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Biology

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling und anschließende Fluorescence Activated Cell Sorting für Kultur-unabhängige Identifizierung von gelöstem organischem Kohlenstoff abbauenden Bakterioplankton

Published: September 10, 2011 doi: 10.3791/2855
* These authors contributed equally

Summary

Environmental Bakterioplankton sind mit einem Modell des gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC)-Verbindung und einer DNA Markierungsreagens, Bromdesoxyuridin (BrdU) inkubiert. Anschließend werden DOC-abbauenden Zellen aus dem Bulk-Community auf ihre erhöhte BrdU-Einbaus mittels Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) basiert getrennt. Diese Zellen werden dann durch nachfolgende molekulare Analysen identifiziert.

Abstract

Mikroben sind wichtige Mittel der Vermittlung der Abbau von zahlreichen gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC) Substrate in der aquatischen Umwelt. Allerdings stellt Identifizierung von Bakterien-Taxa, dass bestimmte Pools von DOC in der Natur verwandeln eine technische Herausforderung.

Hier beschreiben wir einen Ansatz, Paare Bromdesoxyuridin (BrdU) Inkorporation, Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) und 16S rRNA-Gen-basierte molekulare Analyse, dass die Kultur-unabhängige Identifizierung Bakterioplankton, die einen Abbau einer bestimmten DOC Verbindung in der aquatischen Umwelt ermöglicht. Triplicate Bakterioplankton Mikrokosmen sind bis zu beiden BrdU und ein Modell DOC Verbindung (DOC Änderungen), oder nur BrdU (no-Neben-Steuerung) zu empfangen. BrdU ersetzt die Positionen von Thymidin in neu synthetisierte Bakterien-DNA und BrdU-markierte DNA kann leicht immunodetected 1,2 sein. Durch eine 24-Stunden-Inkubation Bakterioplankton, dass in der Lage, die hinzugefügt DOC Verbindung erwartet werden, um selektiv aktiviert werden, und haben daher ein höheres BrdU-Einbau (HALLO-Zellen) als non-responsive Zellen in der DOC Änderungen und Zellen in nicht-sind Zusätzlich steuert (low BrdU-Einbau-Zellen, LI-Zellen). Nach Fluoreszenz Immundetektion sind HALLO Zellen unterschieden und körperlich von der LI-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) 3 getrennt. Sortiert DOC-responsive Zellen (HALLO-Zellen) sind für die DNA extrahiert und taxonomisch durch nachträgliche 16S rRNA-Gen-Analysen, einschließlich PCR, Klon-Bibliothek Bau-und Sequenzierung identifiziert.

Protocol

1. Wasserprobe Verarbeitung

  1. Filter 10L Umwelt Wasser durch 1 &mgr; m-Porengröße Membranfilter zur Entfernung großer Partikel und bacteriovores. Sammeln Sie die Wasser-Filtrat in einem Kanister.
  2. Transfer 36 ml Filtrat in je 3 sterile Eppendorf-Röhrchen (50 ml) mit 4 ml frisch zubereitete Paraformaldehyd-Lösung (PFA; 10%). Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur, um Zellen zu erhalten. Sammeln Zellen auf 0,22-um-Porengröße weiß Membranfilter durch Vakuumfiltration. Waschen Sie den Filter, indem 10 ml Kochsalzlösung (PBS) Phosphat-gepufferte durch den Filter durch Vakuumfiltration. Beschriften Sie die Filter als negative Kontrollen und lagern Sie sie bei -20 ° C.

Steps 1,3-1,4 sind für die Errichtung DOC-limitierten Bedingungen optional.

  1. Eine Mischung von anorganischem Stickstoff und Phosphor (5 pM NH 4 Cl, 5 uM NaNO 3 und 1 &mgr; M NaH 2 PO 4 Endkonzentration) in den Kanister.
  2. Inkubieren im Dunkeln bei in situ Temperatur für 48 Stunden mit gelegentlichen Erschütterungen.

2. Mikrokosmos Einrichtung und Inkubation

  1. Füllen Sie jede der sechs 1-L Glasflaschen mit 800 ml Wasserprobe aus dem Ballon der Schritt von 1,4 bis Mikrokosmen zu etablieren. Add BrdU (10 uM, Endkonzentration) zu jeder Mikrokosmos. Gut mischen.
  2. 1 ml Modell DOC Verbindung Lösung in drei der Mikrokosmen, werden diese als DOC Änderungen dienen. 1 ml sterilem PBS in den verbleibenden drei Mikrokosmen, werden diese als nicht-Addition Kontrollen dienen.
  3. Inkubieren Sie alle Mikrokosmen in einem Inkubator Schüttler inkubieren im Dunkeln bei in situ Temperatur unter Schütteln bei 100 Umdrehungen pro Minute.
  4. Sammeln Sie 36 ml Wasser Probe von jeder Mikrokosmos und Transfer in 50 ml sterile Eppendorf-Röhrchen zu den Zeitpunkten 0, 8, 16, und 24 Stunden. Unmittelbar 4 ml frisches PFA (10%) auf Sammelröhrchen und Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur, um die Zellen zu erhalten.
  5. Filter bewahrt Zellen durch 0,22-um-Porengröße Polykarbonatmembranfilter. Waschen Sie den Filter mit 10 ml PBS. Gehen Sie sofort zum nächsten Schritt oder lagern Sie die Filter bei -20 ° C.

3. In situ Immundetektion für BrdU-Einbau

  1. Thaw die Filter (DOC geändert Proben, ohne zusätzlich Kontrollen und negative Kontrollen) bei Raumtemperatur.
  2. Es wird 1 ml Lysozym-Lösung [10 mg / ml Lysozym Eiweiß in 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] 4 bis Bakterienzellen auf dem Filter zu decken. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Waschen Sie den Filter, indem 10 ml PBS durch sie unter Absaugung.
  3. 1 ml Proteinase K-Lösung [2 mg / ml Proteinase K in 100 mM Tris, 50 nM EDTA (pH = 8)] 4 bis Bakterienzellen auf dem Filter zu decken. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Waschen Sie den Filter, indem 10 ml PBS durch sie unter Absaugung.
  4. 1 ml Exonuklease-Lösung [Exonuklease III (50 U / ml) in 5 mM MgCl 2 und 50 mM Tris-HCl] 5 bis Bakterienzellen auf dem Filter zu decken. Bei 37 ° C für 30 Minuten. Waschen Sie den Filter, indem 10 ml PBS durch sie unter Absaugung.
  5. Montieren Sie frame-Siegel Inkubationskammern (Bio-Rad) nach den Anweisungen des Herstellers.
  6. Schneiden Sie die Filter in Achtel mit einer sterilen Klinge auf ein Alkohol gereinigt trockene Oberfläche.
  7. Mit einer Pinzette, legen ein achter Abschnitt eines Filters zu einem montierten Rahmen-Dichtung Inkubationskammer (acht frame-Siegel Kammern sind für jeden Filter Probe erforderlich). Die Seite der Filter-Sektion, die Zellen enthält, sollte nach oben zeigen. Die Feuchtigkeit an der Rückseite des Filters wird der Filter-Stick, um die Folie zu ermöglichen. Wenn der Filter trocken wird, wenden Sie einen kleinen Tropfen (2 ul) diH 2 O in der Mitte der Kammer, bevor der Filter-Sektion auf der Folie.

Steps 3,8-3,20 Verwendung der Reagenzien aus den ROCHE In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS folgenden Verfahren aus der Anleitung des Herstellers modifiziert. Mit Ausnahme von PBS, sind alle Reagenzien im Kit enthalten.

  1. Genügend Inkubationspuffer (0,5% Rinderserumalbumin, 0,1% Tween20 in PBS,) gleichmäßig auf die gesamte Filter-Sektion in der Inkubationskammer ohne Überlauf, wenn die Dichtung aufgebracht wird.
  2. Legen Sie eine Polyester-Frame Abdeckung über dem Brutraum Rahmen. Drücken Sie fest zu verschließen Inkubationskammer. Vermeiden Sie Luftblasen über dem Filter. Inkubieren Sie die verschlossenen Kammern für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.
  3. Entfernen Sie die Polyester-Siegel und öffnen Sie die Inkubationskammern. (Hinweis: Öffnen der Kammern manchmal wird hochziehen Rahmen Dichtung aus der Folie in diesem Fall, bereiten Sie einen neuen Raum für die folgenden Schritte..)
  4. Pipettieren Sie die Inkubationspuffer von einer Ecke der Kammer. Vermeiden Sie den Kontakt mit dem Filter.
  5. Waschen Sie den Filter durch leichtes Pipettieren 100 ul PBS in undaus der Kammer 3 mal.
  6. Bereiten anti-BrdU-FLUOS funktionierende Lösung die folgenden Schritte durch den Hersteller unmittelbar vor Gebrauch empfohlen.
  7. Pipet 120 ul Anti-BrdU-FLUOS funktionierende Lösung auf den Filter, wobei darauf zu gleichmäßig auf die gesamte Oberfläche.
  8. Verschließen Sie die Kammer mit einer neuen Polyester-Bezug. Vermeiden Sie Luftblasen auf der Oberseite des Filters. Inkubieren Sie die Kammer im Dunkeln bei 37 ° C für 3 Stunden. Dieser Schritt wird BrdU eingebaut DNA in situ mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Label.
  9. Entfernen Sie die Polyester-Abdeckung und öffnen Sie die Inkubationskammer. Pipettieren aus der Anti-BrdU-FLUOS funktionierende Lösung. Waschen Sie den Filter 3 mal mit PBS.
  10. Übertragen Sie die Filter aus dem Brutraum in eine sterile Oberfläche. Schneiden Sie die Filter-Sektion in kleine Stücke mit einer sterilen Klinge.
  11. Übertragen Sie die Filter Stücke in 2 ml Reaktionsgefäße mit je 1 ml PBS. Fest verschließen den Schlauch und Dichtung mit Parafilm. Bei 37 ° C und 200 rpm für 10 min.
  12. Befestigen Sie die Schläuche auf einem Vortexer und Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 5 Minuten. Pipettieren der Überstand in ein steriles 15 ml Eppendorf-Röhrchen. Wiederholen Sie die Inkubation und Wirbel Schritte für 5 weitere Male. Kombinieren Sie den Überstand in den gleichen 15 ml Eppendorf-Röhrchen für jede Probe. In der Regel können 80% Zellen in der Suspension zurückgewonnen werden.
  13. Bewahren Sie den Überstand mit resuspendierten Zellen bei 4 ° C. Sortieren innerhalb von 2 Tagen.

4. FACS-Analyse

Ein Verfahren für eine BD FACSAria Durchflusszytometer und entsprechender Software wird hier beschrieben.

  1. Optimieren Sie die Einstellung der Durchflusszytometer folgenden Schritte vom Hersteller empfohlen. Dies bedeutet: Einstellung der Verstärkung, um die gewünschte breakoff Parameter und den Sweet Spot gesetzt; Optimierung der Laser-Verzögerung und Umgebung Skalierungsfaktoren für das Experiment Mantel Druck und Optimierung der Einstellungen für FSC und SSC Spannungen, FSC Schwelle, FSC-Fluoreszenz-Skalierung, Fluoreszenz-PMT-Spannungen , etc.
  2. Run negativen Kontrollproben am Durchflusszytometer (FCM) auf Fluoreszenz-Intensität des FITC und side scatter (SSC) basiert. Erhöhen Sie die FITC Schwelle, bis keine Zellen in den negativen Kontrollen können visualisiert werden durch die FITC-SSC Erwerb anzuzeigen.
  3. Run no-Neben Kontrollproben und untersuchen das Verteilungsmuster von 10.000 Zellen auf FITC und SSC Übernahmen. Definieren Sie ein Tor, um alle Zellen umschließen und bezeichnen sie als "low intensity Zellen" (LIS).
  4. Run DOC-Fassung Proben und untersuchen das Verteilungsmuster von 10.000 Zellen auf FITC und SSC Basis. Einige Zellen werden in der vorgegebenen LI Tor erscheinen. Definieren Sie ein weiteres Tor zu den Zellen, die höhere Intensität der Fluoreszenz (HIS) als LIs haben umschließen. Erwerben Sie Statistiken, um die relative Fülle von gated Zellen anzuzeigen.
  5. Sortieren HALLO Zellen in Sammelröhrchen mit 500 ul PBS bei "reinigen 1 Tropfen"-Modus. Terminate Sortierung, wenn die Zahl seiner erreicht 500.000 zählt.

5. Filter PCR-Amplifikation von 16S rRNA-Gene

Filter PCR-Verfahren werden aus Kirchman et al geändert. 6

  1. Filter sortierten Zellen auf eine weiße, 0,22 um-Porengröße, 25 mm Durchmesser, Polycarbonat-Membranfilter. Schneiden Sie den Rand des Filters, dass keine bakterielle Zellen mit einer sterilen Klinge enthält. Schneiden Sie die Filter in 8 gleich große Stücke schneiden.
  2. Legen Sie eine einzelne Filter Stück in ein PCR-Gefäß, mit dem Zellen nach innen der Röhre. Add 45 ul PCR-Wasser in die PCR-Reaktionsgefäß. Tauchen Sie den Filter komplett im Wasser.
  3. Add 2 ROCHE Abbildungen PuReTaq Read-To-Go PCR Beads in die PCR-Gefäß, kurz vortexen. Add 2 ul jeder der Vorwärts-und Rückwärtsfahrt 16S rRNA-Gen-Primer (0,4 uM Endkonzentration für jedes Primer), wie 27F und 1492R 7, in jedem der PCR Reaktionsgefäße.
  4. (Optional) Fügen 1μl Rinderserumalbumin-Lösung (BSA, Endkonzentration 30μg/100 ul) der PCR Reaktionsmischung zu adsorbieren Verstärkung Hemmer helfen. Wenn man nicht an BSA hinzufügen wählt, fügen 1μl Wasser statt.
  5. Führen Sie die PCR-Amplifikation auf einem Thermocycler. A touch down PCR-Programm empfohlen wird, hat die Glühtemperatur sequenziell abnehmenden von 62 bis 52 ° C um 1 ° C pro Zyklus für 11 Zyklen von 15 Zyklen mit Annealingtemperatur von 52 ° C, gefolgt Alle Zyklen sind Denaturierung (bei 95 ° C), Annealing (at 62 bis 52 ° C) und Verlängerung (bei 72 ° C) Schritte der 50er Jahre Dauer. Eine erste 3-min Denaturierung und letzte 10-min-Erweiterung wird auch für die PCR-Programm enthalten.
  6. Bestätigen Sie die PCR-Amplifikation mittels Elektrophorese auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten 1% Agarosegel. Excise der PCR-Produkte aus dem Gel und sauber mit dem QIAGEN QIAquick Gel Extraction Kit.
  7. Führen Sie zwei zusätzliche PCR-Amplifikationen für jede Probe, verwenden Sie jedes Mal eine neue Filter-Sektion. Nach PCR-Gel purificatiauf, bündeln die Amplikons der gleichen Probe zusammen. Gereinigtes 16S rDNA Amplikons sind nun bereit für eine Reihe von molekularen Analysen, taxonomische Identifizierung, wie Klon-Bibliothek Bau-und Sequenzierung zu ermöglichen.

6. Repräsentative Ergebnisse:

Repräsentative Ergebnisse werden anhand einer Studie von Putrescin-abbauenden Bakterien als ein Beispiel. Wasserproben wurden von einem Küstengebiet von Georgien gesammelt und verarbeitet nach dem oben beschriebenen Verfahren. FACS-Analyse ergab, dass Putrescin Neben der Entwicklung einer Gruppe von Bakterien mit hohem FITC Fluoreszenz-Intensität induziert, was eine hohe BrdU-Einbau-Rate (Abbildung 1). Diese Zellen wurden als High-BrdU-Einbau-Zellen (HIS) bezeichnet und wurde erwartet, enthalten meist Putrescin-abbauenden Bakterien. Seine waren in der nicht-Addition Kontrollen, die nur enthalten Zellen mit niedrigerem BrdU-Einbau (LIS) fehlt. LIs wurde erwartet, dass vor allem enthalten Bakterioplankton, dass nicht hinzugefügt Putrescin Einsatz waren. His wurden in getrennten Röhren sortiert und dann gesammelt auf Membranfiltern. 16S rRNA-Gen Amplikons wurden für hohe HALLO Zellen mittels Filter PCR erhalten.

Abbildung 1
Abbildung 1. Durchflusszytometrische Analyse von nicht-zusätzlich-Steuerung und Modell-Compound-Fassung (Putrescin hier als Beispiel) Proben nach 24 h Inkubation gesammelt. Zellverteilung Analyse wurde auf (1) Fluoreszenzintensität FITC-Markierung (x-Achse), was sich positiv auf Ebene des BrdU-Einbaus ist im Zusammenhang basiert, und (2) side scatter (SSC, y-Achse), die positiv zu Zelle im Zusammenhang Größe. Tor Notation ist auf Ebene des BrdU-Einbaus, (; LI, low-BrdU-Inkorporation HALLO, High-BrdU-Inkorporation) basiert. Der relative Anteil der HALLO-und LI-Zellen sind in entsprechenden Toren gezeigt.

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Discussion

Unser Ansatz Paare BrdU-Einbau, FACS und 16S rDNA-Analyse zu ermöglichen Arten-Identifikation auf der Bakterioplankton, dass die einzelnen Komponenten DOC verstoffwechseln in der aquatischen Umwelt. Die BrdU-Einbau-Assay Etiketten Bakterienzellen auf Stoffwechselaktivitäten, die Analyse erlaubt nur auf aktive Bakterien und somit nicht enthalten ruhenden Zellen. In unserem Ansatz wird BrdU-Einbau in situ immunodetected und Bakterien, die verschiedenen Ebenen des BrdU-Einbaus haben, sind anschließend visualisiert, gruppiert und sortiert mittels FACS. Die Analyse der BrdU eingebaut Zellen wurde auch berichtet, mit magnetischen Beads Immunocapture der BrdU-markierten DNA durch molekulare Analysen 2,8,9 gefolgt. Eine Einschränkung der letzteren Methode ist ihre Unfähigkeit, Zellen unterschiedlicher Aktivität unterscheiden. In diesem Fall wird die Analyse einzubeziehen Zellen, die nur geringfügig aktiv bleiben mit indigenen DOC im Wasser Proben (Abbildung 1, LIS).

Das Anfliegen wurde verwendet, um die taxonomische Strukturen von Bakterien, die in der Lage, DOC-Verbindungen wie dimethylsulfoniopropionate (DMSP), vanillate, Glycin Betain in küstennahen Meerwassers 3 abbauen zu identifizieren. Seine Anwendung kann grob extrapoliert werden die Taxonomie von Bakterien, die anderen Einzel-oder gemischten gelösten Substrate verwendet in der aquatischen Umwelt zu studieren. Zusätzlich zu 16S rRNA-Gene können funktionelle Gen-Marker auch in ähnlicher Weise analysiert werden. Molekulare Analyse der sortierten Zellen ist eine Herausforderung wegen der geringen Menge von sortierten Zellen, die normalerweise weniger als 1 Million Zellen. Daher ist die DNA-Vorlage Verstärkung in der Regel für weitere molekulare Analyse erforderlich. Obwohl in der Zelle Menge begrenzt ist, ist eine ausreichende Auflösung der Gemeinde-Struktur in der Regel erhalten. Studien haben gezeigt, dass Gemeinschaft Finger von Terminal Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (T-RFLP) von so niedrig wie 2.000 Zellen (~ 1 ul Meerwasser) druckt weitgehend denen von 2x10 9 Zellen (~ 1 L Meerwasser) in küstennahen Meerwassers 10 erzeugten ähneln generiert. Zusätzlich zu den einzelnen Gen-Amplifikation mit PCR ist metagenomische Analyse der sortierten Zellen durch eine nicht-PCR-basierte genomische Amplifikationstechnik, nämlich Multiple Displacement Amplification, MDA 11 möglich.

Kritische Schritte

Zur Aufrechterhaltung Bedingungen nah an der Natur, neben großer Mengen von externen DOC Verbindungen zu Mikrokosmen und verlängerte Inkubationszeit vermieden werden sollte. Erste Versuche sind sehr zu empfehlen, den niedrigsten Mengen Modell DOC-Verbindungen, die zur Entwicklung von HALLO-Zellen in relativ kurzer Zeit (<72 Stunden) induzieren bestimmen. Längere Inkubationszeiten aufwerfen kann die Sorge der Entwicklung von Flaschen-Effekt in Mikrokosmen. Pre-Inkubation mit anorganischen N-und P ist optional, kann aber helfen, verkürzen die Dauer der Inkubationszeit, die für die Entwicklung von HALLO-Zellen in DOC geändert Mikrokosmen erforderlich ist.

Bedingungen für die Fixierung der Zellen vor der BrdU-Fluoreszenz Immundetektion sind von entscheidender Bedeutung. Unzureichende Fixierung wird Verlust von Zellen während der Zellwand Permeabilisierung Schritte verursachen (Lysozym und Proteinase K-Behandlungen). Auf der anderen Seite neigen über erhaltene Zellen zu starr zu lysieren und Release-DNA-Vorlage für den Filter-PCR-Amplifikation. Auswahl der Konservierungsmittel, Konservierungsmittel Konzentration und Konservierung Zeit lang sollte untersucht bakterielle Gemeinschaft optimiert werden. Preservation Verfahren in diesem Protokoll aufgeführt sind seit den Küsten Bakterioplankton Gemeinschaft, die weitgehend durch Proteobacteria ist in der alpha-und gamma-Untereinheiten 10 dominiert wurde optimiert.

Mehrere Schritte der BrdU Immundetektion auf Membranfilter durchgeführt. Vorsicht ist geboten, um über das Trocknen der Filter zu vermeiden. Dehydrated Zellen über getrocknete Filter können stark an die Filtermembranen anhängen und dann schwierig sein, für spätere FACS-Analyse resuspendieren. Zellzahlen von Bakterien vor und nach der BrdU Immundetektion sollte immer gemessen werden, um die Recovery Rate von Bakterienzellen zu bestimmen.

Bei der Durchführung von Filter-PCR 6, sollte das Volumen der PCR-Reagenzien genug sein, um tauchen Filter Stück ganz. Eine optimierte Hot-Start-und Touch-down PCR-Programm im Allgemeinen wird dazu beitragen, gute Genamplifikation zu produzieren. Weitere PCR-Optimierung kann mit Hilfe einer PCR-Optimierung-Kit (wie z. B. die EPICENTRE FailSafe PCR System) oder die Manipulation der Konzentrationen von Mg 2 +, BSA und andere Inhaltsstoffe durchgeführt werden.

Method Einschränkung

Das Anfliegen ermöglicht Sammlung von Bakterien, die potenziell beeinträchtigen ein spezifisches Substrat und kann kann die Kultur-unabhängig zu identifizieren diese funktionellen Zellen, um detaillierte taxonomischen Ebenen. Allerdings sollten einige Überlegungen in ac genommen werdencount bei der Interpretation der Ergebnisse. Der Ansatz initiiert durch Inkubation von natürlichen Bakterioplankton mit spezifischen Verbindungen, typischerweise bei nicht-Tracer Ebenen in Glasflaschen. Cells als funktionelle Assemblagen identifiziert werden von denen, die den gegebenen Verbindung (en) unter in situ Bedingungen Prozess abweichen. BrdU-Einbau wurde festgestellt, dass nicht nachweisbar für einige Bakterien 1,2. Diese Bakterien sind deshalb unzugänglich mit dieser Methode. Bakterien, die nicht direkt in Verbindung Abbau beteiligt, sondern nehmen Abbauprodukte des zugesetzten Verbindung (en) können falsch-positive Signale, die nicht von den wahren Abbauern sind.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Die Finanzierung dieses Projekts wurde von der National Science Foundation gewährt OCE1029607 (XM) und MCB0702125 (MAM) und Gordon und Betty Moore Foundation (MAM) zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
BrdU Reagent Sigma-Aldrich B5002-5G
Lysozyme Reagent Sigma-Aldrich L6876-5G
Proteinase K Reagent Sigma-Aldrich P2308-25MG
In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS Kit Roche Group 11810740001 Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer.
Frame-Seal Incubation Chambers Material Bio-Rad SLF-1201
Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) Material EMD Millipore FALP14250
Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) Material EMD Millipore FGLP02500
illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads Kit GE Healthcare 27-9559-01
QIAquick gel extraction kit Kit Qiagen 28704
FailSafe PCR System Kit Epicentre Biotechnologies FS99060

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References

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Robbins, S., Jacob, J., Lu, X., Moran, M. A., Mou, X. Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton. J. Vis. Exp. (55), e2855, doi:10.3791/2855 (2011).

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