Time-lapse Mikroskopi av tidig embryogenesen i Caenorhabditis elegans

Summary

I artikeln beskrivs en teknik för visualisering av de tidiga händelserna embryogenesen i rundmasken

Abstract

Caenorhabditis elegans har ofta använts som modellsystem i studier av tidiga utvecklingsprocesser. Öppenheten i embryon, de genetiska resurserna, och relativt lätt att omvandlingen är egenskaper som gör C. elegans en utmärkt modell för tidig fosterutveckling. Laserbaserade konfokalmikroskopi och fluorescerande taggar låta forskare att följa särskilda cellulära strukturer och proteiner i det växande embryot. Till exempel kan man följa specifika organeller som lysosomer eller mitokondrier, med hjälp av fluorescerande färgämnen. Dessa färgämnen kan levereras till det tidiga embryot genom mikroinjektion i vuxen gonad. Dessutom kan lokalisering av specifika proteiner följas med hjälp av fluorescerande proteinet taggar. Exempel presenteras här visar användningen av ett fluorescerande lysosomala färgämne samt fluorescerande taggade histon och ubiquitin proteiner. Den märkta histon används för att visualisera DNA och därmed identifiera skede av cellcykeln. GFP-märkta ubiquitin avslöjar dynamik ubiquitinated blåsor i det tidiga embryot. Observationer av märkt lysosomer och GFP:: ubiquitin kan användas för att avgöra om det finns colocalization mellan ubiquitinated blåsor och lysosomer. En teknik för mikroinjektion av det lysosomala färgämne presenteras. Tekniker för att generera transgenenic stammar presenteras på annat håll (1, 2). För bildkommunikation, är embryon skärs ut av vuxna hermafrodit nematoder och monteras på 2% agaros kuddar följt av tidsförlopp mikroskopi på en standard laserskanning konfokalmikroskop eller en snurrande skiva konfokalmikroskop. Denna metod ger den höga upplösningen visualisering av tidig fosterutveckling.

Protocol

1. Nematoder kulturer

1. Få relevanta C. elegans stam från Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) eller från en kollega.
2. Odla nematoder på NGM agarplattor ympats med ett OP50 bakteriell gräsmatta (3). För analys av GFP stammar tillväxt vid 25 ° C rekommenderas.
3. Dagen före din mikroskopi experiment, plocka minst 40 L4 på seedade tallrikar och placera plattorna vid 25 ° C över natten. Dessa maskar kommer att bli unga vuxna för experimentet.

2. Injektioner

Om det är önskvärt att se strukturer som lysosomer eller mitokondrier, kan vuxna injiceras med fluorescerande färg innan visualisering.

1. Förbered torkade agarosen injektion trampdynor. (Detta kan göras en till flera dagar i förväg)
   1. Förbered smält 2% agaros i vatten. Med en pasteurpipett satte 2 droppar på en 22X54 mm coverglass. Lägg en annan coverglass korsvis ovanpå droppe. För att uppnå rätt tjocklek, tryck på toppen coverglass tills diametern på den plattan är ca 1,5 cm. Låt sitta i 5-10 minuter.
   2. Ta bort toppen coverglass. Torka agarosen pad genom att placera den i en 80 ° C ugn i 1 timme eller tillåta att sitta på bänk över natten.
2. Förbered Mitotracker eller Lysotracker lösning.
   1. Späd fluorescerande agent i Egg bufferten. Vi använder vanligtvis en 1:10 spädning av Mitotracker eller Lysotracker.
   2. Injektionsnålen är tillverkad av en 1,2 OD glas kapillär. Dra ut kanylen med hjälp av en nål avdragare.
   3. Använd en drog Pastuer pipett du fylla upp nålen med utspädd färg.
   4. Placera nålen i en ljus-fri, fuktas kammaren tills dess användning.
3. Pre-Injection: Ställa in mikroskop och nål.
   1. Mount injektionsnål på injektion apparater. Vår utrustning är en Narishige direktdriven mikromanipulator monteras på scenen av en Nikon TE200 inverterat mikroskop utrustat med DIC avbildande förmåga.
   2. Anslut kanylen till en 1,2 mm ID slang som är ansluten till tryckregulatorn. Antingen komprimerad luft eller kväve kan användas som ett externt tryck källa. Ställ in regulatorn till 20-25 psi.
   3. Placera 2 droppar av tung mineralolja (Parafin olja) på injektionsstället pad.
   4. Placera injektionen pad på mikroskop och sänka nålen i oljan. Kontrollera att vätskan flödar fritt från nålen vid tryck på. Applicera insprutningstryck och se efter om vätskan rinner ut ur nålen. Om inte, måste du försiktigt bryta i slutet av nålen. Nålen kan brytas genom att försiktigt köra spetsen i en liten bit av trasiga coverglass placeras på injektionsstället pad. När nålen är flödande, gå vidare till nästa steg.
4. Injektion.
   1. Cirka 1 timme före visning embryon, överföra unga vuxna maskar i oljan droppe på injektion pad. Utför detta med hjälp av det dissekera mikroskop. Använd en platina plocka tråd mask med en spets för överföring av maskar.
   2. Ordna 3 till 10 maskar så att de ligger direkt på plattan. För injektion är det enklast om maskarna är uppradade parallellt med varandra och lite mindre än en mask längd isär. När maskarna är på injektionsstället pad är det viktigt att arbeta snabbt och slutföra injektionsprocessen innan maskarna dö från uttorkning.
   3. Placera coverglass med maskar på mikroskop skede av injektionen mikroskop. Fokus i den centrala delen (rachis) av den distala gonad röret. Använd sedan mikromanipulator att flytta nålspetsen i samma fokalplanet. Flytta scenen horisontellt så att masken är punkteras av nålen. När nålspetsen är inne i rachis, utöva påtryckningar och låta gonad fylla med färgen blandningen. Injicera båda gonad armar av alla maskar på injektion pad.
   4. Efter injektion, använd en drog Pasteurpipett att leverera cirka 0,5 ml Egg Buffer till maskar. Detta kommer att hålla dem från att dö av uttorkning och ge dem möjlighet att återhämta sig från injektionsproceduren.
   5. Låt maskarna att återhämta sig i 1-2 timmar i rumstemperatur i en ljus-fri, fuktig kammare.

3. Agarosen pad för visning embryon

1. Förbered smält 2% agaros i Egg bufferten.
2. Med en Pasteur-pipett, satte 3 droppar av smält agaros på ett rent objektglas.
3. Placera glida mellan två andra bilder som har ett lager av märkning tejp som täcker dem. Dessa fungerar som distanser som kommer att se till att din agarosen pad är rätt tjocklek.
4. Placera en andra rent objektglas vinkelrätt ner på agarosen droppar. Tryck nedåt tills toppen glida vilar på tejpen från guide diabilder.
5. Precis innan du är redo att montera embryon för observation, ta bort den översta bilden.

1. Om maskar inte har injicerats, följ de två följande stegen. Annars hoppa över dem.
   1. Välj unga vuxna maskar från plattan som var förberett dagen innan. Du bör kunna se embryon inuti unga vuxna.
   2. Plocka 5-20 maskar på en unseeded NGM tallrik. Låt maskarna krypa runt på unseeded plattan ett par minuter så att maskarna kommer att förlora de flesta av de bakterier som har fastnat för dem.
2. Skaffa unga embryon från vuxna maskar
   1. Placera en 5-20 l droppe Egg buffert i mitten av en 18 mm ² glas coverglass (en coverglass tjocklek på 1,5 är att föredra).
   2. Flytta maskar från unseeded tallriken eller injektion pad i droppe Egg Buffer.
   3. Skär öppna maskar med en 26 gauge injektionsnål. Skär öppna masken nära vulvan. Du bör se embryon läcker ut masken.
3. Monteras på objektglas
   1. Vänd objektglas som var beredd med agarosen pad och sänk den på coverglass med embryon.
   2. Om längre tid förflutit krävs, använd vaselin för att täta kanterna på coverglass att förhindra uttorkning.

5. Mikroskopi

1. Att hitta lämpliga embryon.
   1. Placera bilden på mikroskop scenen. Skanna med 10X objektiv för att hitta embryon.
   2. För att hitta tidigt stadium embryon, söka efter embryon som är i färd med att slutföra moderns meios. Meiotiska embryon kan skiljas från senare embryon för att de inte har genomgått kortare. (Efter embryon har genomgått meios, kan du se en stor klyfta mellan cellmembranet och äggskal i framändan.)
   3. När du har identifierat ett iscensatt lämpligt embryo, flytta till en högre förstoring lins för inspelning av fosterutveckling.
2. Imaging
   1. I detta exempel är vi inbillar embryon som uttrycker mCherry:: H2B och GFP:: Ub taggade proteiner. Vi använder Zeiss LSM700 konventionella mikroskop laserskanning.
   2. Bilderna samlas in med hjälp av 63x 1.4NA linsen. De 488 och 555 lasrar används med minimal laser kraft och maximal vinst. AZ stack hämtas var 10-15 sekunder. Beroende på omfattningen av fotoblekning är 30-60 tidpunkter samlas in. Z bunt bilder kollapsade i högst projicerade bilden för den sista time-lapse video.

6. Representativa resultat:

Figur 1. Befruktning till First Mitos i C. elegans.

Figur 2. Mikroinjektion förfarande.

Extra Video 1 Time-lapse video av GFP:.. Ubiquitin plus Lysotracker Blue i en meiotiska embryo Klicka här för att se videon.

Discussion

Efter fusion med spermierna genomgår zygot en rad dynamiska händelser. Dessa händelser förvandla äggcellen från en relativt statisk cell till den snabbt växande embryot. I många organismer, cytoplasmisk omflyttningar är kritiska för att skapa embryonala polaritet för ägg och aktivering. C. elegans embryo ger ett utmärkt tillfälle för att observera dessa tidiga händelser ägg aktivering och fosterutveckling. Embryot är transparent och tidiga utveckling händelser inträffar relativt snabbt efter befruktning. C. elegans forskare har genererat många användbara transgena stammar som uttrycker fluorescerande proteiner involverade i tidiga utveckling. Med hjälp av dessa stammar tillsammans med RNAi eller mutanter ger ett kraftfullt system för att dissekera de molekylära vägar som ligger bakom utvecklingen av en flercellig organism (5, 6, 7, 8). Denna video artikeln presenteras ett praktiskt sätt att använda dessa verktyg och tekniker för att spela in händelser under tidig embryogenes i C. elegans.

Den mogna C. elegans äggcell blir arresterad i profas av meios I och befruktas i spermatheca av den vuxna hermafrodit. Efter befruktningen, äggcellen fortsätter genom resten av meios I och II. Dessa stadier kan observeras med hjälp av fluorescerande histon H2B (5). Under slutförandet av moderns meios förblir spermiens DNA kondenserade (se figur 1). Efter slutförandet av meios, blir moderns och faderns DNA decondensed och de två pronuclei formuläret. Moderns pronucleus vandrar mot faderliga pronucleus och de förenas nära mitten av embryot. Mitos inträder snabbt efter pronuclear möte. Alla dessa händelser inträffar i mindre än en timme. Således kan tidsförlopp mikroskopi av detta händelseförlopp lätt utföras. Utföra denna teknik kräver vissa anläggningen i nematoden odling samt grundläggande färdigheter mikroskopi förutom tillgång till ett konfokalmikroskop.

Exemplet som presenteras här utnyttjar en transgen C. elegans stam som uttrycker två fluorescerande proteiner, GFP:: ubiquitin och mCherry:: H2B. En konfokala laserskanning mikroskop används för att observera den dynamiska lokalisering av dessa två proteiner. Dessutom visar vi att injektion av fluorescerande Lysotracker kan användas för att följa öde lysosomerna i embryot efter befruktningen. Injektion av en märkt TRACKER kan också utföras för visualisering av mitokondrier eller lokala kalcium koncentrationer (9). I teorin skulle injektionen protokollet användas för att visa alla typer av fluorescerande molekyl i embryot. Detta kan inkludera märkt små molekyler, proteiner, lipider, etc. I vissa fall kan det inte vara nödvändigt att faktiskt injicera märkt trackers som maskar kommer lätt upptaget vissa färgämnen som mitotracker (10). Men vi har provat både blötläggning och injektion av lysotracker och har hittat mycket bättre resultat med injektion för visualisering i embryon.

Tekniska överväganden:

De tekniska utmaningarna med detta förfarande ingår mikroinjektion teknik samt svårigheten att avbildning mycket tidiga embryon. När det gäller microinjections är tjockleken på agarosen injektion pad avgörande för framgångsrika injektioner. Om plattan är för tjock, kommer maskar dessicate och dör snabbt. Om plattan är för tunn, kommer maskarna fastnar på plattan under injektionen processen.

De tidiga embryon kan vara känsliga för miljöfaktorer som temperatur och buffert. Vildtyp embryon bör ta initiativ till decondensation av spermiens DNA och pronuclear migration inom en minut eller så för att slutföra meios II (4). Inom 20 minuter ska den första cytokines börja. Om foster exponeras för mycket höga laser intensitet eller är överhettad eller krossas under montering, kan denna process störas. Sådana embryon kommer att arrestera utveckling. Om detta inträffar bör försöket upprepas med minskad laser makt eller en tjockare agaros pad.

C. elegans embryon inte utsöndrar inte sina äggskal till strax efter befruktningen. Under den korta tiden mellan befruktningen och sekretion av äggskal, embryon inte är livskraftiga utanför moderns (11). Vissa laboratorier har undvikit denna utmaning genom avbildning embryon i livmodern (5, 12). I livmodern imaging ger vissa förmåner som möjlighet att fånga händelser som inträffar under eller strax efter befruktningen. Detta kräver dock att tekniken att använda en mikroskopi system som möjliggör djup vävnad avbildning. System som två-photon eller flera foton är speciellt lämpade för detta (13, 14). När du använder en vanlig laser-scanning eller spinning disk konfokalmikroskop, är de bästa bilderna från embryon som hahar varit klippa ut av den vuxna masken som beskrivs här.

Imaging System tänka på:

Den typ av konfokala används Imaging System beror på användarnas behov. I allmänhet är laserskanning system rekommenderas om man vill få bilder med högsta möjliga upplösning. Å andra sidan är spinning disk system som är bättre lämpade för bildbehandling mycket dynamiska processer som bild förvärvet är relativt snabb och fotoblekning / fototoxicitet minskar.

De specifika imaging parametrar varierar beroende på den experimentella designen och konfokala Imaging System anställda. I flerdimensionella avbildning, måste man överväga det antal kanaler, fokalplan, och tid-punkter samlas in. På grund av att begränsa effekterna av fotoblekning och fototoxicitet kan ett ändligt antal bilder kan förvärvas i en viss experiment. Således, om du väljer att öka antalet kanaler som skall förvärvas, kommer du sannolikt att minska antalet fokalplan och / eller punkter tid och vice versa. Det totala antalet bilder som kan förvärvas kommer att påverkas av intensiteten i fluoroforen som avbildas liksom känslighet konfokalmikroskop som används. Mer intensiva fluoroforer och känsligare instrument kommer att kräva kortare exponeringstider och därmed producera mindre fotoblekning och fototoxicitet.

Ett stort antal eller system avbildning finns. Vi kommer att ge detaljer om de system som har använts i våra egna laboratorier. För embryon avbildning masken genom att snurra disk konfokalmikroskopi, använder vi en Nikon TE2000U inverterat mikroskop utrustat med en 60X/1.4 NA Plan Apo mål. Mikroskopet är ansluten till en Yokogawa CSU10 spinning disk enhet, en Hamamatsu C9100-13 EM CCD-kamera, och en Spectral tillämpad forskning LMM5 laser samman modul som innehåller fyra fasta tillståndets lasrar med utgång på 405, 491, 561 och 655 nm. Med detta system kan vi ta en eller två kanaler, 6-12 fokalplan, och 25 till 50 tidpunkter (vid 30 till 60 sekunders intervall). En typisk exponeringstiden är 100 till 200 millisekunder.

För avbildning embryon med laserscanning konfokalmikroskopi, använder vi en Zeiss LSM700 utrustad med 2 kanaler och fyra fasta lasrar state (405, 488, 555 och 635 nm). Detta system är kopplat till en Zeiss Axio Observer inverterat mikroskop med en Plan-Apo 63X/1.4NA mål för embryo avbildning. Systemet använder Zeiss ZEN programvara för bild-förvärvet, som också ger begränsad bildbehandling och analys. Vid avbildning med två fluorokromer, vi brukar samla 1-5 fokalplan (~ 0,5 mm mellanrum) och samla in ett Z-stack var 15 sekund. Samlingar är fortsatt tills signifikant fotoblekning har skett. För att generera den slutliga tidsförlopp video, är Z stapla bilder konsolideras med maximal projektion verktyg i ZEN programvaran. Videoklipp som exporteras från programvaran som avi-filer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg Buffer			5mM Hepes pH 7.2, 110mM NaCl, 4mM KCl, 5mM Mg Acetate, 5mM CaCl2
Mitotracker	Invitrogen	M-7512
Lysotracker	Invitrogen	L-7525
Injection Capillary Pipet	Harvard Apparatus	GC120F-10
Needle Puller	Kopf Instruments	Model 700C
Microinjector Apparatus	Tritech Research, Inc.	MINJ-1 microinjection regulator