の初期発生のタイムラプス顕微鏡線虫（Caenorhabditis elegans）

Summary

この記事では、線虫の胚発生の初期のイベントの可視化のための手法について説明

Abstract

線虫は、しばしば初期の発達過程の研究におけるモデルシステムとして使用されています。胚の透明性、遺伝資源、および変換の相対的な容易さは、Cを作る資質です。初期胚発生のための優れたモデルは、 エレガンス 。レーザーベースの共焦点顕微鏡と蛍光標識タグは、研究者が胚に特異的な細胞の構造とタンパク質をフォローすることができます。例えば、一つは蛍光標識色素を使用して、そのようなリソソームやミトコンドリアなどの特定の細胞小器官を、従うことができます。これらの染料は、成体の生殖腺へのマイクロインジェクションにより初期胚に配信することができます。また、特定のタンパク質の局在は、蛍光タンパク質タグを使用して追跡することができる。例としては、蛍光リソソーム色素と同様に蛍光標識ヒストンとユビキチンタンパク質の使用例を示すここに表示されます。標識されたヒストンは、DNAを可視化するため、細胞周期の段階を識別するために使用されます。 GFP -タグ付きユビキチンは、初期胚でユビキチン化小胞のダイナミクスを明らかにする。ラベル付けリソソームとGFPの観察：：ユビキチンは、ユビキチン化さ小胞とリソソームとの間の共局在があるかどうかを判断するために使用することができます。リソソーム色素のマイクロインジェクションのための手法が提示されます。 transgenenic株を生成するための手法は（1、2）他の場所に表示されます。イメージングのために、胚は成体両性の線虫から切り取られており、標準的なレーザー走査型共焦点顕微鏡や回転するディスク共焦点顕微鏡でタイムラプス顕微鏡続いて2％アガロースパッドに装着。この方法論は、初期胚発生の高解像度可視化のために用意されています。

Protocol

1。線虫の培養

1. 適切なCを取得する虫は虫Caenorhabditis遺伝ストックセンター（CGC）からまたは同僚からの株。
2. OP50細菌の芝生（3）を接種したNGM寒天プレート上に線虫を成長する。 25 GFP株の成長の分析のため° Cを推奨します。
3. あなたの顕微鏡の実験前日には、シードのプレート上に少なくとも40 L4幼虫を選択し、℃で一晩25℃でプレートを置きます。これらのワームは、実験のための若年成人になります。

2。注射

それはそのようなリソソームやミトコンドリアなどの構造を表示することが望ましい場合、大人の可視化の前に蛍光色素を注入することができます。

1. 乾燥アガロースインジェクションパッドを準備します。 （これは事前に多くの日にかを行うことができます）
   1. 水に溶けた2％アガロースを準備します。パスツールピペットで22X54 mmのカバーガラスの上に2滴を置く。ドロップの上にクロス賢明な別のカバーガラスを置きます。パッドの直径が約1.5 cmであるまで、適切な厚さを達成するために、上部カバーガラスに押してください。 5〜10分放置します。
   2. トップカバーガラスを取り外します。 1時間80℃のオーブンでそれを配置することにより、アガロースのパッドを脱水または一晩ベンチに座ることができます。
2. MitoTrackerによりまたはLysotrackerの溶液を調製します。
   1. 卵のバッファに蛍光剤を希釈する。我々は通常、MitoTrackerによりまたはLysotrackerの1:10希釈液を使用してください。
   2. 注射針は、キャピラリー1.2 ODのガラスで作られています。ニードルプラーを使用して、注射針を引き抜きます。
   3. バック希釈染料で針を埋めるために引っ張らPastuerのピペットを使用してください。
   4. 使用するまで、光のない、加湿チャンバーに針を置きます。
3. プレインジェクション：顕微鏡と針を設定する。
   1. 射出装置に注射針をマウントします。私たちの装置は、DICイメージング機能を搭載したニコンTE200倒立顕微鏡のステージ上にマウントされているナリシゲダイレクトドライブマニピュレータです。
   2. 圧力調整器に接続されている1.2mmのID管に針を接続してください。圧縮空気または窒素のどちらかが外部の圧力源として使用することができます。 20から25 psiにレギュレータを設定します。
   3. 注射パッドの上に重鉱物オイルを2滴（パラフィン油）を配置します。
   4. 顕微鏡にインジェクションパッドを配置し、油に針を下ろします。圧力が印加されたときに流体が針から自由に流れることを確認してください。射出圧力を適用し、液体が針から流れ出すかどうかを観察。そうでなければ、そっと針の末尾を分割する必要があるでしょう。針が静かに注入パッド上に配置壊れたカバーガラスの小さなビットに先端を駆動することによって分けることができます。針が流れている後は、次の手順に進みます。
4. 注射。
   1. 前の表示胚へ約1時間、注入パッド上の油滴に若い成虫を転送する。解剖顕微鏡を使ってこの転送を実行します。ワームを転送するための尖った先端を白金線のワームのピックを使用してください。
   2. 彼らはパッドの上に直接横たわっているように、10ワーム - 3を手配する。注射の場合は、それが最も簡単ですワームは、互いに平行に並べられ、少し未満ワームの長さが離れて。されている場合ワームは、注入のパッドにしたらそれはすぐに仕事やワームは、乾燥から死ぬ前に、注入プロセスを完了することが重要です。
   3. 注入顕微鏡の顕微鏡ステージ上にワームでカバーガラスを配置。遠位生殖腺管の中央部（花軸）に焦点を当てる。その後、同じ焦点面に針の先端を移動するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。水平方向にワームが針によって穿刺されていることのステージを移動します。針の先端が花軸の内側になると、圧力を適用し、生殖腺は、染料混合物でいっぱいにすることができます。注射パッドの上に、すべてのワームの生殖腺両腕を注入する。
   4. 注入後は、ワームに卵バッファの約0.5mlを提供するために引っ張らパスツールピペットを使用してください。これは、脱水で死ぬからそれらを維持し、それらを射出手順から回復できるようになります。
   5. ワームは、光のない、加湿チャンバー内で室温で1-2時間で回復することができます。

3。胚を表示するためのアガロースパッド

1. 卵のバッファで溶融、2％アガロースを準備します。
2. パスツールピペットで、きれいな顕微鏡スライド上に溶融アガロースの3滴を入れて。
3. それらをカバーするテープにラベルを付けるの一つの層を持つ2つの他のスライドの間でスライドを配置。これらは、アガロースパッドが正しい厚さであることを保証するスペーサーとして機能する。
4. 垂直に下にアガロース滴上に第2のきれいな顕微鏡スライドを置きます。トップスライドがガイドのスライドからテープの上に物を置かないまで押し下げます。
5. あなたが観察するための胚をマウントする準備ができてちょう​​ど前に、上部のスライドを削除します。

1. ワームが注入されていない場合は、次の2つの手順に従ってください。そうでなければ、それらをスキップします。
   1. 前日に調製されたプレートからの若い成虫を選択してください。あなたは若い成人の内部に胚を見ることができるはずです。
   2. シーディングされていないのNGMプレート上に50から20までワームを選択してください。ワームは、それらにスタックしている細菌のほとんどを失うことになるようにワームが数分のためにシーディングされていないプレート上で約クロールすることができます。
2. 成虫から若い胚を入手する
   1. 18ミリメートル²ガラスのカバーガラス（1.5のカバーガラスの厚さが望ましい）の真ん中に卵のバッファの5-20液滴を配置。
   2. 卵バッファのドロップにシーディングされていないプレートまたは注射パッドからワームを移動します。
   3. 26ゲージの注射針で開いているワームをカット。外陰部の近くにワームを開いてカット。あなたは、胚がワームから水が漏れるはずです。
3. 顕微鏡スライド上にマウントする
   1. アガロースのパッドを用いて調製し、胚とカバーガラスの上にそれを下げていた顕微鏡のスライドを反転。
   2. 延長時間の経過が必要な場合は、dessicationを防ぐためにカバーガラスの端をシールするためにワセリンを使用してください。

5。顕微鏡検査

1. 適切な胚を見つける。
   1. 顕微鏡のステージ上にスライドを配置。胚を見つけるために10倍レンズをスキャン。
   2. 初期段階の胚を見つけるには、母体の減数分裂を完了する過程にある胚を検索してください。彼らは短縮を受けていないので、減数分裂の胚は、後に胚と区別することができます。 （胚の減数分裂を完了した後に、細胞膜と前端に卵の殻の間に大きな差を見ることができます。）
   3. 一度識別した適切な胚発生の記録のために高倍率のレンズに移動し、胚を上演。
2. イメージング
   1. この例では、我々はmCherryを表現胚を想像されています：：H2BとGFP：：Ubをタグ融合タンパク質。我々はツァイスLSM700従来のレーザー走査型顕微鏡を使用しています。
   2. 画像は63X 1.4NAレンズを使用して収集されます。 488と555レーザーは最小のレーザパワーと最大ゲインで使用されています。 AZのスタックは10〜15秒に収集されます。退色の程度に応じて30〜60時間のポイントが収集されます。 Zスタック画像は、最終的なタイムラプスビデオの最大投影画像に縮小されます。

6。代表的な結果：

図1 C言語で最初に有糸分裂への施肥エレガンス。

図2マイクロインジェクションの手順。

補足ビデオ1 GFPのタイムラプスビデオ：。。減数分裂胚におけるユビキチンプラスLysotrackerブルーは、 ビデオを表示するにはここをクリックしてください。

Discussion

精子との融合後、接合子は、動的な一連のイベントを受ける。これらのイベントは、急速に発展胚に比較的静的な細胞から卵​​母細胞を変換する。多くの生物で、細胞質の再編成は、胚の極性を確立し、卵の活性化にとって重要です。 C.線虫の胚は卵活性化および胚発生のこれらの初期の事象を観察するための素晴らしい機会を提供します。受精後に比較的急速に胚は透明であり、初期の発達のイベントが発生します。C.は虫の研究者が開発の初期段階に関与する蛍光標識タンパク質を発現する多くの有用なトランスジェニック系統を生成している。 RNAiまたは変異体と一緒にこれらの菌株を使用すると、多細胞生物（5、6、7、8）の開発の根底にある分子経路を解剖するための強力なシステムを提供します。このビデオの記事では、C言語の初期胚発生時にイベントを記録するために、これらのツールやテクニックを使用する実用的なアプローチを提示エレガンス。

成熟したC.虫の卵母細胞は、私は、減数分裂前期で逮捕され、成人の雌雄同体の貯精嚢に受精されています。受精後、卵母細胞が減数分裂IとIIの残りの部分を進行する。これらの段階は、蛍光標識ヒストンH2B（5）を用いて観察することができます。母体の減数分裂の完了時に、精子のDNAが凝縮されたままです（図1参照）。減数分裂の終了後、母親と父親のDNAが脱凝縮した二前核の形になります。母親の前核は父系の前核に向かって移行し、彼らは、胚の中央付近に合流する。有糸分裂は、すぐに前核の会議の後に陥ります。これらのイベントのすべては、時間未満で起こる。従って、この一連のイベントのタイムラプス顕微鏡を容易に行うことができます。この手法を実行すると、共焦点顕微鏡にアクセスするために加えて、線虫の培養で特定の施設だけでなく、基本的な顕微鏡のスキルが必要です。

ここに示す例では、トランスジェニックC.を利用：ユビキチンとmCherry：：：H2Bつの蛍光タンパク質、GFPを発現する線虫株 。共焦点レーザ走査型顕微鏡は、これらの2つのタンパク質の動的な局在を観察するために使用されます。さらに、我々は蛍光標識Lysotrackerの注入は受精後の胚におけるリソソームの運命を追跡するために使うことができることを示している。ラベルの付いたトラッカーの注入は、またミトコンドリアや地元のカルシウム濃度の可視化（9）のために行うことができます。理論的には、注入プロトコルは、胚の蛍光標識分子の任意のタイプを表示するために使用することができる。これは、いくつかのケースで標識した小分子、タンパク質、脂質、などが含まれる可能性がある、それはワームが取り込みなどMitoTrackerにより（10）などのいくつかの染料を容易に意志のように実際にラベルが付いたトラッカーを注入する必要はありません。しかし、我々は、浸漬とlysotrackerの注入の両方を試して、胚における可視化のための注射の方がはるかに良い結果を発見した。

技術的な考慮事項：

この手順で示した技術的な課題は、マイクロインジェクション法だけでな​​く、イメージングごく初期の胚の難しさなどがあります。 microinjectionsについては、アガロースインジェクションパッドの厚さは、成功した注射のための非常に重要です。パッドが厚すぎる場合、ワームはdessicateとすぐに死んでしまう。パッドが薄すぎると、ワームは、注入プロセス中にパッドに固執しません。

初期胚は、温度やバッファ条件などの環境条件に敏感であることができる。野生型の胚は精子のDNAと減数分裂II（4）完成の分程度で前核移行の脱凝縮を開始する必要があります。 20分以内には、まず細胞質分裂が開始する必要があります。胚は非常に高いレーザー強度にさらされているか、実装時の過熱または粉砕されている場合、このプロセスが中断されることがあります。このような胚は、開発を逮捕されます。この問題が発生した場合、実験は減少し、レーザパワーや厚いアガロースパッドで繰り返される必要があります。

C. elegansの胚は、すぐに受精後までは、卵の殻を分泌しない。受精と卵の殻の分泌との間の短い時間の間に、胚は母親（11）の外で実行可能ではありません。いくつかのラボでは子宮内でイメージング胚（5、12）で、この課題を避けている。 子宮内イメージングでは、そのような中、または単に受精後に発生するイベントをキャプチャする機能など、特定の利点を提供しています。しかし、この手法は、深部組織のイメージングを可能にする顕微鏡システムを使用する必要があります。このような二光子や多光子などのシステムは、特にこの（13、14）に適しています。従来のレーザースキャンまたは回転するディスク共焦点顕微鏡を使用する場合、最良の画像は、HAその胚から得られるここで説明するようにVE成虫から切り取られて。

イメージングシステムの考慮事項：

使用される共焦点イメージングシステムの種類は、ユーザーのニーズに依存します。保管したいが、可能な限り最高の解像度で画像を取得する場合、一般的に、レーザースキャニングシステムが推奨されています。一方、回転するディスクシステムは、より良い画像取得と画像処理、高度に動的なプロセスに適している比較的急速であり、退色/光毒性が低減されます。

特定の画像処理パラメータは、実験計画や雇用の共焦点イメージングシステムに応じて異なります。多次元イメージングでは、一つには、収集対象となるチャネル、焦点面、および時間点の数を考慮する必要があります。退色や光毒性の制限の影響により、画像の有限の数は、任意の実験で取得することができます。あなたが取得するチャンネル数を増やすことを選択した場合このように、、、おそらく焦点面および/または時間のポイントとその逆の数を減らす必要があります。取得できる画像の総数は、撮像される蛍光体の強度だけでなく、使用されている共焦点顕微鏡の感度に影響されるようになります。より強い蛍光体と、より敏感な楽器は、短い露光時間を必要とするため、少ない光退色や光毒性を生成します。

多数またはイメージングシステムが利用可能です。私たちは自分の研究室で使用されているシステムに関する詳細が得られます。ディスク共焦点顕微鏡を回転させて画像のワームの胚では、プランアポ目的をNA 60X/1.4を搭載したニコンTE2000U倒立顕微鏡を使用してください。顕微鏡は、横河電機CSU10回転するディスクユニット、浜松C9100 - 13 EM CCDカメラ、および405、491、561および655 nmでの出力を持つ4つの固体レーザを含むスペクトル応用研究LMM5レーザーマージモジュールに接続されています。このシステムを使用して我々は、1つまたは2つのチャンネル、六から一二焦点面、および25から50タイムポイントを（30〜60秒間隔で）キャプチャすることができます。典型的な露光時間は100〜200ミリ秒です。

レーザー走査型共焦点顕微鏡とイメージング胚を実現するには、2チャネルと4つの固体レーザ（405、488、555、と635 nm）を装備したツァイスLSM700を使用してください。このシステムは、胚のイメージングに使用計画 - アポ63X/1.4NAの目的でツァイスAxioはオブザーバー倒立顕微鏡に接続されています。システムはまた、限られた画像処理および分析を提供する画像取得用ツァイスZENソフトウェアを使用しています。 two蛍光色素とするときには、イメージング、我々は通常、1から5の焦点面に（〜0.5μm程度離れて）収集し、Zスタックを15秒ごとに収集する。著しい退色が発生するまでのコレクションは継続されています。最終的なタイムラプスビデオを生成するには、Zスタック画像はZENソフトウェアの最大投影ツールを使用して統合されています。動画はaviファイルなどのソフトウェアからエクスポートされます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg Buffer			5mM Hepes pH 7.2, 110mM NaCl, 4mM KCl, 5mM Mg Acetate, 5mM CaCl2
Mitotracker	Invitrogen	M-7512
Lysotracker	Invitrogen	L-7525
Injection Capillary Pipet	Harvard Apparatus	GC120F-10
Needle Puller	Kopf Instruments	Model 700C
Microinjector Apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1 microinjection regulator