الماوس Microinjection سيت ، والنضج وتقييم الصيغة الصبغية

Summary

البويضات عرضة لعدم توازن الصبغيات بسبب أخطاء في العزل الصبغي خلال نضوج الانتصافي. البيض يمكن أن تسبب العقم مختل الصيغة الصبغية ، والإجهاض ، أو اضطرابات النمو مثل متلازمة داون. هنا ، نحن تصف طرق لإدخال المواد المختارة في البويضات وأساليب لدراسة وتقييم النضج الانتصافي الصيغة الصبغية.

Abstract

أخطاء في العزل الصبغي تؤدي إلى خلايا مختل الصيغة الصبغية. في الخلايا الجسمية ، ويرتبط مع سرطان ولكن عدم توازن الصبغيات في الأمشاج ، عدم توازن الصبغيات يؤدي الى الاجهاض والعقم أو اضطرابات النمو مثل متلازمة داون. الأمشاج فرداني النموذج من خلال أنواع محددة من البرامج الإنمائية التي تقترن إلى الانقسام الاختزالي. دوري الدرجة الاولى الانتصافي (MI) هي فريدة من نوعها لأن الانقسام الاختزالي تظل تعلق شقا الصبغي المتآخيان بينما يتم فصل الكروموزومات المتماثلة. لأسباب غير مفهومة تماما ، وهذا التقسيم هو reductional عرضة للأخطاء والأكثر شيوعا هو مصدر عدم توازن الصبغيات من الأخطاء في الانقسام الاختزالي الثاني (MII) أو من أخطاء في الانقسام الاختزالي ^1،2 الذكور.

في الثدييات ، في الطور الأول اعتقال البويضات من MI مع حويصلة كبيرة ، جرثومي سليمة (GV ؛ النواة) واستئناف الانقسام الاختزالي فقط عندما تتلقى إشارات التبويض. يستأنف الانقسام الاختزالي مرة واحدة ، البويضات MI الكامل والخضوع لانقسام الخلايا غير المتماثلة ، واعتقلت مرة أخرى في الطورية صناعة المعلومات. وسوف يتم إكمال MII البيض حتى يتم تخصيبها من قبل الحيوانات المنوية. البويضات يمكن أيضا أن يخضع نضوج الانتصافي باستخدام أنشئت في ظروف المختبر الثقافة ^3. لأن جيل من المسوخ الماوس المعدلة وراثيا والجينات المستهدفة ، غير مكلفة ويمكن أن يستغرق فترات طويلة من الزمن ، والتلاعب في الأمشاج الإناث في المختبر هي استراتيجية أكثر اقتصادا وتوفير الوقت.

هنا ، نحن تصف وسائل لعزل الطور الأول اعتقال البويضات من الفئران وmicroinjection. ويمكن إدخال أي مواد من خيار في البويضة ، ولكن لأن meiotically - المختصة البويضات صامتون transcriptionally كرنا ^4،5 ، وليس الحمض النووي ، يجب أن يتم حقنه للدراسات التعبير خارج الرحم. لتقييم الصيغة الصبغية ، ونحن لدينا وصف الظروف في نضوج البويضات في المختبر من البيض MII. تاريخيا ، تستخدم كروموسوم نشر تقنيات لفرز عدد الكروموسوم ^6. هذا الأسلوب يمثل تحديا تقنيا ويقتصر على تحديد hyperploidies فقط. هنا ، نحن تصف طريقة لتحديد قصور وhyperploidies باستخدام بويضات سليمة ^7-8. يستخدم هذا الأسلوب monastrol ، مثبط kinesin - 5 ، أن تنهار المغزل المغزل القطبين إلى القطب ⁹ فصل الصبغيات (الكروموسومات) وبالتالي يمكن بسهولة أن مثل هذه kinetochores الفردية يتم الكشف عن وعدها باستخدام المصل المضاد للCREST الذاتية. لأن يتم تنفيذ هذه الطريقة في البيض على حالها ، لا تضيع الكروموسومات بسبب خطأ المشغل.

Protocol

1. بويضة فأرة جمع

1. لزيادة عدد بصيلات غاري معزولة عن بعضها الماوس ، intraperitoneally حقن الفئران الإناث ناضجة جنسيا (نستخدم 6 أسابيع من العمر CF - 1 الفئران من هارلان) مع 5 وحدة دولية من المصل جونادوتروبين فرس الحامل (PMSG).
2. إعداد جمع المتوسطة (MEM / PVP) (3 مل / الماوس) وذلك بإضافة إلى 2.5 ميكرومتر milrinone ودافئة أنه في 37 درجة مئوية. Milrinone هو المانع فسفودايستراز التي تحافظ على اعتقال الانتصافي مرة تتم إزالة البويضات من الحويصلات. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام - 3 - 1 - الاستيوفينون بالميثيل (IBMX) (0.2 مم) أو الأدينوزين الحلقي dibutyryl - الأدينوساين (dbcAMP) (100 ميكروغرام / مل). تحضير مستنبت بإضافة الجلوتامين (1 ملم) وmilrinone (2.5 ميكرومتر) إلى 1 مل من CZB والسماح لها للتوازن في الحاضنة لمدة ساعة على الأقل. إعداد microdrops كل في طبق بتري وتراكب مع الزيوت المعدنية. يوضع الطبق في حاضنة CZB بينما طبق MEM / PVP يبقى خارج على الشريحة الأكثر دفئا. وهناك أيضا مجموعة أخرى والمتوسطة الثقافة المتوفرة تجاريا (M2 و M16 من وسائل الاعلام المتخصصة أو سيجما) تستخدم بشكل روتيني.
3. حوالي 48 ساعة بعد PMSG فتيلة ، والتضحية الماوس باستخدام التخدير CO ₂ تليها خلع عنق الرحم ، وتشريح المبيض ووضعها في watchglass تحتوي مسبقا تحسنت MEM / PVP + milrinone (MEM / PVP + M).
4. استخدام حقنة الانسولين مل 1 ، مرساة المبيضين على الطبق والإفراج عن بصيلات غاري بواسطة ثقب لهم عدة مرات مع مقياس - 27 (أو الخياطة) الإبر التي يتم تثبيتها معا.
5. بينما يبحث من خلال مجهر تشريح ، وجمع الركام ، باستخدام بويضة المجمعات التي تديرها الفم ماصة الزجاج. ومن المفيد أن يكون المجهر مع الكثير من التباين. بدلا من ذلك ، يمكن pipetted المتوسط ​​تحتوي على الأنسجة والخلايا على لغطاء طبق بيتري البلاستيك. جمع كبير فقط ، وليس بصيلات غاري أصغر قبل الجريبات الغارية أو البويضات الجرداء. جمعها مرة واحدة ، ونقل إلى أحد المجمعات microdrop من M + MEM / PVP موجود على الشريحة الأكثر دفئا وتحت النفط.
6. باستخدام ماصة صغيرة (أكبر قليلا من قطر البويضة) ، ماصة صعودا وهبوطا في المجمعات لفصل الخلايا الركامية. نقل البويضات المعراة مع أكبر ماصة الى microdrop من CZB milrinone + (M + CZB) ووضعه في الحاضنة.
7. تسمح البويضات لاسترداد ما لا يقل عن 1 ساعة في الحاضنة السابقة للتلاعب.

2. البويضة microinjection

1. جعل ماصات حقن عن طريق سحب الزجاج البورسليكات الأنابيب الشعرية في مجتذب الميكانيكية. نستخدم يلهب براون micropipette مجتذب (النموذجي P - 97) مع الإعدادات التالية : P = 500 ، الحرارة = 300 ، سحب = 150 ، فيل = 100 ، الوقت = 150.
2. إعداد النظام الأساسي microinjection عن طريق وضع قطرة 5 ميكرولتر من M + MEM / PVP أقرب وقت ممكن إلى انخفاض 0.5 ميكرولتر من المواد حقن الاختيار (مثل سيرنا ، كرنا ، morpholino قليل النوكليوتيد ، الخ) على شريحة الغرفة 1 - جيدا أن لديه غرفة وسائل الاعلام إزالتها. غلاف مع الزيوت المعدنية ومكان على المسرح المجهر (الشكل 1).
3. حقن مكان وماصات عقد في وأصحاب الموقف في قطرة م + MEM / PVP بدوره على خزانات النتروجين التي ترتبط إلى picoinjector والجدول مضادة للاهتزاز. فتح غيض من ماصة الحقن بالضغط بلطف ضد ماصة في حين عقد ملئه مع المتوسط. إذا كانت الفتحة كبيرة جدا ، فإن متوسط ​​الدخول والخروج بسرعة والإبرة سوف تقتل الخلية. مع ماصات صغيرة جدا من الانفتاح في كثير من الأحيان تسد بسهولة.
4. نقل البويضات (5-10) من الحاضنة إلى الانخفاض MEM / PVP M + على المنصة. قبل عن طريق الحقن ، والإعداد لpicoinjector. نحن نستخدم المعايير التالية على موقعنا picoinjector (النموذجي PLI - 100 جهاز من جامعة هارفارد) : PBal = 2،5-3،5 رطل ، PInj = 7.8 رطل ، 3S = = 10-12 رطل PClear والوقت. هذه النتائج في حجم حقن PL 5-10.
5. بينما تضغط CLEAR ، حرك إبرة الحقن إلى انخفاض المواد والتعبئة. إعادتها إلى انخفاض المتوسط.
6. استخدم ماصة عقد لالتقاط البويضة وحقن ابرة محاذاة ، البويضة وعقد ماصة على طول محور س.
7. تحت التكبير العالي ودفع ماصة حقن البويضة من خلال الحرص على تجنب النواة. مرة واحدة اخترقت غشاء البلازما ، اضغط تحقنوا. بعد الحقن ، وسحب الإبرة. الافراج عن البويضة وتكرار. مرة واحدة يتم حقن جميع البويضات ، والعودة بهم إلى الحاضنة. عقد في CZB + M للمبلغ المطلوب من الزمن ، هذه المرة يتوقف على الهدف التجريبية (أي سيرنا وضربة قاضية morpholino (تصل إلى 24 ساعة) ، overexpression (12/03 ح)). يرجى ملاحظة أن حضانات أطول من 24 ساعة وسطا نضوج الانتصافي.

3. نضوج البويضة

1. بعد غسل حضانة البويضات من خلال عدة قطرات من CZB (متوسطة النضج) ونقل إلى microdrop متوسطة النضج تحت النفطية ووضعه في الحاضنة.
2. 16 ساعة للسماح ر النضج الكامل س الطورية الانقسام الاختزالي الثاني.

4. تحليل الصيغة الصبغية

1. إعداد CZB + monastrol (100 ميكرون) ومكان 750 ميكروليتر إلى البئر من هيئة الثقافة الذي طبق الماء في المحيط الخارجي.
2. غسل البيض من خلال عدة قطرات من CZB + monastrol ونقلها إلى الجهاز طبق الثقافة. مكان في حاضنة للح 1
3. إصلاح البيض بنقلهم الى watchglass بارافورمالدهيد تحتوي على 2 ٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل إلى أخرى watchglass مع حجب الحل. ويمكن تخزين هذا الطبق في 4 درجات مئوية حتى معالجتها.
4. نقل إلى حل permeabilization (PBS + 0.3 ٪ + TritonX BSA - 100 0.1 ٪ + 0.02 ٪ نان ₃₎ في watchglass لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. شطف كميات كبيرة من خلال العديد من عرقلة الحل (PBS + 0.3 ٪ + 0.01 توين BSA - 20 + 0.02 ٪ نان _3).
5. يتم تنفيذ بقية الإجراء على غطاء لوحة 96 - جيدا في غرفة ترطيب في درجة حرارة الغرفة والتي تكون محمية من الضوء. يتم وضع قطرات (~ 25 ميكرولتر) داخل الفتحات الدائرية. نقل البيض إلى عرقلة حل لمدة 15 دقيقة.
6. لcentromeres التسمية ، نقل البيض إلى قطرة من محلول يحتوي على حجب CREST المصل المضاد في 01:40. احتضان ما لا يقل عن 1 ساعة. تغسل من خلال 3 قطرات من محلول حظر تفرخ في كل 15 دقيقة.
7. نقل البيض إلى قطرة من محلول يحتوي على حجب أو Cy5 اليكسا - 594 - ثر ، مترافق المضادة للمفتش الإنسان (1:200) ، واحتضان ل1H. تكرار الغسيل الخطوات المذكورة أعلاه ما عدا الخطوة الأخيرة ، وتشمل Sytox الأخضر (1:5،000) في عرقلة الحل للكشف عن الكروموزومات. جبل في 5 ميكرولتر من Vectashield. لمنع تكسير البيض ، وطرح 4 بقع صغيرة من الفازلين في زوايا حيث سيتم ساترة. ساترة وضع على رأس وختم بطلاء الأظافر. مخزن في مربع شريحة في 4 درجات مئوية حتى عبر تجهيز المجهري متحد البؤر.
8. في حين التصوير مع هدف 100X ، والتقاط 0.4 ميكرومتر الخطوات في Z - الطائرة وصورة المنطقة برمتها من المغزل الطورية. العد centromeres باستخدام برنامج مثل التصوير J صورة (NIH).

5. ممثل النتائج :

الرقم 2 هو الإسقاط Z - من البيض سوي الصيغة الصبغية. الطورية في صناعة المعلومات ، والبيض ، تحتوي الماوس سوي الصيغة الصبغية 20 زوجا من الصبغيات (الكروموسومات) وبالتالي centromeres 40. أحيانا تفشل الكروموسومات لنشر monastrol على الرغم من العلاج. هذا الوضع يجعل من الصعب إحصاء موثوق centromeres وبالتالي فإننا لا تشمل هذه البويضات في تحليلاتنا. أحيانا ، قد يكون تحديا لتحديد ما إذا كان CREST - مناعيا "بقعة" هو 1 أو 2 centromeres. استخدام برامج مثل J صورة مفيد لأن المرء لا يستطيع تحليل كل Z - القسم بينما تلاحظ بعناية التوجه للكروموسومات ، وعدد من المقاطع التي تم الكشف عن "بقعة" وكثافة بكسل "النقاط" لديك. تبعا حيث تم وضع المغزل الانتصافي النسبية للجسم القطبية ، يمكن للمناطق تداخل الحمض النووي ، وينبغي ألا تكون هذه العينات المدرجة في التحليل.

Unmanipulated ، في بيض من الفئران الحية مبيض التناسل الشباب وانخفاض معدلات اختلال الصيغة الصبغية (~ 1-2 ٪). ومع ذلك ، يمكن لأسباب غير مفهومة ، microinjection والنضج في إجراءات زيادة هذا المختبر صعودا بنسبة 10 ٪. لذا ، فمن الأهمية بمكان أن يتم تضمين البويضات يحقن في أي دراسة microinjection.

الشكل 1. طبق Microinjection اقامة. شريحة الغرفة مع 5 قطرات ميكرولتر من MEM / PVP + M فقط فوق 0.5μl قطرات من محلول الحقن. مع تغطية الزيوت المعدنية. في هذا المثال هناك 3 قطرات لمدة 3 حقن الحلول المختلفة وشرائح يجلس على مرحلة المجهر. إلى اليسار هو إبرة microinjection والحق هو ماصة القابضة. علما بأن هناك انعكاس لأصحاب الإبرة.

الشكل 2. الصيغة الصبغية النتائج. A - Z إسقاط بيضة سوي الصيغة الصبغية الثاني الطورية. هو اللون الأخضر في الحمض النووي وkinetochores الملونة باللون الأحمر. الأسهم تشير إلى الأسلحة 2 الكروماتيدات متميزة مشيرا الى ان kinetochores (# # 17 و 18) التداخل. البيض يحتوي الماوس سوي الصيغة الصبغية 20 زوجا kinetochore (40 الإجمالي "بقع"). مختل الصيغة الصبغية وبيضة تحتوي على أي تغيير على هذا الرقم. إذا أجريت هذا الإجراء على البويضات MI الطورية ، سيكون هناك 40 زوجا kinetochore (80 الإجمالي "بقع").

الجدول 1. وصفة لجمع والمتوسطة microinjection (MEM / PVP + M). جميع المواد الجنين ، والرتبة ، والثقافة من سيغما الدريخ. التصفية من خلال مرشحات تعقيم PVDF 0.22μm (نستخدم Stericups Milipore) وتخزينها في 4 درجات مئوية.

iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "بديل =" الجدول 2 "/>
الجدول 2. وصفة لCZB المتوسطة. جميع المواد الجنين ، والرتبة ، والثقافة من سيغما الدريخ. التصفية من خلال مرشحات تعقيم PVDF 0.22μm (نستخدم Stericups Milipore) وتخزينها في 4 درجات مئوية.

Discussion

Microinjection من البويضات وسيلة قوية لدراسة الآليات التي تنظم نضوج الانتصافي ^{10،11 ، 12 ، 13.} هذا الأسلوب يوفر وسيلة اقتصادية لاختبار الفرضيات قبل اتخاذ أي استثمار كبير في تطوير نماذج الماوس المعدلة وراثيا وهادفة. جمع البويضة وتقنيات microinjection تتطلب المزيد من الوقت لاتقان نموذجية من الإجراءات بيولوجيا الخلية. عقبات محددة في مجال جمع وغالبا ما تشمل السيطرة على ماصة الفم ، وسحب الزجاج ماصة الحجم المناسب لجمع وتجريد من الخلايا الجسدية ، وزيادة سرعة جمع لتقليل الوقت الذي يتم البويضات خارج الحاضنة. نوصي ممارسة عدة مرات قبل القيام بتجارب. نقل البويضات بين microdrops مع الحفاظ على نفس العدد من الخلايا هو وسيلة رائعة لتصبح مريحة مع هذا الأسلوب.

موت الخلية يحدث عادة حين تعلم microinjection. يمكن أن يحدث هذا لعدد من الأسباب ، بما في ذلك ضخ كبيرة جدا من حجم المواد (أي فتح إبرة حقن كبيرة جدا) ، لتصل إلى النواة مع إبرة الحقن ، وثقب في الجانب الآخر من البويضة ، أو أن حقن مادة هي سامة بالنسبة للبويضة. مع ممارسة حقن العازلة في البويضات معدل حسابك حتى البقاء على قيد الحياة 50 ٪ على الأقل هو المفتاح لاتقان هذه التقنية. إذا فشل البويضات الناضجة فمن المحتمل أن لا تضعف milrinone بما فيه الكفاية. نوصي بدهن البويضات من خلال العديد من قطرات كبيرة milrinone خالية CZB قبل النضج.

تحليل الصيغة الصبغية التالية microinjection هي واحدة من العديد من فحوصات لتقييم النضج الانتصافي. التحليلات الروتينية الأخرى التي نستخدمها في المختبر وتشمل رصد حركية التي تقدم من خلال الانقسام الاختزالي البويضات ، المناعي لتحليل تشكيل المغزل والمحاذاة كروموسوم وتفعيل البيض أو التخصيب في المختبر لتقييم الآثار التنموية للتلاعب البويضة ^{14،15 ، 16 ، 17.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of specific reagents:
Milrinone	Sigma-Aldrich	M4659	Resuspend in DMSO at 2.5mM
Mineral oil	Sigma-Aldrich	M5310	Only use embryo-tested, sterile-filtered
CREST autoserum	Immunovision	HCT-0100
Sytox Green	Invitrogen	57020
Anti-human Alexa 594	Invitrogen	A-11014
Vectashield	Vector Laboratories	H-100
Paraformaldehyde	Polysciences, Inc.	577773
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A3294
PMSG	Calbiochem	367222
Monastrol	Sigma-Aldrich	M8515	Resuspend in DMSO at 100mM
Tween-20	Sigma-Aldrich	274348
TritonX-100	Sigma-Aldrich	X-100
Table of specific equipment:
Mouthpiece	Biodiseno	MP-001-Y
Watchglass	Electron Microscopy Sciences	70543-30
Syringe	BD Biosciences	309623	1ml, 27G1/2
60 mm Petri Dish	Falcon BD	351007
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-200
Side warmer	Fisher Scientific		Any standard model
Dissection microscope			Any standard model
Chamber Slide	Nalge Nunc international	177372
Capillary Tubing	Drummond Scientific	1-000-0500	microcaps
Pipette Puller	Flaming-Brown micropipette puller		Model P-97
Inverted microscope	Nikon Instruments		Any standard model
Micromanipulators	Eppendorf		Any standard model
Picoinjector	Harvard Apparatus	Model PLI-100	Any standard model
CO2 tanks			For incubator
N2 tank			For table and injector
Anti-vibration table	Technical Manufacturing Corp.		Any standard model
Incubator			Any standard model
Holding pipettes	Eppendorf	930001015	Vacutip
Confocal microscope	Leica Microsystems		Any standard model
Dissection tools	Fine Science Tools		Any standard model
Humidified chamber			We use tupperware
Lid of 96 well plate	Nalge Nunc international	263339
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-3
Coverslips	Thomas Scientific	6663-F10	Thickness will vary for particular microscopes
Center well organ culture dish	Fisher Scientific	353037	60 X 15mm