Summary
En metod för införlivandet av plasmid DNA i murina näthinnans celler för att utföra antingen vinst-eller förlust av funktion studier
Abstract
Den funktionella karakterisering av gener som uttrycktes under däggdjur näthinnans utveckling är fortfarande en stor utmaning. Riktad genmodifiering för att generera konstitutiv eller villkorlig förlust av funktion knockouts förblir kostnader och arbetskrävande, såväl som tidskrävande. Lägga till dessa utmaningar, uttryckt näthinnan gener kan ha viktiga roller utanför näthinnan vilket leder till oavsiktliga blandar ihop när man använder en knockout strategi. Dessutom kan förmågan att ectopically uttrycka en gen i en vinst på funktion försök att vara mycket värdefull när man försöker hitta en roll i cell öde specifikation och / eller terminal differentiering.
Vi presenterar en metod för snabb och effektiv integrering av DNA plasmider i neonatal musen näthinnan av elektroporation. Tillämpningen av korta elektriska impulser över ett visst resultat fältstyrkan på en övergående ökning av plasma-permeabilitet, underlätta överföring av material över membranet 1,2,3,4. Banbrytande arbete visat att elektroporation skulle kunna användas som en metod för genöverföring till däggdjursceller genom att inducera bildning av hydrofila porer plasmamembran möjliggöra passagen av laddad DNA genom membranet 5. Kontinuerlig teknisk utveckling har resulterat i livskraften i elektroporation som metod för in vivo genöverföring i flera mus vävnader, inklusive näthinnan, den metod som beskrivs häri 6, 7, 8, 9, 10.
DNA-lösning sprutas in i subretinal utrymme så att DNA är placerad mellan näthinnans pigmenterade epitel och näthinnan i neonatal (P0) mus och elektriska pulser tillämpas med hjälp av en pincett elektrod. Den laterala placering av ögonen i musen gör det möjligt att lätt orientering pincett elektroden till de nödvändiga negativa polen-DNA-näthinnan-positiva polen justering. Omfattande integrering och uttryck av överförda gener kan identifieras genom postnatal dag 2 (P2). På grund av avsaknaden av märkbara rörelser i sidled migration av celler i näthinnan, är electroporated och icke-electroporated regioner genereras. Icke-electroporated regioner kan fungera som interna histologisk kontroll där så är lämpligt.
Retinal elektroporation kan användas för att uttrycka en gen i en allestädes närvarande promotor, som CAG, eller att inaktivera genen med hjälp av shRNA konstruktioner eller Cre-recombinase. Mer riktade uttryck kan uppnås genom att utforma konstruktioner med cell-specifik gen initiativtagare. Visualisering av electroporated celler sker med hjälp av bicistronic konstruktioner som uttrycker GFP eller genom samarbete electroporating en GFP uttryck konstruktion. Dessutom kan flera konstruktioner vara electroporated för att studera kombinatorisk gen effekter eller samtidig vinst och förlust av funktion av olika gener. Näthinnan elektroporation kan även användas för analys av genomiska cis-reglerande element genom att skapa lämpliga uttryck konstruerar och mutanter radering. Sådana experiment kan användas för att identifiera cis-reglerande regioner tillräcklig eller krävs för cellspecifik genuttryck 11. Potentiella experiment begränsas bara av konstruera tillgänglighet.
Protocol
1. Plasmid förberedelse för elektroporation
Den DNA-koncentration som krävs för elektroporation är 5μg/μl. Detta kräver normalt den önskade plasmider som ska förstärkas med en Maxi-prep (Qiagen) eller motsvarande metod följt av en rening och koncentration av DNA till den arbetande beloppet. Följande steg beskriver förberedelserna av DNA till de arbetande beloppet.
- Alikvotera 100 mikrogram av DNA (från Maxi-prep eller motsvarande) och späd volymen till 100 mikroliter för enkel manipulation.
- Lägg fenol, mängden fenol bör beräknas för att få en ca 60% DNA / volym-förhållande (mikrogram DNA: total volym) dvs 100 mikrogram DNA (100 mikroliter) plus 67 mikroliter fenol (100 mikrogram: 167 mikroliter). Blanda noga, inte pipettera upp och ner eftersom det kan orsaka överdriven klippning av DNA.
- Snurra DNA i 5 minuter vid 14000 rpm i rumstemperatur.
- Samla supernatanten och tillsätt kloroform på identiska DNA: total volym förhållandet i steg 1,2, mix enligt beskrivningen i steg 1,2 och snurra på 14000 rpm i 5 minuter i rumstemperatur.
- Samla supernatanten, tillsätt 10% supernatant volym 3 M natriumacetat till DNA lösningen, blanda försiktigt och tillsätt 2,5 X supernatanten volym på 100% etanol. Blanda genom inversion. DNA ska fälla ut ur lösningen under omrörning.
- Snurra DNA vid 4 ° C i 10 minuter vid 14000 rpm.
- Skölj med 350 l av 70% etanol, snurra på 14000 rpm i 5 minuter vid 4 ° C.
- Lufttorka pelleten löses sedan DNA i en X PBS (Cellbiologi grade) till 5μg/μL. Låt inte strykfria provet eftersom detta gör det mycket svårt att upplösas i PBS.
- Lägg Snabb Grön färg (10% lager) till DNA-lösningen är den slutliga koncentrationen av färg 0,1%, att fungera som en injektion spårämne.
2. Subretinal injektion av DNA
Följande steg utförs med hjälp av ett stereomikroskop. När praktiseras processen med att öppna ögonen, snitt, och injektion tar mindre än 1,5 minuter vilket inte är tillräckligt med tid för ett ordentligt sövda valp att återhämta sig. Med en vass 30-gauge kanyl, öppna försiktigt ögat genom att skära längs med smält Junktional epitelet (bild 1C). Applicera inte för mycket kraft eftersom detta kan resultera i att skära av den underliggande ögat. Undvik att skära bortom utbud av ögonlocket korsningen eftersom detta kommer att leda till blödning som kan skymma injektion.
- Bedöva nyfödda möss på is i flera minuter (bild 1A), inte begrava inte valpar i isen eftersom detta kan resultera i dödlighet. Hur lång tid på isen varierar från valp till valp, typiskt 5 minuter räcker, men mössen ska övervakas noggrant som individer kan svara mycket snabbt eller kan kräva längre exponering för att säkerställa lämplig anestesi. Genomför en tass nypa med peanger för att kontrollera om tillbakadragande reflex.
- För att underlätta injektion av DNA till subretinal utrymme ögat måste först öppnas. Tvätta ögat som ska injiceras med en 70% isopropyl alkohol prep (Tyco Healthcare) och identifiera de smält Junktional epitelet där de två ögonlock möts (Fig. 1B).
- Med en vass 30-gauge kanyl, öppna försiktigt ögat genom att skära längs med smält Junktional epitelet (bild 1C). Applicera inte för mycket kraft eftersom detta kan resultera i att skära av den underliggande ögat. Undvik att skära bortom utbud av ögonlocket korsningen eftersom detta kommer att leda till blödning som kan skymma injektion.
- För att underlätta penetration av ögat med den trubbiga slutade injektionsnål med spetsen av en 30-guage nål gör ett litet snitt i sklera nära korsningen med hornhinnan (Fig. 1E). Inte tränga för djupt eftersom det kan resultera i en punktering av linsen.
- Rita 0,3 l DNA-lösningen till en 33 gauge slutade trubbiga kanylen med sprutan lutningar att mäta volymen individuellt för varje injektion (nål ytterdiameter 0,52 mm, innerdiameter 0,13 mm, Exmire mikrosprutan, Ito corp). Stick in nålen i snittet tills motstånd motsatta skleral väggen känns. Var noga med att undvika att tränga in i objektivet som nålen leds genom vitreal kammaren (Fig. 2B).
- Injicera långsamt 0,3 l DNA-lösning i subretinal rymden med hjälp av pekfingret och tummen för att trycka ner kolven. Försöksledaren måste vara noga med att kontrollera hastigheten på kolven depression så att den takt med vilken DNA-lösningen injiceras i subretinal utrymmet inte växa snabbare än hastigheten med vilken DNA-lösningen sprider sig inom subretinal utrymme (Fig. 2C). Den DNA-lösningen är trögflytande så det är viktigt att nålen inte trycker för hårt mot motsatta skleral väggen eftersom detta kan resultera i att DNA inte som injiceras eller inte sprids jämnt. En lyckad injektion kommer att resultera i ett ännuSpridningen av DNA-lösning i en del av subretinal rymden. Regioner i näthinnan med och utan bakomliggande gröna spårämne bör framgå när du roterar den injicerade djuret.
3. Elektroporation
- Elektroporation görs med en 10 mm elektrod diameter pincett (Modell # 522, BTX instrument). Blötlägg Pincett elektroden i PBS för att maximera elektriska ledningsförmåga från elektroden till djuret och placera huvudet av den injicerade valpen mellan elektroderna med injicerade ögat intill den positiva polen elektroden och den icke-injicerade öga anslutning till den negativa polen elektrod (Fig. 3B).
- Applicera fem kvadrat pulser med en pulsgenerator: varje puls är 80 volt och 50 millisekunder i längd med en 950 millisekunders intervall mellan pulserna.
- Den electroporated Valparna måste nu värmas tills de återhämta sig från isen narkos. Detta kan göras genom att placera ungarna under en värmande lampa eller ovanpå en bild varmare. Om du använder en bild varmare säkerställa att en lämplig pad placeras mellan metallytan och återhämta valp. När återhämtningen tillbaka electroporated valparna till deras mor.
4. Beredning av ögon för analys
- Tiden för skörd och analys av electroporated näthinnor utförs enlighet med de mål av försöket. GFP uttryck kan vara grovt visualiseras 3 dagar efter elektroporation. För cryoembedding och sektionering gör så här.
- Offra electroporated djur vid önskad tidpunkterna. Disect ut electroporated ögat och fixa i 4% paraformaldehyd vid 4 ° C i 50 minuter.
- Ta försiktigt bort näthinnan från ögat av mikroorganismer dissekera bort sklera, hornhinna, lins, åderhinnan och näthinnan pigmenterade epitel. Den dissekerade näthinnor kan analyseras under fluorescens att grovt bedöma effektiviteten i elektroporation. Överför näthinnor till 30% sackaroslösning över natten vid 4 ° C.
- Freeze näthinnor i oktober Cryo-inbäddning media (Sakura Finetek USA) och förvara vid -80 ° C. Näthinnor kan nu vara sektioneras på ett cryotome och fångas upp på glas diabilder.
5. Representativa resultat:
Exempel på P0 neonatal näthinnor electroporated med en pCAG-EGFP uttryck plasmid presenteras på 3 dagar efter elektroporation (P3) och 14 dagar efter elektroporation (P14) i figur 4. Området näthinnan electroporated vävnad varierar från experiment till experiment beroende på omfattningen av vävnadsskada som uppstått under injektionen och jämnhet i spridningen av DNA-lösningen i subretinal rymden. Normalt 90-100% av electroporated näthinnor kommer att innehålla celler som framgångsrikt har införlivat och uttryckte infördes plasmiden. Men när factoring i vävnad morfologi och elektroporation effektivitet kan endast 40-60% av electroporated näthinnor kommer att vara lämpliga för jämförande analys. Rosett bildning och näthinneavlossning på platsen för nålpenetration är nästan alltid iakttas och den här regionen bör inte användas för analys. Framgångsrika DNA spridas under mikroinjektion resulterar i ett effektivt electroporated vävnaden lateralt till platsen för nålpenetration fri från rosetter och avskildhet. Gliosis är också en viktig experimentell oro och nästan alltid sker på platsen för nålpenetration. Men som med rosett bildning och näthinneavlossning är gliosis normalt inte signifikant i sidled electroporated vävnad. Immunhistokemiska markörer som gliaceller fibrillära surt protein (GFAP) kan användas för att avgöra om nivåer av reaktiva gliosis i analyserade regioner ligger inom acceptabla gränser. Sektioneras näthinnor visar att morfologi electroporated näthinnan förblir intakt och att EGFP uttryck märker enstaka electroporated cellerna presenteras. Exempel 3 dagar efter en P0 elektroporation (Fig. 4A-C) och 14 dagar efter en P0 elektroporation (bild 4D-F) presenteras.
I P3 näthinnor de flesta electroporated celler finns i neuroblastic lager (NBL) i näthinnan, och inte visar tydliga morfologiska egenskaper av någon av de differentierade neurala eller gliaceller i näthinnan (Fig. 4B, C). Genom P14 electroporated celler finns i det yttre nukleära lagret (ENDA) och det inre nukleära lagret (INL) av näthinnan. Dessutom de olika märkta celler visar nu karakteristiska morfologiska kännetecken differentierade nervceller, inklusive interneuronen av INL, fotoreceptorer, och Müller Glia (bild 4E, F).
Figur 1. Anestesi av en nyfödd (P0) mus valp och öppnande av öga för subretinal injektion av DNA-lösning. A) Neonatal valpen placeras påen bädd av krossad is för anesthetization. Ögon som ska injiceras placeras ner mot isen. B) Placeringen av smält Junktional epitel (B, pil) på ögonlocken som ska klippas för att öppna ögonen. C) Kapning av ögonlocken längs smält Junktional epitel (C, pil) för att avslöja ögat. D) ögonen öppna efter kapning i smält korsning. E) Ett snitt läggs in i ögat under i sklera under hornhinnan för att underlätta enkel införandet av trubbiga slutade mikroinjektion spruta. Skala barer, B, C, D, E: 4mm.
Figur 2. Införande av trubbiga slutade mikroinjektion spruta och injektion av DNA plasmid lösning i subretinal rymden. A) Cartoon schematiskt visar korrekt isättning av micro injektionsspruta i ögat och avveckling av sprutan spetsen i subretinal rymden. Injektion av DNA-lösning i glaskroppen kammaren kommer passagen av sprutan genom ögat i uttaget, eller injektion i linsen resultera i misslyckade experiment med få eller inga electroporated celler. B) Penetration av sprutan i snitt i skleral väggen och avveckling av sprutspetsen i subretinal rymden. C) Injektering av DNA-lösningen i subretinal rymden. Skala barer, B, C: 4mm. Förkortningar enligt följande: R-näthinnan, L-objektiv, V-glaskroppen, SRS-subretinal utrymme, BES-slö slutade spruta.
Figur 3. Orientering av pincett elektroden på musen för elektroporation. A) Cartoon schematiskt visar riktningen på positiva och negativa paddlar av pincett elektroden i förhållande till electroporated ögat. Grönt representerar platsen för injiceras DNA in i subretinal rymden. Streckade pilar representerar den genom elektrofores rörlighet negativt laddade injiceras DNA mot den positiva elektroden. DNA elektrofores sker från subretinal utrymme i anslutning till den negativa elektroden i näthinnan som är inriktad på den positiva elektroden. B) Den positiva paddla i Pincett är placerad i anslutning till DNA idag injiceras ögat och den negativa paddla är placerad i anslutning till den icke-injicerade ögat. C) Hög förstoring bilden av pincett elektrodplacering på neonatal musen. Streckade linjerna representerar riktning elektroforetiska rörelse DNA mot den positiva elektroden. Skala bar, C: 5 mm.
Figur 4. Neonatal mus näthinnor (P0) electroporated med pCAG-EGFP och analyseras på postnatal dag 3 (P3) och postnatal dag 14 (P14). AC) Confocal bilder på en delad P3 näthinnan electroporated med pCAG-EGFP på P0. Majoriteten av electroporated celler sitter i näthinnans neuroblastic lagret (NBL). (DF) Confocal bilder på en delad P14 näthinnan electroporated med pCAG-EGFP på P0. Electroporated celler kan identifieras i det yttre nukleära lagret (ENDA) och det inre nukleära lagret (INL) av näthinnan. Skala Barer, AF: 50 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo elektroporering representerar en snabb och effektiv metod för omvandling av näthinnans celler med plasmider DNA uttryck. Denna metod gör försöksledaren att utföra vinst funktion studier av ectopically att införa en gen av intresse under kontroll av en ubiquitously uttryckt promotor eller utföra förlust av funktion studier med hjälp av shRNA konstruktioner riktad genmodifiering av intresse. Dessutom kan flera DNA plasmider vara electroporated samtidigt, så att försöksledaren att analysera flera olika gener effekter eller för att slå ner en gen införde samtidigt en andra gen av intresse. Elektroporation av plasmider körning uttryck för Cre recombinase kan också användas för att eliminera genuttryck i en mosaik mode där djur som innehåller en floxed gen av intresse finns. Denna metod är särskilt värdefullt för fastställandet av inneboende kontra yttre geners funktion. Omvänt elektroporation av en gen tillbaka till näthinnor av konventionella knockoutmöss låter försöksledaren att utföra räddnings-studier försöker vända fenotyper identifierats i knockouts. Möss av någon bakgrund stam kan utnyttjas för elektroporation omfattas av kraven i studien utförs. Men det är bäst, om möjligt, att använda stammar som visar stark moderns beteende, dvs schweiziska Webster eller CD1, för att minimera risken för avstötning av electroporated valpar. Albino laboratoriestammar är lättare att arbeta med eftersom spridningen av DNA-lösningen under mikroinjektion kan enkelt visualiseras. Stammar med mörkt pigmenterade ögon som C57BL/6J är mer utmanande eftersom Snabb Gröna spårämne inte kan diskrimineras pigment i näthinnans pigmenterade epitel.
Antalet electroporated celler är omfattande dock förmågan att electroporate stamceller populationer behöriga att generera de tidigaste födda celltyper är begränsad. Sent födda celler inklusive fotoreceptorer, bipolära celler, Müller Glia och amakrina celler är lätt electroporated med denna metod. Omvänt är tidigt födda celler inklusive retinal ganglion celler, horisontella celler och delmängder av amakrina celler normalt inte electroporated med denna metod. En ändring av detta protokoll där hela embryonala näthinnan är dissekeras, electroporated in vitro och sedan odlade som explants kan utnyttjas för att identifiera gener som reglerar specifikation för tidigt födda cell klasserna 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av NIH R01EY020560-01 och en WM Keck unge lärde i medicinsk forskning Award. Författarna vill tacka Josef Bedont för hans hjälp under avbildning av näthinnans preparat och injektioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | JT Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare, Covidien | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Technologies | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Technologies | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | N/A |
References
- Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
- Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).
- Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias. Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).
- Kinosita, K., Tsong, T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).
- Onishi, A. Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development. Neuron. 61, 234-246 (2009).
- Onishi, A. The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).
- Kim, D. S. A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression. J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).
