine cellen meestal niet geëlektroporeerd met deze methode. Een wijziging van dit protocol waarin de hele embryonale netvlies worden ontleed, geëlektroporeerd in vitro en vervolgens gekweekt als explanten kan worden gebruikt om genen te reguleren specificatie van vroeg geboren cel klassen 7 te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NIH R01EY020560-01 en door een WM Keck Young Scholar in Medical Research Award. De auteurs willen graag Joseph Bedont bedanken voor zijn hulp tijdens de beeldvorming van het netvlies voorbereidingen en injecties.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | JT Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare, Covidien | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Technologies | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Technologies | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | N/A |
References
- Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
- Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).
- Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias. Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).
- Kinosita, K., Tsong, T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).
- Onishi, A. Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development. Neuron. 61, 234-246 (2009).
- Onishi, A. The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).
- Kim, D. S. A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression. J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).
