Summary
Kazanç ya da fonksiyon çalışmalar kaybı ya da yerine bir amaç için fare retina hücreleri içine plazmid DNA eklenmesi için bir yöntem
Abstract
Memeli retina gelişimi sırasında genlerin fonksiyonel karakterizasyonu önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Gen fonksiyonu tırnakları kurucu veya koşullu kaybı üretmek için hedef maliyet ve yoğun emek, zaman alıcı gibi kalır. Bu zorluklara ek olarak, retinaya bir nakavt yaklaşımı kullanılarak genler, retina dışında istenmeyen boşa giden temel rolleri olabilir dile getirdi. Ayrıca, hücre kaderinin şartname ve / veya terminal farklılaşma önemli bir rol tanımlamak için çalışırken ektopik fonksiyon deney bir kazanç bir gen ifade etme yeteneği son derece değerli olabilir.
Biz elektroporasyon yenidoğan fare retina içine DNA plazmid hızlı ve verimli bir ortaklık için bir yöntem mevcut. 1,2,3,4 membran boyunca malzeme transferi kolaylaştıran plazma zarının geçirgenliğini geçici bir artış belirli bir alan şiddeti sonuçları üzerinde kısa elektrik darbeleri, uygulama. Çığır açan çalışma elektroporasyon yüksek ücret DNA'nın çift katlı lipid 5 üzerinden geçişine izin veren hidrofilik plazma membran gözeneklerin oluşumunu uyararak memeli hücrelerine gen transferi bir yöntem olarak kullanılmaktadır olabilir göstermiştir. Sürekli teknik gelişme, retina, burada 6, 7, 8, 9, 10 olduğu yöntemi de dahil olmak üzere birden fazla fare dokularda in vivo gen transferi için bir yöntem olarak elektroporasyon canlılığı sonuçlandı.
DNA'nın yenidoğan (P0) fare ve elektrik sinyalleri retina pigmente epitel ve retina arasına yerleştirilir, böylece DNA'nın bir cımbız elektrot kullanarak çözüm uygulanan subretinal boşluğa enjekte edilir. Fare gözleri lateral yerleşimi, gerekli negatif kutup-DNA-retina-pozitif kutup hizalama cımbız elektrot kolay yönelim sağlar. Aktarılan genlerin yoğun birleşme ve ifade postnatal günde 2 (P2) tarafından tespit edilebilir. Retina hücrelerinin önemli bir yanal göç olmaması nedeniyle, electroporated ve olmayan electroporated bölgelerde üretilir. Sigara electroporated bölgelerde uygun olan yerlerde iç histolojik kontrolleri olarak hizmet verebilir.
Retina elektroporasyon gibi CAG gibi, her yerde bulunan bir organizatörü altında bir genin, ifade etmek, ya da shRNA yapıları veya Cre-recombinase kullanarak gen fonksiyonunu bozabilir kullanılabilir. Spesifik gen sahipleri ile hücre yapıları tasarlarken daha hedefli ifadesi elde edilebilir. Electroporated hücrelerinin Görselleştirme GFP ifade bicistronic yapıları kullanılarak elde ya da eş-electroporating GFP ifadesini oluşturmak. Ayrıca, çoğul yapıları Kombinatoryal gen etkileri ya da farklı genlerin işlevi eş zamanlı olarak kazanç ve kayıp çalışması için electroporated olabilir. Retina elektroporasyon uygun ifade yapıları ve silme mutantlar üreterek genomik cis-düzenleyici elemanlar analizi için kullanılabilir. Bu tür deneylerde hücre belirli bir gen ekspresyonu 11 için yeterli veya gerekli cis-düzenleyici bölgeleri tanımlamak için kullanılır . Potansiyel deneyler sadece yapı kullanılabilirlik ile sınırlıdır.
Protocol
1. Plazmid elektroporasyon için hazırlık
Elektroporasyon için gerekli olan DNA konsantrasyonu 5μg/μl. Bu genellikle istenen plazmid çalışma miktarda DNA saflaştırma ve konsantrasyon takip Maxi-hazırlık (Qiagen) veya eşdeğer yöntemi kullanılarak amplifiye gerektirir. Çalışma miktarda DNA hazırlık aşağıdaki adımları açıklar.
- Kısım DNA 100 mikrogram (Maxi-hazırlık veya eşdeğeri) ve manipülasyon kolaylığı için 100 mcL hacmi sulandırmak.
- Fenol ekleyin; fenol miktarı yaklaşık% 60 DNA / hacim oranı (mg DNA: toplam hacim) elde etmek için hesaplanmış olmalıdır yani: 100 mikrogram DNA (100 mcL) artı 67 mcL fenol (100 mikrogram: 167 mcL). Iyice karıştırın, bu DNA aşırı kesme neden olabilir pipet ve aşağı yukarı yok.
- DNA 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 14000 RPM Spin.
- Süpernatant toplayın ve aynı DNA kullanarak kloroform ekleyin: adım 1.2 'de toplam hacim oranı; karışımı olarak oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 14000 RPM adım 1.2 ve spin.
- Süpernatantı toplayın, DNA çözümü için% 10 supernatant hacim 3 M sodyum asetat ekleyin, hafifçe karıştırın ve 2,5 X supernatant% 100 etanol hacmi ekleyin. Tersine çevirerek karıştırın. DNA karıştırma sırasında çözüm çökelek olmalıdır.
- 14000 RPM 10 dakika DNA 4 ° C dönerler.
- 4% 70 etanol 350 ul, 5 dakika 14000 RPM dönmesi ile durulayın ° C.
- Hava kuru pelet sonra 5μg/μL 1 X PBS (Hücre biyolojisi grade) DNA çözülür. PBS içine çok zor çözülür yapacak örnek overdry etmeyin.
- DNA çözüm Fast Yeşil boya (% 10 hisse), boya son konsantrasyonu bir enjeksiyon tracer olarak hareket etmeye,% 0.1 'dir.
2. Subretinal DNA enjeksiyonu
Aşağıdaki adımlar bir stereomikroskopta yardımı ile yapılır. Bir kez uygulanan göz açma, kesi ve enjeksiyon işlemi düzgün anestezi kurtarmak için bir yavru için yeterli zamanı değil en az 1,5 dakika sürer. Keskin bir 30-gauge iğne kullanarak, erimiş junctional epitel (Şekil 1C) boyunca keserek dikkatlice göz açın. Bu, altta yatan bir göz kesme neden olabilir gibi aşırı kuvvet uygulamayın. Bu enjeksiyon belirsiz olabilir kanama sonucu olarak, göz kapağı kavşak aralığının dışında kesim kaçının.
- Bu ölüm neden olabilir (Şekil 1A) için birkaç dakika buz üzerinde yeni doğmuş farelerin anestezisi, buz yavrular gömmek yok. Buz üzerinde zaman uzunluğu, yavru, genellikle 5 dakika yavru yeterli ancak bireylerin çok hızlı bir şekilde cevap verebilir veya uygun anestezi sağlamak için uzun pozlama gerekebilir fareler dikkatle izlenmelidir değişkendir. Geri çekilme refleksi kontrol etmek için hemostat bir pençe tutam gerçekleştirin.
- Subretinal alana DNA enjeksiyonu kolaylaştırmak amacıyla göz açılmalıdır. Swab% 70 izopropil alkol hazırlık (Tyco sağlık) ile enjekte edilen ve iki göz kapaklarını bir araya gelip (Şekil 1B) erimiş junctional epitel belirlemek için göz.
- Keskin bir 30-gauge iğne kullanarak, erimiş junctional epitel (Şekil 1C) boyunca keserek dikkatlice göz açın. Bu, altta yatan bir göz kesme neden olabilir gibi aşırı kuvvet uygulamayın. Bu enjeksiyon belirsiz olabilir kanama sonucu olarak, göz kapağı kavşak aralığının dışında kesim kaçının.
- Künt uçlu enjeksiyon iğnesi kornea ile birleşme sklerasına (Şekil 1E) yakınlarındaki küçük bir kesi yapmak 30-guage iğne ucu göz penetrasyonunu kolaylaştırmak için. Bu objektif bir delinmeye neden olabileceği için çok derinden nüfuz etmeyin.
- Her bir enjeksiyon (Exmire mikroenjektör; Ito corp iğne dış çapı 0.52 mm, iç çapı 0.13 mm) için ayrı ayrı hacmini ölçmek için şırınga gradyanlar kullanarak 33 göstergesi künt sona erdi enjeksiyon iğnesi 0.3 ul DNA çözüm çizin. Skleral duvara karşı direnç hissedilir kadar iğne kesi içine yerleştirin. Iğne vitre odası (Şekil 2B) geçerken objektif nüfuz önlemek için dikkatli olun.
- 0.3 ul DNA çözüm, yavaş yavaş şırınga pistonu bastırmak için işaret parmağı ve başparmak kullanarak subretinal boşluğa enjekte edilir. Deneyci DNA çözüm subretinal boşluğa enjekte edilir oranı DNA çözümü subretinal alanı (Şekil 2C) içinde yayılır hangi hızda geride kalmaması, piston depresyon hızını kontrol etmek için dikkatli olmak gerekir . Bu DNA enjekte ediliyor ya da eşit yayılmasını sonucu olarak iğne skleral duvara karşı çok sıkı basıldığında değildir ki önemlidir, böylece DNA çözüm viskoz. Başarılı bir enjeksiyon bile neden olacaktırsubretinal boşluğa bir kısmını DNA çözüm yayılmıştır. Enjekte hayvan dönen ve yeşil tracer altında yatan olmadan Bölgeler retinanın belirgin olmalıdır.
3. Elektroporasyon
- Elektroporasyon 10 mm çapında cımbız elektrot (BTX Aletleri Model # 522) kullanılarak yapılır. Hayvan elektrot elektrik iletkenliği en üst düzeye çıkarmak ve pozitif kutuplu elektrot bitişik enjekte göz ve negatif kutupta bitişik olmayan enjekte göz ile elektrot arasındaki enjekte yavru baş koyun için PBS içinde cımbız elektrot Soak elektrot (Şekil 3B).
- Bir darbe jeneratörü kullanarak beş kare darbeleri uygulayın: Her darbe bakliyat arasında 950 milisaniye aralığı ile 80 volt ve süresi 50 milisaniye.
- Buz anestezi kurtarmak kadar electroporated yavrular artık ısınmış olması gerekir. Bu yavrular bir ısınma lambası altında ya da sıcak bir slayt üstüne koyarak yapılabilir. Eğer sıcak bir slayt kullanarak metal yüzey ve kurtarma yavru arasında uygun bir ped yerleştirildiğinden emin olun. Kurtarma üzerine electroporated yavrular annelerinin dönün.
4. Gözleri analiz için hazırlanması
- Electroporated retina toplama ve analiz, deney amaçları için yapılır. GFP ifade elektroporasyon 3 gün sonra kabaca görüntülenmiştir olabilir. Cryoembedding ve şu şekilde devam kesit.
- Istenilen timepoint electroporated hayvanların Kurban. Electroporated göz Disect ve 4% 4 paraformaldehid düzeltmek ° C'de 50 dakika.
- Sklera, kornea, lens, koroid ve retina pigmente epitel uzak mikro diseksiyon göz retinanın dikkatlice çıkarın. Floresan altında diseke retina kabaca elektroporasyon etkinliğini belirlemek için analiz edilebilir. 4 gecede% 30 sakaroz çözeltisini retina transfer ° C
- Freeze retina içine Ekim cryo gömme medya (Sakura Finetek ABD) ve mağaza -80 ° C Retinanın kesitli bir kriyotom ve cam slaytlar üzerine yakalanan olabilir.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Elektroporasyon (P3) ve Şekil 4 elektroporasyon (P14) takip eden 14 gün sonra 3 gün plazmid pCAG-EGFP bir ifade ile electroporated P0 yenidoğan retina örnekleri sunulmaktadır. Electroporated retina dokusunun alan deney subretinal boşluğa DNA çözüm yayılma enjeksiyon ve düzgünlüğü sırasında ortaya çıkan doku hasarı ölçüde bağlı deney değişken. Genelde% 90-100 electroporated retina, başarılı bir şekilde kurulmuş ve piyasaya plazmid ifade hücrelerin yer alacak. Ancak, doku morfolojisi ve elektroporasyon verimliliği electroporated retina sadece% 40-60 faktoring karşılaştırmalı bir analiz için uygun olacaktır. Rozet oluşumu ve retina dekolmanı iğne penetrasyon yerinde hemen hemen her zaman görülmektedir ve bu bölgede analiz için kullanılmamalıdır. Başarılı DNA, rozet ve dekolmanı iğne penetrasyon site lateral verimli electroporated doku mikroenjeksiyon sonuçları sırasında yayılmıştır. Gliozis, ayrıca önemli bir deneysel sorundur ve neredeyse her zaman iğne penetrasyon yerinde meydana gelir. Ancak, rozet oluşumu ve retina dekolmanı ile, gliozis yanal electroporated doku genellikle önemli değildir. Glial fibriller asidik protein (GFAP) gibi immünohistokimyasal belirleyicileri analiz bölgelerde reaktif gliozis düzeyleri kabul eşikleri giren olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Kesitli retina electroporated retinanın morfolojisi sağlam ve EGFP ifade etiketleri bireysel electroporated hücreleri sunulmaktadır kaldığını göstermektedir. Örnekler, P0 elektroporasyon (Şekil 4D-F) aşağıdaki P0 elektroporasyon (Şekil 4A-C) ve 14 gün sonra 3 gün sunulmaktadır .
P3 retina, retina neuroblastic tabakası (NBL) electroporated hücrelerinin çoğunluğu bulunan ve herhangi bir retina (Şekil 4B, C) farklılaştırılmış nöral veya glial hücrelerin farklı morfolojik özellikleri göstermek yok . P14 electroporated hücreleri dış nükleer tabaka (onl) ve retinanın iç nükleer tabaka (INL) bulunabilir. Ayrıca çeşitli etiketli hücreleri INL, fotoreseptör ve Müller glia internöronlar (Şekil 4E, F) de dahil olmak üzere farklılaşmış nöronların karakteristik morfolojik işaretlerinden gösterilecek.
Şekil 1 (P0) yeni doğmuş bir yavru fare ve DNA çözüm subretinal enjeksiyon için göz açılış Anestezi. A) Yenidoğan yavru yerleştiriliranesthetization için ezilmiş buz bir yatak. Enjekte edilecek Göz buz karşı aşağı yerleştirilir. B) göz kapaklarının erimiş junctional epitelin yerini (B ok) Göz açılması için kesilecek. C) erimiş junctional epitel (C, ok) birlikte göz kapaklarının göz maruz Kesme. D) açıldı göz erimiş kavşağında kesme. E) künt sona erdi mikro-enjeksiyon şırınga kolay ekleme bir kesi kolaylaştırmak için göz kornea altındaki sklerasına altında yapılır. Ölçek barlar, B, C, D, E: 4mm.
Künt Şekil 2 Eklemesi subretinal boşluğa mikro-enjeksiyon şırınga ve DNA plazmid çözüm enjeksiyon sona erdi. A) Karikatür şematik subretinal boşluğa şırınga ucu göz ve yerleşim içine mikro enjeksiyon şırınga doğru ekleme göstermektedir. Vitreus odasına DNA çözüm enjeksiyon, göz lensin içine soket veya enjeksiyon yoluyla şırınga geçişi, herhangi bir electroporated hücreleri eğer birkaç başarısız deneyler neden olacaktır. B) subretinal boşluğa şırınga ucu skleral duvar ve yerleşim yapılan kesi içine şırınga Penetrasyon. C) Enjeksiyon subretinal boşluğa DNA çözümü. Ölçek barlar, B, C: 4mm. Kısaltmalar aşağıdaki gibidir: R-retina, L-lens, V-vitreus, SRS subretinal alan, BES-künt şırınga sona erdi.
Şekil 3 elektroporasyon için fare üzerine cımbız elektrot Oryantasyon. A) Karikatür şematik electroporated göz göre cımbız elektrot pozitif ve negatif kürekler yönünü göstermektedir. Yeşil subretinal boşluğa enjekte DNA konumunu temsil eder. Kesikli oklar pozitif elektrot doğru negatif yüklü enjekte DNA'nın elektroforetik hareketi temsil eder. DNA elektroforez pozitif elektrot yönelik retina içine negatif elektrot bitişik subretinal alan oluşur. B) cımbız olumlu kürek göz microinjected ve negatif kürek olmayan enjekte göz bitişik yerleştirilen DNA bitişik yerleştirilir. C) Yüksek yenidoğan fare cımbız elektrot yerleştirme büyütme görüntü. Kesikli çizgiler, pozitif elektrot doğru DNA'nın elektroforetik hareket yönünü temsil eder. Ölçek bar, C: 5mm.
Şekil 4 Yenidoğan fare retina (P0) pCAG-EGFP electroporated ve doğum sonrası 3. günde (P3) ve doğum sonrası 14. günde (P14) analiz. AC) P0 pCAG-EGFP ile electroporated kesitli P3 retinanın Konfokal görüntüler. Electroporated hücrelerinin çoğunluğu, retina neuroblastic tabakası (NBL) oturun. (DF) P0 pCAG-EGFP ile electroporated kesitli P14 retinanın Konfokal görüntüler. Electroporated hücreleri dış nükleer tabaka (onl) ve retinanın iç nükleer tabaka (INL) tespit edilebilir. Ölçek Barlar, AF: 50 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo elektroporasyon DNA ifade plazmid ile retina hücrelerinin dönüşümü için hızlı ve etkili bir yöntem temsil eder. Bu yöntem, deneyci ektopik yayg ifade organizatörü kontrolü altında bir ilgi gen tanıtan veya ilgi gen hedefleme shRNA yapıları kullanarak fonksiyon testleri kaybı gerçekleştirmek için fonksiyon testleri kazanç gerçekleştirmek için olanak sağlar. Ayrıca, birden fazla DNA plazmid deneyci birden fazla genin etkilerini analiz etmek veya ilgi ikinci bir gen tanıtan bir gen yıkmak için izin, aynı anda electroporated olabilir. Cre recombinase ifade sürüş plazmid Elektroporasyon da bir ilgi floxed gen içeren hayvan mevcuttur bir mozaik moda gen ekspresyonu ortadan kaldırmak için de kullanılabilir. Bu yöntem, içsel-dışsal gen fonksiyonunun belirlenmesi için özellikle değerli. Aksine, geleneksel knockout farelerde retina içine bir genin elektroporasyon deneyci tırnakları tespit fenotipleri tersine çevirmek için çalışan kurtarma çalışmaları gerçekleştirmek için olanak sağlar. Herhangi bir arka plan suşu Fareler gerçekleştirilen çalışmanın gereklerine elektroporasyon konu için kullanılabilir. Ancak, bu mümkünse, güçlü bir anne davranışı gösteren suşlar kullanmak, yani İsviçre Webster veya CD1 electroporated yavrular reddedilme olasılığını en aza indirmek amacıyla, en iyisidir. Albino laboratuvar suşları mikroenjeksiyon sırasında DNA çözümü yayılması kolayca görüntülenebilmekte beri ile çalışmak daha kolay. Hızlı Yeşil tracer retinal pigmente epitel pigment karşı ayrımcılık olamaz beri C57BL/6J gibi koyu pigmentli gözler Suşlarının daha zorlu.
Electroporated hücrelerinin sayısı Ancak erken doğan hücre tipleri sınırlı oluşturmak için yetkili progenitör popülasyonları electroporate yeteneği geniş kapsamlıdır. Fotoreseptörlerin, bipolar hücreleri, Müller glia ve amacrine hücreleri de dahil olmak üzere Geç doğumlu hücreler bu yöntemi kullanarak kolayca electroporated. Tersine, retina ganglion hücrelerinin, yatay hücreler, ve altkümelerini amacrine hücreleri de dahil olmak üzere erken doğan hücreler genellikle bu yöntemi kullanarak electroporated değildir. Tüm embriyonik retina, disseke in vitro electroporated ve sonra eksplantlar olarak kültüre olan bu protokol bir değişiklik erken doğan hücre sınıflar 7 şartname düzenleyen genleri tanımlamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, NIH R01EY020560-01 ve WM Keck Tıp Araştırma Ödülü Genç Bilim İnsanı tarafından finanse edildi. Yazarlar retina hazırlıkları ve enjeksiyonlar görüntüleme sırasında Joseph Bedont yaptığı yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-039 | N/A |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | N/A |
| Sodium Acetate | JT Baker | 3470-05 | 3 M stock |
| Fast Green FCF | Fisher Scientific | BP123-10 | 10 % stock |
| Isopropyl alcohol prep | Tyco Healthcare, Covidien | 6918 | N/A |
| 30-guage needle | Terumo Medical Corp. | SG2-3013 | N/A |
| Exmire microsyringe | Ito Corporation | MS*E05 | N/A |
| Tweezertrode (tweezer electrode) | BTX Technologies | 522 | N/A |
| Electro Square Porator (electroporator) | BTX Technologies | ECM 830 | N/A |
| O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | N/A |
References
- Neumann, E., Rosenheck, K. Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10, 279-290 (1972).
- Turnbull, R. J. Letter: Letter: An alternate explanation for the permeability changes induced by electrical impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 14, 193-196 (1973).
- Zimmermann, U., Schulz, J., Pilwat, G. Transcellular ion flow in Escherichia coli B and electrical sizing of bacterias. Biophys. J. 13, 1005-1013 (1973).
- Kinosita, K., Tsong, T. Y. Voltage-induced pore formation and hemolysis of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 471, 227-242 (1977).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-845 (1982).
- Swartz, M., Eberhart, J., Mastick, G. S., Krull, C. E. Sparking new frontiers: using in vivo electroporation for genetic manipulations. Dev. Biol. 233, 13-21 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 16-22 (2004).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 1027-1032 (2007).
- Onishi, A. Pias3-dependent SUMOylation directs rod photoreceptor development. Neuron. 61, 234-246 (2009).
- Onishi, A. The orphan nuclear hormone receptor ERRbeta controls rod photoreceptor survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 11579-11584 (2010).
- Kim, D. S. A Core Paired-Type and POU Homeodomain-Containing Transcription Factor Program Drives Retinal Bipolar Cell Gene Expression. J. Neurosci. 28, 7748-7764 (2008).
