时间推移显微镜早期胚胎发育线虫

Summary

本文介绍的线虫胚胎发育的早期事件的可视化技术

Abstract

线虫经常被用来作为一个模型系统在早期发育过程的研究。的胚胎，遗传资源，以及转型相对容易的透明度，是素质，使 C。 线虫早期胚胎发育的很好的模型。基于激光共聚焦显微镜和荧光标记的标签，使研究人员能够遵循在胚胎发育的特定细胞的结构和蛋白质。例如，可以按照特定的细胞器，如溶酶体或线粒体，用荧光标记的染料。这些染料可以早期胚胎显微注射的方式进入成年性腺。此外，使用荧光蛋白标记，可以遵循的特定蛋白质的本地化。例子是这里展示了使用一种荧光溶酶体染料以及荧光标记的蛋白和泛素蛋白。标记的组蛋白是用于可视化的DNA，从而确定细胞周期的阶段。 GFP标记的泛揭示了泛素囊泡在早期胚胎的动态。标记的溶酶体和GFP观察：泛可用于确定是否存在泛素泡和溶酶体的共定位。一个溶酶体染料显微注射技术。用于发电transgenenic株的技术（1，2）。成像，胚胎切割出成人的雌雄同体的线虫，并安装到2％琼脂糖凝胶垫的时间推移在一个标准的激光扫描共聚焦显微镜或旋转盘共聚焦显微镜显微镜。这种方法提供的早期胚胎发育的高分辨率可视化。

Protocol

1。线虫文化

1. 获取适当的C.线虫线虫遗传学联合中心（CGC）或从同事的应变。
2. 生长在NGM琼脂板OP50细菌草坪种子（3）线虫。分析的GFP株生长在25 ° C是建议。
3. 显微镜实验前的一天，到种子板块中挑选至少40 L4幼虫板放置在25 ° C过夜。这些蠕虫将实验的青壮年。

2。注射

如果是可取的观点，如溶酶体或线粒体的结构，成年人可以注射用荧光染料，以可视化之前。

1. 准备干琼脂糖注射垫。 （这可以是一个多天前）
   1. 准备在水熔化的2％琼脂糖。巴斯德吸管套上一个22X54毫米玻璃罩2滴。跨明智的下降顶部放置另一个玻璃罩。为了达到适当的厚度，按顶部的玻璃罩，直到垫的直径约为1.5厘米。让我们坐5-10分钟。
   2. 卸下顶部玻璃罩。 80 ° C烘箱中放置1小时，脱水琼脂糖垫或允许坐在台式过夜。
2. 准备Mitotracker或Lysotracker解决方案。
   1. 在鸡蛋缓冲稀释荧光剂。我们通常使用Mitotracker或Lysotracker的1:10稀释。
   2. 注射针是由1.2外径玻璃毛细管。将注射针头，用针拉马。
   3. 使用拉Pastuer吸管回填土用稀释后的染料的针头。
   4. 在轻，直到用湿盒放置针。
3. 预喷射：设立显微镜和针。
   1. 装载到注射针注射器具。我们的设备是一个Narishige直接驱动显微操纵器，安装到与DIC的成像能力配备了尼康TE200倒置显微镜阶段。
   2. 针连接的压力调节器连接到一个1.2 mm内径管。无论是压缩空气或氮气，可用于外部压力源。设置调节到20-25 PSI。
   3. 重矿物油（石蜡油）滴放置2到注射垫。
   4. 注射垫放到显微镜和更低的进油针。检查从针确保流体流动自由，当施加压力时，。应用注射压力，并观察是否流体流动的针。如果没有，你需要轻轻挣脱针年底。可破针，轻轻推入注射垫放在破玻璃罩的一个小一点的提示。针后是流动的，移动到下一个步骤。
4. 注射。
   1. 大约1个小时前观看胚胎转移到注射垫滴油年轻的成虫。执行此转让，使用解剖显微镜。使用铂丝尖为转移蠕虫与蠕虫挑。
   2. 排列3 - 10蠕虫，使他们直接躺在垫。注射，这是最简单的，如果蠕虫一字排开彼此平行，相隔一个蠕虫病毒长度略小于。一旦蠕虫注射垫，重要的是，迅速开展工作，完成注射的过程中，蠕虫灭亡前从干燥。
   3. 放置到注射显微镜显微镜阶段的蠕虫的玻璃罩。集中到中央部分的远端性腺管（脊柱）。然后利用显微操纵器移动到同一焦平面针尖。移动阶段的水平，使蠕虫病毒是通过针头刺破。一旦针尖脊柱内，施加压力，使性腺，以填补与染料混合物。注射注射垫所有蠕虫的两个性腺武器。
   4. 注射后，用一把拉住巴斯德吸管，提供约0.5毫升蛋缓冲区蠕虫。这将让他们死于脱水，并让他们从注射过程中收回。
   5. 允许蠕虫在室温下1-2小时的恢复，在光，湿盒。

3。琼脂糖观看胚胎垫

1. 鸡蛋中的缓冲区准备熔化的2％琼脂糖。
2. 用巴斯德吸管，把3滴熔化琼脂糖到一个干净的显微镜幻灯片。
3. 将幻灯片之间有两个标签磁带覆盖一层其他幻灯片。这些作为，这将确保您的琼脂糖凝胶垫是正确的厚度的垫片。
4. 垂直下降到琼脂糖滴放置一个二次清洁的显微镜幻灯片。向下按，直到顶部的幻灯片指南幻灯片的磁带在于。
5. 就在你准备安装观察胚胎，删除顶部的幻灯片。

1. 如果没有被注入蠕虫，请按照下面的两个步骤。否则，跳过它们。
   1. 板的前一天，准备选择年轻的成虫。你应该能看到里面的青壮年胚胎。
   2. 选择到非种子选手NGM板5-20蠕虫。允许蠕虫几分钟抓取周围的非种子选手板，使蠕虫就会失去大部分被卡住他们的细菌。
2. 获得成虫的幼胚
   1. 将一个鸡蛋缓冲区5-20μL在一个18毫米的玻璃盖玻片（盖玻片厚度1.5是可取的）的中间下降。
   2. 将产蛋缓冲区下降到蠕虫的非种子选手板或注射垫。
   3. 削减了26号皮下注射针头的开放蠕虫。剖开外阴附近的蠕虫。您应该看到胚胎溢出的蠕虫病毒。
3. 安装到显微镜玻片
   1. 倒置显微镜幻灯片，准备用琼脂糖垫，降低到与胚胎玻璃罩。
   2. 如果需要延长时间的推移，用凡士林密封的玻璃罩的边缘，以防止dessication。

5。显微镜

1. 寻找合适的胚胎。
   1. 将滑入显微镜阶段。 10X镜头扫描，发现胚胎。
   2. 要发现早期阶段的胚胎，搜索完成产妇减数分裂过程中的胚胎。减数分裂的胚胎可以区分从以后的胚胎，因为他们没有经历缩短。 （胚胎完成减数分裂后，你可以看到一个很大的差距之间的细胞膜和前年底的蛋壳。）
   3. 一旦你确定了一个适当上演胚胎，将胚胎发育的记录到一个更高的放大倍率的镜头。
2. 成像
   1. 在这个例子中，我们想象胚胎中表达mCherry：H2B和GFP：泛素标记的蛋白质。我们正在使用的蔡司LSM700传统的激光扫描显微镜。
   2. 使用63X 1.4NA透镜收集图片。 488和555激光器是用最小的激光功率和最大增益。排列堆栈是收集每10-15秒。根据漂白程度，收集30-60时间点。 ž堆栈的图像被折叠成一个最大的最后时间推移视频投影图像。

6。代表性的成果：

图1施肥C.第一次有丝分裂。 线虫。

图2。显微注射过程。

补充视频1视频定时的GFP。泛加Lysotracker在减数分裂胚胎蓝点击这里观看视频。

Discussion

与精子的融合后，受精卵经过一系列的动态活动。这些事件从一个相对静止的细胞进入迅速发育中的胚胎卵母细胞转化。在许多生物体中，细胞质重排，建立胚胎极性和卵子激活的关键。 c. 在线虫胚胎提供了一个极好的机会观察这些卵激活和胚胎发育的早期事件。胚胎是透明的和早期发育的事件时有发生较快，施肥后C。 线虫的研究人员已经产生了许多有用的表达荧光标记的蛋白在早期发展的转基因株系。与RNA干扰或突变一起使用这些菌株提供了一个功能强大的系统解剖构成一个多细胞生物体的发展（5，6，7，8）的分子途径。此视频文章介绍了一种实用的方法，使用这些工具和技术， 在 C早期胚胎发育过程中记录事件线虫。

成熟的C。线虫的卵母细胞在减数分裂前期我被捕和成人雌雄同体精囊受精。受精后，卵母细胞通过减数分裂I和II的其余部分的收益。使用荧光标记的组蛋白H2B（5），可以观察到这些阶段。在完成产妇减数分裂，精子DNA仍然简明（见图1）。完成减数分裂后，母亲和父亲的DNA变得decondensed和两个原核的形成。产妇的原核迁移对父亲的原核和他们一起加入胚胎中心附近。有丝分裂原核会议后很快随之而来。所有这些事件都发生在不到一个小时。因此，时间推移，这一系列事件的显微镜可以很容易地完成。执行这一技术需要一定线虫培养以及除了访问共聚焦显微镜的基本显微镜技能的设施。

这里介绍的例子，采用了转基因C 。 线虫应变表示两个荧光蛋白，绿色荧光蛋白：泛素和mCherry：H2B 。共聚焦激光扫描显微镜是用来观察的这两种蛋白质的动态定位。此外，我们注射荧光标记Lysotracker，可以被用来追踪溶酶体在受精后的胚胎的命运。一个标记跟踪的注入，也可以进行可视化的线粒体或局部的钙离子浓度（9）。从理论上讲，可用于注射协议，以查看任何类型的荧光标记分子在胚胎。这可能包括标记的小分子，蛋白质，脂类等在某些情况下，它可能没有必要的，以实际注入蠕虫将很容易地摄取一些，如mitotracker（10）染料标记跟踪。不过，我们已经尝试浸泡和lysotracker注射，发现注射胚胎中的可视化效果好得多。

技术方面的考虑：

此过程中提出的技术挑战，包括显微注射技术，以及在成像的难度非常早期胚胎。关于microinjections，琼脂糖注射垫的厚度是注射成功的关键。如果垫太厚，蠕虫将dessicate和迅速死亡。如果垫太薄，蠕虫将不沾垫在注射过程中。

早期胚胎，可敏感的环境条件，如温度和缓冲条件。野生型的胚胎应主动decondensation分钟左右内完成减数分裂II（4）精子DNA和原核迁移。在20分钟内，应开始第一次胞质。如果胚胎有机会接触到非常高的激光强度或过热或粉碎过程中安装，这个过程可能被打乱。这些胚胎将被逮捕的发展。如果发生这种情况，应反复实验与激光功率下降或较厚的琼脂糖凝胶垫。

线虫胚胎不分泌，直到受精后不久，他们的蛋壳。在施肥和蛋壳分泌之间的时间短，胚胎是没有生命力的母亲（11）之外。一些实验室成像在子宫内的胚胎（5，12）避免了这一挑战。成像在子宫内提供了一定的优势，如能够捕获期间或刚受精后发生的事件。然而，这项技术要求，允许深部组织成像显微镜系统的使用。如双光子或多光子系统特别适合于本（13，14）。当使用一个激光扫描或旋转盘共聚焦显微镜，最好的图像是从胚胎获得的常规，医管局已经减少成虫此处所述。

成像系统的注意事项：

共焦成像系统的类型取决于用户的需求。在一般情况下，激光扫描系统的建议，如果希望获得尽可能高的分辨率的图像。另一方面，旋转盘系统更适合于成像高度动态的过程，图像采集较快和漂白/光毒性降低。

具体的成像参数会有所不同取决于的实验设计和共焦成像系统。在多维成像，一个需要考虑的渠道，焦平面，并正在收集的时间点。由于漂白和光毒性的限制作用，可以在任何给定的实验获得的图像数量有限。因此，如果您选择，以增加收购渠道的数量，您将可能需要减少焦平面和/或时间点，反之亦然。总数将可以采集到的图像成像，以及正在使用的共聚焦显微镜的敏感性的荧光强度的影响。更激烈的荧光基团和更灵敏的仪器，将需要更短的曝光时间，从而产生更少的光漂白和光毒性。

大量或成像系统。我们将给予已在我们自己的实验室中使用的系统的详细信息。对于旋转盘共聚焦显微镜成像蠕虫胚胎，我们使用尼康TE2000U倒置显微镜配备一个60X/1.4 NA计划阿婆目标。显微镜是连接到一个横河CSU10旋转的磁盘单元，一个滨松C9100 - 13 EM CCD摄像头，并与输出光谱的应用研究LMM5激光合并模块包含四个固态激光器，在405，491，561和655 nm的。使用这个系统，我们可以捕捉一个或两个通道，6到12个焦平面，和25到50个时间点（在30至60秒的时间间隔）。一个典型的曝光时间是100至200毫秒。

用激光扫描共聚焦显微镜成像胚胎中，我们使用的Zeiss LSM700配备了2通道和4个固态激光器（405，488，555和635 nm的）。一个计划阿婆63X/1.4NA用于胚胎成像的目标，这个系统连接到一个蔡司Axio上观察倒置显微镜。该系统利用图像采集蔡司ZEN的软件还提供了有限的图像处理和分析。与两个荧光成像时，我们通常收集1-5（〜0.5微米除了焦平面），并收集了Z堆栈每15秒。集合是继续，直到发生了显着的漂白。要产生最后的时间推移视频，Z轴堆叠图像综合ZEN的软件中使用的最大的投影工具。视频AVI文件的软件出口。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg Buffer			5mM Hepes pH 7.2, 110mM NaCl, 4mM KCl, 5mM Mg Acetate, 5mM CaCl2
Mitotracker	Invitrogen	M-7512
Lysotracker	Invitrogen	L-7525
Injection Capillary Pipet	Harvard Apparatus	GC120F-10
Needle Puller	Kopf Instruments	Model 700C
Microinjector Apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1 microinjection regulator