Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

קשירת Cecal נקר נוהל

doi: 10.3791/2860 Published: May 7, 2011

Summary

במודל עכבר של קשירת לנקב cecal ו ככלי רב ערך לחקר אלח דם האדם.

Abstract

אלח דם האדם מאופיין על ידי סדרה של תגובות מערכתיות בתגובה זיהום אינטנסיבי מאסיבי שלא הצליחו להיכלל באופן מקומי על ידי המארח. נכון לעכשיו, אלח דם מדרג בין עשרת הגורמים העליון של התמותה ביחידות טיפול נמרץ ארה"ב 1. במהלך אלח דם ישנם שני שלבים haemodynamic נקבע כי עשויים לחפוף. השלב הראשוני (hyperdynamic) מוגדר ייצור מסיבי של ציטוקינים מעודדי דלקת ו מינים החמצן מגיב על ידי מאקרופאגים נויטרופילים המשפיעה על החדירות של כלי הדם (המוביל תת לחץ דם), תפקוד הלב וגורם לשינויים מטבוליים שהגיעה לשיאה נמק רקמות כשל איברים. כתוצאה מכך, הגורם השכיח ביותר לתמותה היא פגיעה כליות חריפה. השלב השני (hypodynamic) הוא תהליך אנטי דלקתיות מעורבים אנטיגן שינו במצגת מונוציטים, ירידה ריבוי לימפוציטים ועל התפקוד אפופטוזיס מוגבר. מצב זה המכונה החיסון או דיכאון החיסונית בחדות מעלה את הסיכון לזיהומים nocosomial ובסופו של דבר, למוות. מנגנונים של תהליכים אלה pathophysiological לא מאופיינים היטב. מכיוון שגם השלבים של אלח דם עלול לגרום לנזק בלתי הפיך וחסר תקנה, זה הכרחי על מנת לקבוע את מעמדם החיסונית הפיזיולוגי של המטופל. זו הסיבה העיקרית מדוע תרופות טיפוליות רבות נכשלו. התרופה ניתנה אותו בשלבים שונים של אלח דם עלול להיות מזיק או טיפולית אחרת או אין השפעה 2,3. אלח דם כדי להבין ברמות שונות חשוב מאוד להיות מודל החיה מתאימה ומקיפה שמעתיק את המסלול הקליני של המחלה. חשוב לאפיין את מנגנוני pathophysiological המתרחשים במהלך אלח דם ושליטה התנאים מודל לבדיקה סוכני טיפולית פוטנציאליים.

כדי לחקור את האטיולוגיה של חוקרים אלח דם האדם פיתחו מודלים של בעלי חיים שונים. המודל הקליני הנפוץ ביותר הוא קשירת לנקב cecal ו (CLP). המודל CLP מורכב ניקוב של cecum המאפשר שחרור של חומר צואתי לתוך חלל הצפק כדי לייצר תגובה חיסונית החריפה הנגרמת על ידי זיהום polymicrobial. מודל זה ממלא את המצב האנושי שהוא רלוונטי מבחינה קלינית. כמו אצל בני אדם, עכברים לעבור CLP עם החייאה נוזל להראות את השלב הראשון (מוקדם) hyperdynamic כי בזמן התקדמות לשלב (ז"ל) שנית hypodynamic. בנוסף, ציטוקינים פרופיל דומה לזה לראות אלח דם האדם, שם הוא גדל אפופטוזיס הלימפוציטים (הנסקרת ב 4,5). בשל מנגנונים מרובים חופפים מעורב אלח דם, החוקרים צריכים מודל אלח דם מתאים לחומרת מבוקר כדי להשיג תוצאות עקביות לשחזור.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. קשירת נקר Cecal וכן במודל של עכברים של אלח דם האדם

עבור C57BL הליך זה / 6 עכברים (7-9 שבועות) משמשים.

  1. להרדים את העכבר על ידי הזרקת intraperitoneally פתרון של 01:01 קטמין (75mg/kg) ו xylazine (15mg/kg). כנקודת התייחסות, להזריק 30 μl של הפתרון 01:01 לעכבר במשקל 20 גרם. לחלופין, עכברים יכולים להיות מורדם עם isoflurane בשאיפה באמצעות מאדה הרדמה.
  2. לגלח את הבטן של העכבר ולחטא האזור על ידי יישום הפתרון הראשון בבטאדין ואחריו מנגב עם ספוגית אלכוהול 70% (מספר 1 ברצף בתמונה למטה). Chlorhexidine יכול לשמש חיטוי אלטרנטיבה. אופציונלי: וילון סטרילי ניתן להשתמש כדי לשמור על האזור נקי.
  3. בתנאים aseptic, תרגול laparotomy 1-2 ס"מ קו האמצע ולחשוף את cecum עם המעי הסמוך (2 ו -3).
  4. Cecum היא ligated הדוק עם תפר 6.0 משי (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) בבסיסו מתחת שסתום ileo-cecal, והוא מחורר פעם או פעמיים עם מחט 19-מד (4 ו - 5) על אותו בצד של cecum. שים לב את אורך cecum ligated כהגדרתו המרחק מהקצה הדיסטלי של cecum לנקודה קשירת תקבע את מידת החומרה. מרחק של> 1cm מייצרת אלח דם ציון גבוה תוך מרחק של 1 ס"מ ≤ מייצרת אמצע אלח דם נמוך בכיתה. כמו כן שים לב באמצעות שיטת ניקוב cecal המוצג כאן הוא שונה מן הסטנדרט ולפנים טכניקה לנקב (החדרת מחט דרך cecum). שתי השיטות אמין לייצר את התוצאה אלח דם זהה. עם זאת, חיסרון אחד של הטכניקה ולפנים היא שזה לא לאפשר שליטה על כמות הצואה extruded כאשר cecum נסחט.
  5. Cecum אז היא לחצה בעדינות extrude כמות קטנה של צואה מאתרי ניקוב (6). Cecum הוא חזר אל חלל הצפק ואת הצפק סגור עם 6.0 התפרים משי. (7).
  6. העור הוא סגור עם קליפים 7mm רפלקס (RS-9258, מכשירים Roboz כירורגי) או קליפים מישל הפצע (7 מ"מ, RS-9270) (8).
  7. החייאה על ידי הזרקה תת עורית עכברים 1 מ"ל של תמיסת מלח מחומם מראש 0.9% באמצעות מחט 25 גרם. צעד זה החייאה נוזל יניעו את השלב hyperdynamic של אלח דם. צעד זה קריטי מתואר נוסף בסעיף הדיון.
  8. אופציונלי: להזריק תת עורי עצירות (0.05mg / משקל גוף ק"ג) או tramadol (משקל הגוף 20mg/kg) על כאבים שלאחר הניתוח. שים לב לכך אופיאטים אלה יכולים לדכא את הנשימה לתנועה ואת ההשפעות הללו ניתן לפרשנות מוטעית כאילו סימנים של אלח דם.
  9. החיות ממוקמים באופן זמני על כרית חימום או לחילופין חזר מיד בכלוב עם חשיפה מנורת חימום אינפרא אדום של 150W עד שהם להתאושש מן ההרדמה. זמן ההחלמה הוא בין 30-1 דקות לשעה.
  10. מתן גישה חופשית מזון ומים (הידרוג'ל) שהונחו על הקרקעית של הכלוב.
  11. עכברים מנוטרים כל 12 שעות עבור ההישרדות של שבוע עד שבועיים או מורדמים בנקודות זמן שונות לניתוח פרמטרים שונים.

כמו לשלוט על עיצוב ניסיוני, חיות דמה יעקבו את הטכניקה laparotomy ללא קשירת ו לנקב.
שש עד 12 שעות אחרי העכברים הליך כירורגי יהיה רדום ולהתפתח, piloerection חום, שלשולים, מתכרבלים, וחולשה, כל הסימפטומים של אלח דם. עכברים עם אלח דם חמור מאוד בקושי יכול לזוז לפני מותו ולהציג ירידה דרמטית בחום הגוף. בשלב זה עכברים צעד צריך להיות מורדמים, כדי למנוע סבל ממושך.

איור 0

2. פרמטרים ניתחתי שכיחים

כדי להעריך את תוצאות ההליך, פרמטרים שונים ניתן לנתח באיברים, תמציות התא או נוזלי גוף. דוגמאות ניתן לאסוף בנקודות זמן שונות מ 3 שעות בשבוע אחד לאחר ההליך הכירורגי.

  1. עכברים הישרדות.
  2. ציטוקינים ו chemokines בחלל, סרום הצפק ותמציות איברים.
    1. Interleukin-6: הופק ושוחרר על ידי מונוציטים, תאים דנדריטיים, מקרופאגים, תאים B, ותאי T, גרנולוציטים, תאים התורן סוגי תאים רבים יותר. זה ממלא תפקיד חשוב בתגובה שלב דלקת חריפה.
    2. גידול גורם נמק-α: ציטוקין Pleiotrophic כי תפקיד מרכזי בתהליכים דלקתיים אפופטוזיס. הופק על ידי מונוציטים, מקרופאגים, נויטרופילים, התאים הדנדריטים וגם fibroblasts.
    3. nterleukin-1β: הופק על ידי מונוציטים, תאים NK, תאים דנדריטים, תאים B ותאי T. גורם חום חריפה סינתזה חלבון שלב.
    4. אינטרלויקין 10: מקדם ספיגת phagocytic ותגובות Th2 אבל מדכא antigen מצגת Th1 תגובות מעודדי דלקת.
    5. אינטרלויקין 10: מקדם ספיגת phagocytic ותגובות Th2 אבל מדכא מצגת אנטיגן ואת Th1 תגובות מעודדי דלקת.
    6. מונוציטים chemotactic חלבון-1 (הידוע גם בשם CCL2): מגייסת ומונוציטים, תאים T זיכרון, תאים דנדריטים לאתרים של פגיעה ברקמות זיהום.
    7. KC (CXCL1): הופק על ידי מקרופאגים ותאי האנדותל. עכבר KC הוא attractant נויטרופילים חזק activator.
    8. RANTES: chemoattractant מונוציטים. זה יכול chemoattract unstimulated CD4 + / CD45RO + T זיכרון תאים מסוג CD4 + ו מגורה CD8 + T תאים עם יש na ו פנוטיפים זיכרון.
    9. אינטרפרון-γ: מופרש על ידי תאים Th1, ותאי T ציטוטוקסיים, תאים דנדריטים טבעי (NK) תאים הרוצח. מגביר מצגת אנטיגן ופעילות ממס ב מקרופאגים ומדכא פעילות התא Th2. מקדם הדבקה ומחייבת נדרש הגירה ליקוציט ומקדמת פעילות התא NK.
    10. ניידות גבוהה מקבוצה B-1 חלבון: ב מונוציטים הוא גורם גרעינית activator kappa B באמצעות קשירה לקולטן התאי glycation לקדם מוצרי קצה (בכעס), הפעלת את שחרורם של מתווכים מעודדי דלקת בשלב מאוחר של אלח דם.
  3. Myeloperoxidase נחישות באיברים כאמצעי של חדירת נויטרופילים. Myeloperoxidase (MPO) הוא האנזים peroxidase ביותר כיום בשפע גרנולוציטים נויטרופילים. זהו חלבון lysosomal מאוחסנים גרגרי azurophilic של נויטרופילים. MPO יש פיגמנט heme, מה שגורם הצבע הירוק שלה בהפרשות עשיר נויטרופילים, כמו מוגלה כמה צורות של ריר.
  4. חיידקים לטעון איברים זרם דם, למדוד כמספר המושבה הקמת יחידות למיליליטר.

3. נציג תוצאות

ההליך CLP בוצעה תחילה זן C57BL / 6 העכבר. בדקנו מספר פרמטרים לווסת את חומרת אלח דם על ידי שינוי אורך של קשירת ועובי המחט כפי שמוצג איורים 1 ו -2. בין שני הגורמים הללו, אורכו של קשירת נראה להיות יעיל יותר מאשר עובי המחט לשנות את אחוז ההישרדות. כפי שניתן לראות בתרשים 1, להגדיל את אורך של קשירת על ידי יותר מ 1cm מעורר עלייה בתמותה של 100% בהשוואה לעכברים שיש קשירת של ≤ 1cm. הגדלת עובי המחט גם ירד אחוז ההישרדות מ -100% (באמצעות מחט 22g) ל -55% (באמצעות מחט 19G) ובה שני חורים. כמו כן, אנו נבחן את ההשפעה של CLP על C57BL / 6 129SvJ עכברים כדי לקבוע אם העכבר זנים שונים להציג רגישות דומה או ברורים אלח דם CLP-Induced. איור 3 מראה כי בתנאים זהים, עכברים 129SvJ היו רגישים יותר זיהום מאשר C57BL / 6, שמסומן על ידי אחוז תמותה מוגברת.

איור 1
באיור 1. השפעת אורך של קשירת cecum בהישרדות של בעלי חיים. CLP בוצעה C57BL / 6 עכברים באמצעות שני אורכים שונים של קשירת cecal. זה פרמטר אחד משפיעה באופן דרמטי מאז הישרדות בעלי חיים כל בעלי החיים בקבוצה עם שטח קשירת יותר מ 1 ס"מ מתו פחות מ 3 ימים בהשוואה לקבוצה של בעלי חיים באזור בעל קשירת של כ 1 ס"מ. (N = 8).

איור 2
איור 2. השפעת עובי המחט על הישרדות. CLP בוצעה C57BL / 6 בעכברים באמצעות מחט בשני גדלים שונים, 19G ו - 22g. עכברים עם cecum מחורר באמצעות מחט 19G הראו הישרדות 55-60%. לעומת זאת, בעכברים עם cecum מחורר באמצעות מחט 22g הראו הישרדות של 100% למרות שהם חוו תסמינים אופייניים של דלקת בימים 3-4 הראשון, אשר נעלם לאחר 4 ימים (n = 8).

איור 3
איור 3. השוואה בין הרגישות אלח דם בין שני זנים שונים העכבר. המודל CLP בוצעה 129SvJ C57BL ו / 6, בתנאים זהים. בתום תקופת ההערכה הישרדות אחוז המתח 129SvJ היה 25% פחות מאשר זן C57BL / 6, המציין רגישות גבוהה יותר לדלקת הנגרמת על ידי זיהום polymicrobial. (N = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כאן אנחנו מראים בפירוט כיצד לבצע את מודל CLP בעכברים לווסת את כיתה של חומרה.

בהשוואה במודלים של בעלי חיים אחרים של אלח דם, CLP ניתן לבצע כל זן של העכבר גיל, מין שונות. זהו הליך ניתוחי קל יחסית ולא יקר. במודל זה, הציון של חומרה יש השפעה ישירה על אחוז ההישרדות. אורכו של קשירת, עובי המחט ומספר דקירות פרמטרים שניתן לשלוט לווסת את חומרת / תמותה של CLP. כתוצאה מכך, כדי להשיג שינויים דרמטיים חומרת CLP, המשתמש יכול לשנות את אורכו של קשירת תוך שינוי קל חומרת יכול להיות מוצג על ידי התאמת עובי המחט.

פרמטרים חשובים נוספים שיכולים להציג שונות ניכרת בתוצאות CLP הם זן עכבר 6,7, 8 מין וגיל של החיה 9. בהקשר זה אנו מראים כי זנים שונים בעכבר להציג רגישויות שונות הנוהל כאשר היא מבוצעת תחת אותם תנאים. ואכן, ההבדלים ברמות ציטוקינים פלזמה נזק לרקמות זוהו בין זנים שונים העכבר 10-12. הכללה של החייאה נוזלים הממשל משכך כאבים הם גורמים שיכולים להציג את השתנות משמעותית במודל CLP. למשל, החייאה נוזל מגדילה שיעור ההישרדות ככל הנראה על ידי צמצום הייצור של ציטוקינים דלקתיים הפרו מוקדם 11, 13, 14 ובכך מסווה את ההשפעה של התערבויות טיפוליות פוטנציאליים. לעומת זאת, משככי כאבים נרקוטיים יכולים לדכא את הנשימה לתנועה בתוך החיה לעורר השפעה בלתי הפיך שאינו קשור אלח דם. השימוש שלהם, ולכן יכולים להשפיע על שיעור ההישרדות ותפקוד התא החיסונית 15.

לסיכום, בעת ביצוע המודל CLP כל התנאים הללו ואת הפרמטרים הטכניים יש לשקול בזהירות על מנת להשיג תוצאות לשחזור ועקבית. לכן, ידע ושליטה עמוקה של ההליך יש צורך בהחלט לבצע את דגם CLP במדויק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם משרד הבריאות של פנסילבניה.
ד"ר מיגל גרסיה Toscano היה בחור דוקטורט באוניברסיטת טמפל, שמומן על ידי אלפונסו מרטין Escudero הקרן במהלך מחקר זה.
אנו רוצים להודות איליה Yordanov וקווין Kotredes לביצוע של הווידאו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Ketaset 0856-2013-01
Xylazine AnaSed NADA# 139-236
Insulin syringe 29G Excel Scientific 26028
Silk suture, 6-0 PROLENE Ethicon Inc. 8680G
19G and 25G Needle BD Biosciences 305186
Shaver General Supply General supply
Infrared Heating lamp General Supply General supply
Michel wound clips 7mm Roboz Surgical Instruments Co. RS-9270
Ear Loop Mask Fisher Scientific 19-130-4181
Dissection scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6702
Betadine solution VWR international 63410-992
Surgical forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135
70% Isopropyl alcohol pad Fisher Scientific 22-031-350
Buprenorphine Bedford Laboratories 55390-100-10
Tramadol Sigma-Aldrich 42965

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).
  2. Riedemann, N. C., Guo, R. F., Ward, P. A. The enigma of sepsis. J Clin Invest. 112, 460-467 (2003).
  3. Eichacker, P. Q., Gerstenberger, E. P., Banks, S. M., Cui, X., Natanson, C. Meta-analysis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome trials testing low tidal volumes. Am J Respir Crit Care Med. 166, 1510-1514 (2002).
  4. Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
  5. Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).
  6. Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J Surg Res. 102, 45-49 (2002).
  7. De Maio, A., Torres, M. B., Reeves, R. H. Genetic determinants influencing the response to injury, inflammation, and sepsis. Shock. 23, 11-17 (2005).
  8. Diodato, M. D., Knoferl, M. W., Schwacha, M. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. Gender differences in the inflammatory response and survival following haemorrhage and subsequent sepsis. Cytokine. 14, 162-169 (2001).
  9. Turnbull, I. R. Effects of age on mortality and antibiotic efficacy in cecal ligation and puncture. Shock. 19, 310-313 (2003).
  10. Miyaji, T. Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice. Kidney Int. 64, 1620-1631 (2003).
  11. Torres, M. B., De Maio, A. An exaggerated inflammatory response after CLP correlates with a negative outcome. J Surg Res. 125, 88-93 (2005).
  12. Doi, K. AP214, an analogue of alpha-melanocyte-stimulating hormone, ameliorates sepsis-induced acute kidney injury and mortality. Kidney Int. 73, 1266-1274 (2008).
  13. Wilson, M. A. Fluid resuscitation attenuates early cytokine mRNA expression after peritonitis. J Trauma. 41, 622-627 (1996).
  14. Zanotti-Cavazzoni, S. L. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Med. 35, 748-754 (2009).
  15. Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34, 250-260 (2010).
קשירת Cecal נקר נוהל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).More

Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter