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Medicine

盲肠结扎穿刺过程

doi: 10.3791/2860 Published: May 7, 2011

Summary

作为一个有价值的工具,为研究人类败血症盲肠结扎穿刺的小鼠模型。

Abstract

人力败血症的特点是密集和大规模的感染,没有在本地主机中设置的全身反应。目前,在十大死亡原因,在美国重症监护病房 1中,败血症的行列。在败血症,有可能重叠的两个既定的血流动力学阶段。初始阶段(高动力)被定义为大规模生产的炎性细胞因子和活性氧的巨噬细胞和中性粒细胞,影响血管通透性导致低血压,心功能,导致代谢的变化,最终导致组织坏死和器官功能衰竭。因此,最常见的原因的死亡率是急性肾损伤。第二阶段(hypodynamic)是一个消炎的过程,涉及改变单核细胞抗原提呈,减少了淋巴细胞增殖功能和细胞凋亡增加。这种状态称为免疫抑制或免疫抑制大幅增加nocosomial感染和最终死亡的风险。这些病理生理过程的机制没有得到很好的特点。因为败血症的两个阶段,可能会导致不可逆的和不可弥补的损害,它是必不可少的,以确定患者的免疫和生理状态。这是许多治疗药物失败的主要原因。同一药物在不同的败血症阶段,可能是治疗或其他有害或有没有效果 2,3。了解在各级败血症关键是有一个合适的和全面的动物模型,再现了疾病的临床过程。这一点很重要的特点败血症过程中发生的病理生理机制,控制潜在的治疗药物测试模型条件。

为了研究人类败血症研究者的病因有不同的动物模型。临床使用最广泛的的模型是盲肠结扎穿孔(CLP)。电模式,使粪便材料释放进入腹膜腔,产生一个加剧的多种微生物感染引起的免疫反应的盲肠穿孔。这种模式符合人类生存条件,是临床相关。在人类,小鼠进行液体复苏的中华第一(初)高动力的阶段,在时间的推移到第二次(晚)hypodynamic阶段。此外,细胞因子的配置文件是类似人类败血症看到那里是增加淋巴细胞凋亡(4,5检讨) 。由于涉及多个重叠的败血症机制,研究人员需要一个合适的脓毒症模型控制的严重性,以取得一致的和可重复性的结果。

Protocol

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1。作为人类脓毒症小鼠模型的盲肠结扎穿孔

对于此过程的C57BL / 6小鼠(7-9周龄)。

  1. 1:1氯胺酮(75mg/kg)和甲苯噻嗪(按15mg/kg)的解决方案由腹腔注射麻醉鼠标。作为参考,一个重达20克的小鼠注入30μL1:1的解决方案。另外,可以使用麻醉蒸发器吸入异氟醚麻醉的小鼠。
  2. 剃须鼠标腹部和消毒面积首次申请优碘用70%酒精棉签(1)在下面的图片序列擦拭的解决方案。洗必泰可作为替代消毒剂。可选:无菌的悬垂性,可用于维护该地区的清洁。
  3. 在无菌条件下,实行1至2厘米的中线剖腹探查术和揭露与毗邻大肠盲肠(2和3)。
  4. 6.0丝线缝合(6-0普理灵,8680G;爱惜康)在其下面的回肠盲肠的阀门基地,是紧紧盲肠结扎穿孔一次或两次用19号针头(4和5)在同一一侧盲肠。请注意结扎盲肠结扎点从盲肠末端的距离定义的长度,将决定其严重程度。距离>1厘米生产高档败血症≤1厘米的距离而产生中旬低档败血症。另外请注意,使用方法,这里显示的盲肠穿孔通过,并通过穿刺技术(通过盲肠针)的标准是不同的。这两种方法可靠地产生同样的败血症的结果。然而,通过,并通过技术的一个缺点是,它不便于控制的粪便量,盲肠被​​挤压时挤压。
  5. 盲肠,然后轻轻挤压,挤出穿孔网站(6)少量的粪便。盲肠是返回到腹腔和腹膜6.0丝线缝合关闭。 (7)。
  6. 皮肤反射7毫米剪辑(RS - 9258,Roboz手术器械)或米歇尔伤口剪辑(7毫米,RS - 9270)(8)关闭。
  7. 复苏小鼠注射皮下注射1毫升预热0.9%生理盐水,使用25G针的解决方案。这种液体复苏措施,将引起败血症的高动力的阶段。这关键的一步是在讨论“部分进一步描述。
  8. 可选:皮下注入丁丙诺啡(为0.05mg /公斤体重)或手术后镇痛的曲马多(20mg/kg体重)。被告知,这些阿片类药物的可以抑制呼吸和运动,这些影响可以被曲解为败血症的迹象。
  9. 动物被暂时放在加热垫,或接触到的150W的红外线取暖灯或者立即返回到一个笼子里,直到他们从麻醉中恢复过来。恢复时间从30分钟至1小时。
  10. 免费提供食物和水(水凝胶),放在笼底。
  11. 小鼠进行监测,每12小时为一到两周的生存,或在不同的时间点不同的参数分析安乐死。

深水动物实验设计控制,将遵循不结扎和穿刺剖腹探查技术。
6至12小时后,手术过程中小鼠将成为昏昏欲睡和发展的发烧,立毛,腹泻,huddling,和不适,所有的败血症症状。非常严重的败血症小鼠可以勉强移动死前表现出体温的急剧下降。在这一步小鼠应安乐死,避免长时间的痛苦和磨难。

图0

2。最常见的分析参数

为了评估程序的结果,不同的参数,可以分析在器官,细胞提取物或体液。样品可以在不同时间点收集从3个小时的外科手术后一周。

  1. 小鼠的存活率。
  2. 血清,腹腔及器官提取的细胞因子和趋化因子。
    1. 白细胞介素6:生产和单核细胞,树突状细胞,巨噬细胞,B细胞,T细胞,粒细胞,肥大细胞和多细胞类型释放。在急性期反应和炎症反应中起着重要作用。
    2. 肿瘤坏死因子-α:Pleiotrophic起着核心作用,在炎症和细胞凋亡的细胞因子,。公司生产的单核细胞,巨噬细胞,中性粒细胞,树突状细胞和成纤维细胞。
    3. nterleukin -1β:由单核细胞,NK细胞,树突状细胞,B细胞和T细胞的产生。引起发热和急性期蛋白的合成。
    4. 白细胞介素10:促进吞噬细胞的摄取和Th2反应,但抑制antigEN介绍和Th1细胞促炎症反应。
    5. 白细胞介素10:促进吞噬细胞的摄取和Th2反应,但抑制抗原提呈和Th1细胞促炎症反应。
    6. 单核细胞趋化蛋白-1(也被称为CCL2):新兵单核细胞,记忆性T细胞,树突状细胞和组织损伤和感染的网站。
    7. KC(CXCL1):巨噬细胞和血管内皮细胞产生。鼠标KC是一个强有力的中性粒细胞的诱食和激活。
    8. RANTES的:一个单核细胞趋化。它可以chemoattract未刺激的CD4 + / CD45RO +记忆性T细胞和刺激的CD4 +和CD8 + T细胞与NA VE和记忆体的表型。
    9. 干扰素γ:由Th1细胞,细胞毒性T细胞,树突状细胞和自然杀伤细胞(NK)分泌的。提高在巨噬细胞抗原提呈和催化活性,并抑制Th2细胞的活性。促进白细胞迁移所需的附着力和约束力,促进NK细胞活性。
    10. 高流动性B组- 1蛋白在单核细胞是核因子κB激活提前糖化终产物(RAGE)的细胞受体结合,激活在败血症的后期阶段释放促炎介质。
  3. 作为衡量中性粒细胞浸润的髓过氧化物酶测定机关。髓过氧化物酶(MPO)是一个最丰富的中性粒细胞粒目前的过氧化物酶。这是一个存储azurophilic颗粒的中性粒细胞的溶酶体蛋白。 MPO有血红素色素,从而导致富含中性粒细胞的分泌物,脓和粘液的一些形式,如绿色。
  4. 细菌器官和血液流加载,作为衡量每毫升菌落形成单位的数量。

3。代表性的成果

电过程最初是在C57BL / 6小鼠品系。我们测试的几个参数来调节通过改变结扎的长度和厚度的针, 如在图1和2所示的严重性败血症。在这两个因素中,结扎的长度似乎比针的厚度,以改变%的生存更有效。 如图1所示,增加结扎的长度超过1cm挑起与小鼠≤1厘米结扎相比,增加100%的死亡率。增加针的厚度也下降,从100%(使用22G针)的%生存到55%(使用19G针)与两个穿孔。我们还测试了在C57BL / 6和129SvJ小鼠中电的影响,以确定是否显示不同的小鼠品系相似或不同的CLP诱导的脓毒症的易感性。图3显示,在相同条件下,129SvJ老鼠比C57BL / 6表示%,死亡率增加,更容易感染。

图1
图1。动物的生存盲肠结扎长度的影响 。电在C57BL / 6小鼠盲肠结扎使用两个不同长度的。这种单一的参数显着影响,因为与结扎的面积在不到3天死亡1厘米以上的所有组中的动物时,一组动物有一个约1厘米的结扎面积相比,动物的生存。 (N = 8)。

图2
图2。针上生存的厚度的影响。电C57BL / 6小鼠使用两个大小不同的针,19G和22G。与盲肠穿孔使用19G针的小鼠表现出55-60%的生存。与此相反,小鼠盲肠穿孔使用22G针显示100%的生存,虽然他们经历了在第3-4天,炎症的典型症状消失后4天(N = 8)。

图3
图3。比较脓毒症易感性之间的两个不同的小鼠品系 。CLP模型129SvJ和C57BL / 6相同的条件下进行。在评估期结束后129SvJ应变%的存活率为25%,比在C57BL / 6株少,说明一个更高的易感性多种微生物感染引起的炎症。 (N = 6)。

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Discussion

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在这里,我们详细显示如何执行电在小鼠模型,并调节强度等级。

相比其他动物模型的败血症,中电可以执行在任何不同的年龄和性别的小鼠品系。它是一个相对容易和便宜的外科手术。在这种模式下,强度等级有直接影响生存的百分比。结扎的长度,厚度的穿刺针和数量等参数,可以控制调节的严重性/电死亡率。因此,获得戏剧性的变化中电严重性,用户可以改变结扎的长度,而轻微的严重性修改可以通过调整针的厚度介绍。

其他重要的参数,可以引入在中电的结果一个很大的变异性小鼠品系 6,7 8,性别和年龄动物9。在这方面,我们展示了不同的小鼠品系显示不同的敏感性的程序时,在同等条件下执行。事实上,在血浆中细胞因子水平和组织损伤的差异已检测到不同的小鼠品系 10-12 。补液和镇痛管理的包容性,可以引进中电模式的重大变化的因素。例如,液体复苏,提高成活率,可能通过减少生产的早期促炎性细胞因子11,13,14,从而掩盖潜在的治疗性干预的影响。相比之下,麻醉性镇痛药可以抑制动物的呼吸和运动,并招来一个不可逆转的影响无关败血症。因此,它们的使用,可以影响生存率和免疫细胞的功能15。

总之,执行电模式时,所有这些条件和技术参数,必须仔细考虑,以获得重复性和一致的结果。因此,深刻认识和掌握的过程是绝对需要准确地执行CLP模型。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

这项工作是从宾夕法尼亚州卫生署的拨款支持。
米格尔加西亚托斯卡诺博士是坦普尔大学的​​博士后研究员,在这项研究中的阿方马丁Escudero基​​金会资助。
我们要感谢的视频制作Iliya Yordanov和凯文Kotredes。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Ketaset 0856-2013-01
Xylazine AnaSed NADA# 139-236
Insulin syringe 29G Excel Scientific 26028
Silk suture, 6-0 PROLENE Ethicon Inc. 8680G
19G and 25G Needle BD Biosciences 305186
Shaver General Supply General supply
Infrared Heating lamp General Supply General supply
Michel wound clips 7mm Roboz Surgical Instruments Co. RS-9270
Ear Loop Mask Fisher Scientific 19-130-4181
Dissection scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6702
Betadine solution VWR international 63410-992
Surgical forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135
70% Isopropyl alcohol pad Fisher Scientific 22-031-350
Buprenorphine Bedford Laboratories 55390-100-10
Tramadol Sigma-Aldrich 42965

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References

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Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).More

Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).

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