Summary
पर्यावरण bacterioplankton एक मॉडल भंग कार्बनिक कार्बन यौगिक (doc) और एक डीएनए लेबलिंग अभिकर्मक, bromodeoxyuridine (BrdU) के साथ incubated हैं. उसके बाद, डॉक्टर अपमानजनक कोशिकाओं थोक उनके बुलंद BrdU प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग समावेश पर आधारित समुदाय से अलग कर रहे हैं. इन कोशिकाओं को फिर बाद में आणविक विश्लेषण के द्वारा पहचाने जाते हैं.
Abstract
रोगाणुओं प्रमुख कई भंग कार्बनिक (doc) जलीय वातावरण में कार्बन substrates की गिरावट mediating एजेंट हैं. हालांकि, बैक्टीरियल taxa है कि प्रकृति में डॉक्टर की विशिष्ट ताल को बदलने की पहचान एक तकनीकी चुनौती बन गया है.
यहाँ हम एक दृष्टिकोण का वर्णन है कि जोड़ों bromodeoxyuridine (BrdU) निगमन, प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS), और rRNA जीन के आधार पर आणविक विश्लेषण है कि अपमानजनक जलीय वातावरण में एक विशिष्ट डॉक्टर परिसर में सक्षम bacterioplankton की संस्कृति स्वतंत्र पहचान की अनुमति देता है -16. तीन प्रतियों bacterioplankton लघु सेट कर रहे हैं दोनों BrdU और एक मॉडल डॉक्टर यौगिक (डॉक्टर संशोधनों), या केवल BrdU (नियंत्रण नहीं के अलावा) प्राप्त. BrdU substitutes के नव संश्लेषित जीवाणु के डीएनए और BrdU - लेबल डीएनए में thymidine की स्थिति आसानी से immunodetected 1,2 जा सकता है . एक ऊष्मायन 24 घंटा bacterioplankton, कि का उपयोग करने के लिए जोड़ा डॉक्टर मिश्रित करने के लिए चुनिंदा सक्रिय होने की उम्मीद कर रहे हैं, और इसलिए नहीं - BrdU निगमन के उच्च स्तर (हाई कोशिकाओं) डॉक्टर संशोधन और कोशिकाओं में गैर जिम्मेदार कोशिकाओं की तुलना में है के लिए कर रहे हैं के माध्यम से इसके अलावा नियंत्रण (कम BrdU समावेश कोशिकाओं, लाइट कोशिकाओं). प्रतिदीप्ति immunodetection के बाद, हाय कोशिकाओं प्रतिष्ठित और शारीरिक रूप से प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) 3 द्वारा लाइट कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं. क्रमबद्ध करें डॉक्टर उत्तरदायी कोशिकाओं (हाई सेल) डीएनए के लिए निकाले जाते हैं और taxonomically पीसीआर, क्लोन पुस्तकालय निर्माण और अनुक्रमण सहित बाद -16 rRNA जीन के आधार पर विश्लेषण के माध्यम से की पहचान की है.
Protocol
1. जल नमूना प्रसंस्करण
- फ़िल्टर 1 सुक्ष्ममापी ताकना आकार झिल्ली फिल्टर के माध्यम से 10L पर्यावरण पानी हटाने के लिए बड़े कणों और bacteriovores. काबोइ में पानी छानना लीजिए.
- स्थानांतरण 3 बाँझ Eppendorf (50 मिलीलीटर) ट्यूबों 4 मिलीलीटर हौसले से तैयार paraformaldehyde समाधान (10% पीएफए) युक्त में 36 मिलीलीटर प्रत्येक छानना. कमरे के तापमान पर 2 बजे के लिए सेते हैं करने के लिए कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए. 0.22-सुक्ष्ममापी ताकना आकार वैक्यूम निस्पंदन द्वारा सफेद झिल्ली फिल्टर पर कोशिकाओं को ले लीजिए. 10 मिलीलीटर वैक्यूम निस्पंदन द्वारा फिल्टर के माध्यम से खारा (पीबीएस) फॉस्फेट बफर गुजर द्वारा फिल्टर धो लें. लेबल नकारात्मक नियंत्रण के रूप में फिल्टर और उन्हें -20 ° सी. पर दुकान
चरण 1.3-1.4 डॉक्टर सीमित स्थितियों की स्थापना के लिए वैकल्पिक हैं.
- अकार्बनिक और (5 सुक्ष्ममापी एनएच 4 सीएल, 5 सुक्ष्ममापी नैनो 3, और 1μM नाह 2 पीओ 4 अंतिम एकाग्रता) काबोइ में नाइट्रोजन, फास्फोरस का एक मिश्रण जोड़ें.
- सामयिक आंदोलन के साथ 48 घंटे के लिए अंधेरे में स्वस्थानी तापमान में सेते हैं .
2. सूक्ष्म जगत स्थापना और ऊष्मायन
- छह 1-एल कांच की बोतल में से प्रत्येक के 1.4 कदम लघु स्थापित की काबोइ से 800 मिलीलीटर पानी के नमूने के साथ भरें. प्रत्येक मनुष्य का सूक्ष्म दर्शन BrdU (10 सुक्ष्ममापी, अंतिम एकाग्रता) जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स.
- तीन लघु में 1 मिलीलीटर मॉडल डॉक्टर यौगिक समाधान जोड़ें, इन डॉक्टर संशोधन के रूप में काम करेगा. शेष तीन लघु में 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस जोड़ें, इन नहीं इसके अलावा नियंत्रण के रूप में काम करेगा.
- एक मशीन प्रकार के बरतन में सभी लघु सेते और स्वस्थानी तापमान में अंधेरे में सेते हैं, जबकि 100 rpm पर मिलाते हुए .
- प्रत्येक मनुष्य का सूक्ष्म दर्शन और हस्तांतरण से 0 के समय अंक, 8, 16, और 24 घंटे में 50 मिलीलीटर बाँझ Eppendorf ट्यूबों में पानी के नमूने के 36 मिलीलीटर लीजिए. तत्काल संग्रह ट्यूबों के लिए ताजा पीएफए के 4 मिलीलीटर (10%) को जोड़ सकते हैं और कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए सेते कोशिकाओं के संरक्षण.
- फ़िल्टर 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना आकार polycarbonate झिल्ली फिल्टर के माध्यम से कोशिकाओं को संरक्षित. 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ फिल्टर धो लें. अगले कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ें या -20 डिग्री सेल्सियस पर फिल्टर की दुकान
3. BrdU निगमन के लिए स्वस्थानी immunodetection में
- फिल्टर (डॉक्टर संशोधन नमूने, नहीं इसके अलावा नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण) कमरे के तापमान पर पहले गला लें.
- Lysozyme समाधान के 1 मिलीलीटर लागू [10 / 100 मिमी Tris, 50 एनएम EDTA में मिलीग्राम मिलीलीटर lysozyme अंडे का सफेद (पीएच = 8)] फिल्टर पर बैक्टीरियल कोशिकाओं को कवर 4 . 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. के माध्यम से यह चूषण के तहत 10 मिलीलीटर पीबीएस गुजर द्वारा फिल्टर धो लें.
- Proteinase कश्मीर समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें [2 / 100 मिमी Tris, 50 एनएम EDTA में मिलीग्राम मिलीलीटर proteinase कश्मीर (पीएच = 8)] फिल्टर पर बैक्टीरियल कोशिकाओं को कवर 4 . 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. के माध्यम से यह चूषण के तहत 10 मिलीलीटर पीबीएस गुजर द्वारा फिल्टर धो लें.
- 1 मिलीलीटर exonuclease समाधान [exonuclease III (50 यू / एमएल) 5 मिमी में 2 MgCl और 50 मिमी Tris - एचसीएल] 5 फिल्टर पर बैक्टीरियल कोशिकाओं को कवर जोड़ें . 37 में सेते ° C 30 मिनट के लिए. के माध्यम से यह चूषण के तहत 10 मिलीलीटर पीबीएस गुजर द्वारा फिल्टर धो लें.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार फ्रेम सील ऊष्मायन कक्षों (जैव रेड) इकट्ठे.
- एक शराब साफ शुष्क सतह पर एक बाँझ ब्लेड का उपयोग कर फ़िल्टर eighths में स्लाइस.
- संदंश का प्रयोग, एक इकट्ठे ऊष्मायन फ्रेम सील चैम्बर (आठ फ्रेम सील कक्षों प्रत्येक फिल्टर के नमूने के लिए की जरूरत है) में एक फिल्टर के एक आठवें खंड जगह है. फ़िल्टर अनुभाग है कि सेल शामिल की ओर ऊपर की तरफ का सामना करना चाहिए. फिल्टर के पीछे नमी स्लाइड करने के लिए फ़िल्टर छड़ी की अनुमति देगा. यदि फ़िल्टर शुष्क हो जाता है, स्लाइड पर फ़िल्टर अनुभाग रखने से पहले चैम्बर के केंद्र में diH 2 हे के एक छोटे से ड्रॉप (2 μl) लागू होते हैं .
3.8-3.20 चरण स्वस्थानी सेल प्रसार किट में रॉशे से अभिकर्मकों का उपयोग, निर्माता के निर्देशों से संशोधित प्रक्रियाओं का पालन FLUOS. पीबीएस के लिए छोड़कर, सभी अभिकर्मकों किट के भीतर प्रदान की जाती हैं .
- पर्याप्त ऊष्मायन (0.5% गोजातीय सीरम अंडे की सफ़ेदी, पीबीएस में 0.1 Tween20%,) बफर अतिप्रवाह के कारण एक बार सील लागू किया जाता है बिना समान रूप से ऊष्मायन कक्ष में पूरे फ़िल्टर अनुभाग को कवर लागू करें.
- ऊष्मायन चैम्बर फ्रेम पर एक पॉलिएस्टर फ्रेम कवर रखें. नीचे प्रेस कसकर ऊष्मायन कक्ष सील. फिल्टर के ऊपर हवा बुलबुले से बचें. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए बंद कक्षों सेते हैं.
- पॉलिएस्टर मुहर निकालें और ऊष्मायन कक्षों खुला. (नोट: कक्षों खोलने कभी - कभी स्लाइड से फ्रेम सील खींच जाएगा उस मामले में, निम्न चरणों के लिए एक नया कक्ष तैयार.)
- चैम्बर के एक कोने से ऊष्मायन बफर बाहर Pipet. फिल्टर के साथ संपर्क से बचें.
- धीरे में 100 μl पीबीएस pipetting द्वारा फिल्टर धो औरकक्ष से बाहर 3 बार.
- विरोधी BrdU - FLUOS काम तुरंत का उपयोग करने से पहले निर्माता से सिफारिश की चरणों का पालन समाधान तैयार करें.
- 120 Pipet μl विरोधी BrdU - FLUOS फिल्टर के समाधान पर काम, ध्यान लेने के लिए समान रूप से पूरी सतह को कवर.
- एक नया पॉलिएस्टर कवर के साथ चैम्बर reseal. फिल्टर के शीर्ष पर हवाई बुलबुले से बचें. 37 में अंधेरे में चैम्बर सेते ° C 3 घंटे के लिए. यह कदम fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) के साथ बगल में BrdU शामिल डीएनए लेबल होगा .
- पॉलिएस्टर कवर निकालें और ऊष्मायन कक्ष खुला. विरोधी BrdU - FLUOS काम कर समाधान बाहर Pipet. पीबीएस के साथ फिल्टर 3 बार धोएं.
- ऊष्मायन कक्ष से एक बाँझ सतह फ़िल्टर स्थानांतरण. छोटे टुकड़ों में एक बाँझ ब्लेड का उपयोग कर फ़िल्टर अनुभाग स्लाइस.
- 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों, प्रत्येक युक्त एक मिलीलीटर पीबीएस में फिल्टर टुकड़े स्थानांतरण. कसकर ट्यूब और parafilm के साथ सील टोपी. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए 200 rpm.
- एक और 5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर vortexer भंवर पर ट्यूबों सुरक्षित. एक बाँझ 15 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला Pipet. 5 गुना अधिक के लिए ऊष्मायन और भंवर कदम दोहराएँ. प्रत्येक नमूने के लिए एक ही 15 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला मिश्रण. आमतौर पर, 80% कोशिकाओं निलंबन में बरामद किया जा सकता है.
- Resuspended कोशिकाओं के साथ 4 पर सतह पर तैरनेवाला स्टोर डिग्री सेल्सियस 2 दिनों के भीतर आधार पर छाँटें.
4. FACS विश्लेषण
एक बी.डी. FACSAria प्रवाह cytometer और इसी सॉफ्टवेयर के लिए एक प्रक्रिया यहाँ वर्णित है .
- प्रवाह cytometer निम्नलिखित चरणों निर्माता से सिफारिश की सेटिंग का अनुकूलन. यह जरूरत पर जोर देता है: प्रवर्धन नियंत्रण को समायोजित करने के लिए आवश्यक breakoff मापदंडों और मिठाई जगह सेट, प्रयोग म्यान दबाव के लिए लेजर देरी और क्षेत्र स्केलिंग कारकों का अनुकूलन और FSC और एसएससी voltages, FSC दहलीज, FSC प्रतिदीप्ति स्केलिंग, प्रतिदीप्ति PMT voltages के लिए सेटिंग्स का अनुकूलन , आदि
- प्रवाह (FCM) cytometer FITC और साइड तितर बितर (एसएससी) के प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर पर नकारात्मक नियंत्रण के नमूने चलाएँ. FITC दहलीज बढ़ाएँ तक नकारात्मक नियंत्रण में कोई कक्ष अधिग्रहण FITC एसएससी प्रदर्शन द्वारा visualized किया जा सकता है.
- कोई इसके अलावा नियंत्रण के नमूने को चलाने के लिए और FITC और एसएससी के अधिग्रहण पर 10,000 आधारित कोशिकाओं के वितरण पैटर्न की जांच. सभी कक्षों को संलग्न करने के लिए और उन्हें "कम तीव्रता कोशिकाओं" (LIS) के रूप में नामित गेट परिभाषित करें.
- डॉक्टर - संशोधन नमूने को चलाने के लिए और 10,000 FITC और एसएससी पर आधारित कोशिकाओं के वितरण पैटर्न की जांच. कुछ कक्षों में पूर्व निर्धारित लाइट फाटक में दिखाई देगा. अन्य गेट को परिभाषित करने के लिए कोशिकाओं है कि एलआईएस की तुलना में उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता (अपने) है संलग्न. आँकड़े प्राप्त करने के लिए gated कोशिकाओं के रिश्तेदार बहुतायत देखने.
- संग्रह "शुद्ध एक बूंद" मोड पर 500 μl पीबीएस युक्त ट्यूबों में क्रमबद्ध करें हाई कोशिकाओं. बर्खास्त छँटाई जब उसकी संख्या 5,00,000 मायने रखता है पहुँचता है.
5. फ़िल्टर पीसीआर प्रवर्धन -16 के जीन rRNA
फ़िल्टर पीसीआर प्रक्रियाओं Kirchman एट अल से संशोधित कर रहे हैं 6.
- फ़िल्टर एक सफेद पर सॉर्ट किया गया कोशिकाओं, 0.22 सुक्ष्ममापी ताकना आकार, 25 मिमी व्यास, polycarbonate झिल्ली फिल्टर. फिल्टर है कि कोई जीवाणु एक बाँझ ब्लेड का उपयोग कोशिकाओं की बढ़त छाँटो. 8 बराबर आकार के टुकड़ों में फिल्टर स्लाइस.
- एक पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब में एक ही फिल्टर टुकड़ा कोशिकाओं ट्यूब की आवक का सामना करना पड़ के साथ रखें. पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब में 45 μl पीसीआर ग्रेड पानी जोड़ें. पूरी तरह से फिल्टर पानी में डूब.
- 2 रॉशे illustra पढ़ें जाओ करने के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब में पीसीआर मोती, संक्षेप में भंवर PuReTaq जोड़ें. 2 μl आगे और रिवर्स -16 rRNA जीन (0.4 सुक्ष्ममापी प्रत्येक प्राइमर के लिए अंतिम एकाग्रता) जैसे 27F और 1492R 7, प्राइमरों के प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूबों में से प्रत्येक में जोड़ें .
- (वैकल्पिक) पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण को 1μl गोजातीय सीरम albumin समाधान (BSA, अंतिम एकाग्रता 30μg/100 μl है) जोड़ें सोखना प्रवर्धन inhibitors मदद. यदि एक BSA को जोड़ नहीं चुनता है, पानी की 1μl बजाय जोड़ने.
- एक थर्मल cycler पर पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन. पीसीआर कार्यक्रम के नीचे एक स्पर्श की सिफारिश की है, जो annealing के क्रमिक रूप से 62 से 52 के लिए कम तापमान डिग्री सेल्सियस 1 डिग्री सेल्सियस द्वारा 11 चक्र, 52 की annealing तापमान के साथ 15 चक्र द्वारा पीछा डिग्री सेल्सियस के लिए प्रति चक्र सभी चक्र (95 ° सी में) denaturing, annealing (62 पर 52 डिग्री सेल्सियस), और एक्सटेंशन (72 डिग्री सेल्सियस में) 50s अवधि के कदम शामिल हैं. एक प्रारंभिक 3 मिनट विकृतीकरण और अंतिम विस्तार 10 मिनट कदम भी पीसीआर कार्यक्रम में शामिल है.
- Ethidium ब्रोमाइड से सना हुआ 1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर प्रवर्धन की पुष्टि करें. जेल से आबकारी पीसीआर amplicons और QIAGEN QIAquick जेल निकासी किट के साथ साफ.
- प्रत्येक नमूने के लिए दो अतिरिक्त पीसीआर amplifications प्रदर्शन, हर बार एक नया फ़िल्टर अनुभाग का उपयोग करें. पीसीआर जेल purificati बादपर, एक ही नमूना के amplicons साथ पूल. शुद्ध -16 rDNA amplicons अब कर रहे हैं आणविक विश्लेषण करती है कि वर्गीकरण क्लोन पुस्तकालय निर्माण और अनुक्रमण के रूप में पहचान की अनुमति के एक नंबर के लिए तैयार है.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
प्रतिनिधि परिणाम एक उदाहरण के रूप में putrescine अपमानजनक जीवाणुओं की एक अध्ययन का उपयोग वर्णित हैं. जॉर्जिया के एक तटीय साइट से पानी के नमूने एकत्र किए गए थे और ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं निम्नलिखित संसाधित. FACS विश्लेषण से पता चला है कि putrescine इसके अलावा उच्च FITC प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ बैक्टीरिया के एक समूह के विकास को प्रेरित, उच्च BrdU समावेश दर (चित्रा 1) का संकेत है. इन कोशिकाओं को उच्च BrdU समावेश कोशिकाओं (अपने) के रूप में नामित किया गया और ज्यादातर putrescine अपमानजनक बैक्टीरिया होते थे. नहीं इसके अलावा नियंत्रण, जो केवल BrdU निगमन (LIS) के निचले स्तर के साथ कोशिकाओं निहित में याद कर रहे थे. एलआईएस के लिए मुख्य रूप से bacterioplankton को जोडी putrescine का उपयोग करने में असमर्थ थे शामिल की उम्मीद थी. अलग ट्यूबों में हल किया गया और फिर झिल्ली फिल्टर पर एकत्र. -16 RRNA जीन amplicons उच्च हाई फिल्टर पीसीआर का उपयोग कोशिकाओं के लिए प्राप्त किया गया.
चित्रा 1. फ्लो नहीं इसके अलावा नियंत्रण और मॉडल यौगिक संशोधन (यहाँ एक उदाहरण के रूप में putrescine) ऊष्मायन के 24 घंटे बाद एकत्र नमूनों की cytometric विश्लेषण. सेल वितरण विश्लेषण (1) FITC (x-अक्ष) लेबलिंग, जो सकारात्मक BrdU निगमन के स्तर से संबंधित है प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर किया गया था, और (2) की ओर (एसएससी, y-अक्ष) स्कैटर है, जो सकारात्मक सेल करने के लिए संबंधित है आकार. गेट संकेतन BrdU निगमन, (; लाइट, कम BrdU - निगमन हाय, उच्च BrdU समावेश) के स्तर पर आधारित है. हाई लाइट और कोशिकाओं के रिश्तेदार प्रतिशत इसी फाटक में दिखाए जाते हैं.
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Discussion
हमारे दृष्टिकोण जोड़े BrdU समावेश FACS, और rDNA विश्लेषण -16 प्रजाति स्तर bacterioplankton है कि जलीय वातावरण में व्यक्तिगत डॉक्टर घटकों metabolize की पहचान करने की अनुमति. BrdU समावेश परख बैक्टीरियल कोशिकाओं चयापचय गतिविधियों, जो केवल सक्रिय बैक्टीरिया पर विश्लेषण की अनुमति देता है और इस तरह निष्क्रिय कोशिकाओं को शामिल नहीं करता है के आधार पर लेबल है. हमारे दृष्टिकोण में, BrdU निगमन immunodetected सीटू और बैक्टीरिया है कि BrdU निगमन के विभिन्न स्तरों में है बाद में कल्पना कर रहे हैं, समूहीकृत और FACS का उपयोग कर सॉर्ट किया गया. BrdU शामिल कोशिकाओं के विश्लेषण भी BrdU लेबल डीएनए के चुंबकीय मनका immunocapture आणविक 2,8,9 विश्लेषण द्वारा पीछा का उपयोग की सूचना दी गई है. बाद पद्धति का एक सीमा के विभिन्न गतिविधि के स्तर की कोशिकाओं भेद पाना है. उस मामले में, विश्लेषण कोशिकाओं है कि पानी के नमूनों में स्वदेशी डॉक्टर (1 चित्रा, LIS) का उपयोग कर से केवल थोड़ा सक्रिय रहते हैं शामिल होंगे.
मिलकर दृष्टिकोण बैक्टीरिया है कि dimethylsulfoniopropionate (DMSP), vanillate, तटीय समुद्री जल में ग्लाइसिन betaine 3 के रूप में डॉक्टर यौगिकों नीचा कर रहे हैं वर्गीकरण संरचनाओं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. मोटे तौर पर अपने आवेदन बैक्टीरिया है कि जलीय वातावरण में अन्य एकल या मिश्रित भंग substrates उपयोग के वर्गीकरण का अध्ययन करने के लिए extrapolated कर सकते हैं. -16 RRNA जीन के अलावा, कार्यात्मक जीन मार्कर भी इसी तरह का विश्लेषण किया जा सकता है. सॉर्ट किया गया कोशिकाओं पर आण्विक विश्लेषण सॉर्ट किया गया कोशिकाओं, जो आम तौर पर कम से कम 1 मिलियन कोशिकाओं के छोटे बहुतायत के कारण चुनौतीपूर्ण है. इसलिए, डीएनए टेम्पलेट प्रवर्धन आम तौर पर आगे आणविक विश्लेषण के लिए आवश्यक है. हालांकि सेल मात्रा में सीमित समुदाय संरचना के लिए पर्याप्त संकल्प आमतौर पर प्राप्त की है. अध्ययनों से दिखा दिया है कि समुदाय उंगली टर्मिनल के रूप में +२००० कोशिकाओं (~ 1 μl समुद्री जल) के रूप में कम से प्रतिबंध टुकड़ा लंबाई बहुरूपता (टी RFLP) द्वारा बड़े पैमाने पर तटीय 10 समुद्री जल में 2x10 9 कोशिकाओं (~ 1 एल समुद्री जल) से उत्पन्न उन सदृश उत्पन्न प्रिंट. एक जीन प्रवर्धन के लिए पीसीआर का उपयोग कर के अलावा, एक गैर-पीसीआर आधारित जीनोमिक प्रवर्धन तकनीक, अर्थात् एकाधिक विस्थापन प्रवर्धन, 11 एमडीए के माध्यम से सॉर्ट किया गया कोशिकाओं के metagenomic विश्लेषण संभव है.
महत्वपूर्ण कदम
प्रकृति इसके अलावा, लघु और लंबे समय तक ऊष्मायन परहेज किया जाना चाहिए करने के लिए बाहरी डॉक्टर यौगिकों की अत्यधिक मात्रा के करीब स्थिति बनाए रखने के लिए. प्रारंभिक प्रयोगों अत्यधिक मॉडल डॉक्टर यौगिकों कि एक अपेक्षाकृत कम समय (<72 घंटे) में हाई कोशिकाओं के विकास को प्रेरित करने के लिए आवश्यक हैं के निम्नतम मात्रा निर्धारित करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. अब ऊष्मायन बार बोतल प्रभाव के लघु में विकास की चिंता बढ़ा सकता है. अकार्बनिक और एन पी के साथ पूर्व ऊष्मायन वैकल्पिक है, लेकिन ऊष्मायन समय है कि लघु संशोधन डॉक्टर में हाई कोशिकाओं के विकास के लिए आवश्यक है की लंबाई कम करने के लिए मदद मिल सकती है.
BrdU प्रतिदीप्ति immunodetection पहले सेल निर्धारण के लिए स्थितियां गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं. अपर्याप्त निर्धारण कोशिका दीवार permeabilization चरणों के दौरान कोशिकाओं के नुकसान के कारण (lysozyme और proteinase कश्मीर उपचार). दूसरी ओर, अधिक संरक्षित कोशिकाओं को भी lyse और फिल्टर पीसीआर प्रवर्धन के लिए डीएनए टेम्पलेट जारी कठोर हो जाते हैं. परिरक्षक, परिरक्षक एकाग्रता और संरक्षण समय की लंबाई का चयन अध्ययन जीवाणु समुदाय के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध संरक्षण प्रक्रियाओं के एक तटीय समुद्री bacterioplankton समुदाय है, जो मोटे तौर पर अल्फा और गामा उप विभाजनों 10 में Proteobacteria द्वारा प्रभुत्व के लिए अनुकूलित किया गया है.
BrdU immunodetection के एकाधिक कदम झिल्ली फिल्टर पर प्रदर्शन कर रहे हैं. सावधानी फिल्टर सुखाने पर से बचने के लिए लिया जाना चाहिए. सूखे फिल्टर पर निर्जलित कोशिकाओं जोरदार फिल्टर झिल्ली को देते हैं और हो सकता है तो बाद FACS विश्लेषण के लिए resuspend मुश्किल हो जाएगा. पहले और बाद BrdU immunodetection जीवाणुओं की सेल मायने रखता है हमेशा बैक्टीरियल कोशिकाओं की वसूली की दर निर्धारित करने के लिए मापा जाना चाहिए.
जब प्रदर्शन फिल्टर - पीसीआर 6, पीसीआर अभिकर्मकों की मात्रा पर्याप्त फिल्टर टुकड़ा पूरी तरह से डूब जाना चाहिए. एक अनुकूलित गर्म शुरू करने और सामान्य में स्पर्श डाउन पीसीआर कार्यक्रम के लिए अच्छा जीन प्रवर्धन उत्पादन में मदद मिलेगी. इसके अलावा पीसीआर अनुकूलन एक पीसीआर अनुकूलन किट (जैसे EPICENTRE failsafe पीसीआर प्रणाली के रूप में) का उपयोग कर या 2 मिलीग्राम की सांद्रता + BSA, और अन्य सामग्री जोड़ तोड़ द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है है.
विधि सीमा
मिलकर इस दृष्टिकोण बैक्टीरिया है कि संभवतः एक विशिष्ट सब्सट्रेट नीचा कर सकते हैं और संस्कृति के स्वतंत्र रूप से विस्तृत वर्गीकरण के स्तर के लिए इन कार्यात्मक कोशिकाओं की पहचान कर सकते हैं के संग्रह की अनुमति देता है. हालांकि, कई विचार एसी में रखा जाना चाहिएगिनती जब परिणामों की व्याख्या. दृष्टिकोण प्राकृतिक bacterioplankton कांच की बोतलों में गैर ट्रेसर स्तर पर आम तौर पर विशिष्ट यौगिकों के साथ ऊष्मायन द्वारा शुरू की है. कार्यात्मक assemblages के रूप में पहचान की कोशिकाओं को उन है कि दिया तहत सीटू की स्थिति में यौगिक (ओं) की प्रक्रिया से अलग हो सकता है. BrdU समावेश कुछ बैक्टीरिया 1,2 के लिए undetectable होना पाया गया है . इन बैक्टीरिया, इसलिए, इस पद्धति का उपयोग करने के लिए दुर्गम हैं. जीवाणु कि यौगिक गिरावट में सीधे शामिल नहीं हैं, लेकिन जोडी यौगिक (ओं) की गिरावट के उत्पादों ले झूठी सकारात्मक संकेत है कि सच degraders से अप्रभेद्य हैं दे सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस परियोजना के अनुदान राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (XM के लिए) OCE1029607 और MCB0702125 (mam के लिए) और गॉर्डन और बेट्टी मूर फाउंडेशन (mam के लिए) द्वारा प्रदान की गई थी.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| BrdU | Reagent | Sigma-Aldrich | B5002-5G | |
| Lysozyme | Reagent | Sigma-Aldrich | L6876-5G | |
| Proteinase K | Reagent | Sigma-Aldrich | P2308-25MG | |
| In Situ Cell Proliferation Kit, FLUOS | Kit | Roche Group | 11810740001 | Consume more of Anti-BrdU-FLUOS and Incubation buffer per reaction than suggested by the manufacturer. |
| Frame-Seal Incubation Chambers | Material | Bio-Rad | SLF-1201 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (142-mm-diameter, 1.0 μm-pore-size) | Material | EMD Millipore | FALP14250 | |
| Polycarbonate Membrane Filters (25-mm-diameter, 0.2 μm-pore-size) | Material | EMD Millipore | FGLP02500 | |
| illustra PuReTaq Ready-To-Go PCR Beads | Kit | GE Healthcare | 27-9559-01 | |
| QIAquick gel extraction kit | Kit | Qiagen | 28704 | |
| FailSafe PCR System | Kit | Epicentre Biotechnologies | FS99060 |
References
- Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).
- Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).
- Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater. Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).
- Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities. Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).
- Dinjens, W. N. Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion. Histochemistry. 98, 199-199 (1992).
- Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR. Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).
- Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells. Science. 243, 1360-1360 (1989).
- Artursson, V., Jansson, J. K. Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).
- Mou, X. Z. Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean. Nature. 451, 708-708 (2008).
- Mou, X. Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations. Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).
- Dean, F. B. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).
