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Medicine

Blinddarm Ligation Punktion

doi: 10.3791/2860 Published: May 7, 2011

Summary

Das Mausmodell der Blinddarm Ligatur und Punktion als ein wertvolles Instrument für das Studium der menschlichen Sepsis.

Abstract

Menschliche Sepsis ist durch eine Reihe von systemischen Reaktionen in Reaktion auf intensive und massive Infektion, die vor Ort durch den Host enthalten sein fehlgeschlagen gekennzeichnet. Derzeit Sepsis zählt zu den Top Ten der häufigsten Todesursachen in den USA Intensivstationen 1. Während Sepsis gibt es zwei etablierte hämodynamischen Phasen können sich überschneiden. Die erste Phase (hyperdynamischen) wird als eine massive Produktion von entzündungsfördernden Zytokinen und reaktiven Sauerstoffspezies durch Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, die vaskuläre Permeabilität (führt zu Hypotonie), die Herzfunktion beeinträchtigt und führt zu metabolischen Veränderungen gipfelte in Gewebsnekrose und Organversagen definiert. Folglich ist die häufigste Todesursache akutes Nierenversagen. Die zweite Phase (hypodynamic) ist ein anti-entzündlichen Prozess mit veränderten Monozyten-Antigen-Präsentation, verringerte Lymphozyten-Proliferation und Funktion und erhöhte Apoptose. Dieser Zustand, wie Immunsuppression oder Immun-Depression bekannt stark erhöht das Risiko von Infektionen nocosomial und letztlich zum Tod führen. Die Mechanismen dieser pathophysiologischen Prozesse sind nicht gut charakterisiert. Da beide Phasen der Sepsis irreversible und nicht wiedergutzumachenden Schaden verursachen kann, ist es wichtig, die immunologischen und physiologischen Zustand des Patienten zu bestimmen. Dies ist der Hauptgrund, warum viele therapeutische Medikamente versagt haben. Das gleiche Medikament in verschiedenen Stadien der Sepsis gegeben werden kann therapeutische oder anderweitig schädliche oder haben keine Auswirkung 2,3. Sepsis auf verschiedenen Ebenen zu verstehen ist es wichtig, einen geeigneten und umfassenden Tiermodell, dass der klinische Verlauf der Erkrankung vermehrt haben. Es ist wichtig, die pathophysiologischen Mechanismen, die während einer Sepsis zu charakterisieren und Kontrolle des Modells Bedingungen für die Prüfung potenzieller Therapeutika.

Zur Untersuchung der Genese der menschlichen Sepsis-Forscher haben verschiedene Tiermodelle entwickelt. Die am weitesten verbreitete klinische Modell ist cecal Ligatur und Punktion (CLP). Der CLP-Modell besteht aus der Perforation des Blinddarms ermöglicht die Freisetzung von Fäkalien in die Bauchhöhle zu einem übersteigerten Immunantwort durch polymikrobiellen Infektion induziert generieren. Dieses Modell erfüllt die conditio humana, die klinisch relevant ist. Wie beim Menschen, zeigen Mäuse, die CLP unterzogen mit Flüssigkeitstherapie die erste (frühe) hyperdynamischen Phase, in der Zeit fortschreitet, um die zweite (späte) Phase hypodynamic. Darüber hinaus ist das Zytokin-Profil ähnlich wie in der menschlichen Sepsis gesehen, wo es Lymphozyten Apoptose (reviewed in 4,5) erhöht wird. Aufgrund der vielfältigen und überlappenden Mechanismen bei der Sepsis beteiligt sind, brauchen die Forscher ein geeignetes Sepsis-Modell der kontrollierten Schwere, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

Protocol

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1. Blinddarm Ligation und Punktion als Maus-Modell für Menschenrechte Sepsis

Für dieses Verfahren C57BL / 6 Mäuse (7-9 Wochen alt) verwendet werden.

  1. Anesthetize der Maus durch die Injektion intraperitoneal eine Lösung von 1:1 Ketamin (75mg/kg) und Xylazin (15mg/kg). Als Referenz injizieren 30 ul der 1:1-Lösung in eine Maus mit einem Gewicht von 20 Gramm wiegt. Alternativ können Mäuse betäubt werden mit inhalativen Isofluran mit einem Betäubungsmittel Verdampfer.
  2. Shave den Bauch der Maus und desinfizieren Bereich, indem zuerst betadine Lösung durch Abwischen mit einem 70% igem Alkohol (Nummer 1 in der Bildfolge unten). Chlorhexidin kann als Alternative Antiseptikum verwendet werden. Optional: ein steriles Abdecktuch verwendet werden, um zu erhalten, den Bereich sauber sein.
  3. Unter aseptischen Bedingungen der Praxis ein 1 bis 2 cm Mittellinie Laparotomie und setzen den Blinddarm mit angrenzendem Darm (2 und 3).
  4. Der Blinddarm ist eng mit einem 6,0 Seidenfaden (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) ligiert an ihrer Basis unter dem Ileocoecalklappe und ist perforiert oder zweimal mit einer 19-Gauge-Nadel (4, 5) auf dem gleichen Seite des Blinddarms. Bitte beachten Sie, dass die Länge der ligiert Blinddarm als der Abstand von dem distalen Ende des Blinddarms der Ligation Punkt definiert den Grad der Schwere zu bestimmen. Ein Abstand von> 1 cm produziert hochwertige Sepsis, während ein Abstand von ≤ 1 cm produziert mid-to-low grade Sepsis. Beachten Sie auch, dass die Verwendung der Blinddarm Perforation hier gezeigte Verfahren unterscheidet sich vom Standard durch und durch Punktion Technik (Einführung einer Nadel durch den Blinddarm). Beide Methoden zuverlässig die gleiche Sepsis Ergebnis. Allerdings ist ein Nachteil der durch und durch Technik, die es nicht ermöglichen die Steuerung der Menge an Kot extrudierten, wenn der Blinddarm gequetscht wird.
  5. Der Blinddarm ist dann sanft gepresst, um eine kleine Menge von Fäkalien aus der Perforation Stätten (6) zu extrudieren. Der Blinddarm ist es, die Bauchhöhle zurück und das Bauchfell ist mit 6,0 seidenen Suturen geschlossen. (7).
  6. Die Haut wird mit Reflex 7mm Clips (RS-9258, Roboz Surgical Instruments) oder Michel Wundklammern (7 mm, RS-9270) (8) geschlossen.
  7. Resuscitate Mäusen durch Injektion subkutan 1 ml vorgewärmten 0,9% iger Kochsalzlösung mit einer 25G-Nadel. Diese Flüssigkeitstherapie Maßnahme induzieren die hyperdynamischen Phase der Sepsis. Dieser entscheidende Schritt weiter in der Diskussion beschrieben.
  8. Optional: Inject subkutan Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) oder Tramadol (20mg/kg Körpergewicht) für postoperative Analgesie. Darauf hingewiesen, dass diese Opiate können Atmung und Bewegung zu unterdrücken und diese Effekte können als Zeichen einer Sepsis fehlinterpretiert werden.
  9. Die Tiere werden vorübergehend auf ein Heizkissen gelegt oder alternativ kehrte sofort in einen Käfig mit der Exposition gegenüber einer Infrarot-Wärmelampe von 150W bis sie wieder aus der Narkose. Die Recovery-Zeit von 30 min bis 1 Stunde.
  10. Geben Sie freien Zugang zu Futter und Wasser (Hydrogel) auf dem Boden des Käfigs gelegt.
  11. Mäuse sind alle 12 Stunden für das Überleben 1.59 Wochen beobachtet oder eingeschläfert zu verschiedenen Zeitpunkten für die Analyse von verschiedenen Parametern.

Als Kontrolle für die experimentelle Gesamtplanung, würde sham Tiere der Laparotomie-Technik ohne Ligatur und Punktion folgen.
Sechs bis 12 Stunden nach dem chirurgischen Eingriff Mäuse werden lethargisch und entwickeln Fieber, Piloerektion, Durchfall, huddling und Unwohlsein; alle Symptome der Sepsis. Mäuse, die mit sehr schweren Sepsis kann kaum vor dem Tod zu bewegen und zeigen einen dramatischen Rückgang der Körpertemperatur. Bei diesem Schritt Mäusen sollte eingeschläfert zu anhaltenden Schmerzen und Leiden erspart werden.

Abbildung 0

2. Häufigste analysierten Parameter

Zur Auswertung der Ergebnisse des Verfahrens können verschiedene Parameter in Organen, Zellextrakte oder Körperflüssigkeiten analysiert werden. Proben können zu unterschiedlichen Zeitpunkten von 3 Stunden bis 1 Woche nach dem chirurgischen Eingriff gesammelt werden.

  1. Mäuse überleben.
  2. Zytokine und Chemokine im Serum, Bauchhöhle und Organextrakte.
    1. Interleukin-6: Produziert und veröffentlicht von Monozyten, dendritische Zellen, Makrophagen, B-Zellen, T-Zellen, Granulozyten, Mastzellen und viele weitere Zelltypen. Es spielt eine wichtige Rolle in der akuten Phase Reaktion und Entzündung.
    2. Tumor-Nekrose-Faktor-α: Pleiotrophic Zytokin, das eine zentrale Rolle in Entzündungs-und Apoptose spielt. Produziert von Monozyten, Makrophagen, Neutrophilen, dendritischen Zellen und Fibroblasten.
    3. nterleukin-1β: Produziert von Monozyten, NK-Zellen, dendritische Zellen, B-Zellen und T-Zellen. Induziert Fieber und akute Phase-Protein-Synthese.
    4. Interleukin 10: Fördert Phagozytose-und Th2-Reaktionen, sondern unterdrückt Antigen Präsentation und Th1 proinflammatorische Reaktionen.
    5. Interleukin 10: Fördert Phagozytose-und Th2-Reaktionen, sondern unterdrückt Antigen-Präsentation und Th1 proinflammatorische Reaktionen.
    6. Monozyten chemotaktische Protein-1 (auch als CCL2 bekannt): Rekruten Monozyten, T-Gedächtniszellen und dendritischen Zellen zu Websites von Gewebe Verletzungen und Infektionen.
    7. KC (CXCL1): Produziert von Makrophagen und Endothelzellen. Maus KC ist ein potenter Neutrophilen Lockstoff und Aktivator.
    8. RANTES: A monocyte chemoattractant. Es kann chemoattract unstimulierten CD4 + / CD45RO + Gedächtnis-T-Zellen und stimuliert CD4 + und CD8 + T-Zellen mit na ve und Speicher Phänotypen.
    9. Interferon-γ: Secreted von Th1-Zellen, zytotoxische T-Zellen, dendritische Zellen und natürliche Killerzellen (NK)-Zellen. Erhöht die Antigen-Präsentation und lytische Aktivität in Makrophagen und unterdrückt Th2-Zell-Aktivität. Fördert den Kraftschluss und bindend für alle Leukozyten-Migration erforderlich und fördert NK-Zell-Aktivität.
    10. High-mobility group B-1-Proteins: In Monozyten ist ein nuclear factor kappa B Aktivator durch die Bindung an den zellulären Rezeptor für vorab glycation Endprodukte (RAGE), Aktivierung die Freisetzung von entzündungsfördernden Mediatoren in der späten Phase der Sepsis.
  3. Myeloperoxidase Bestimmung in Organen als Maß für die Neutrophilen-Infiltration. Myeloperoxidase (MPO) ist ein Peroxidase-Enzym am reichlichsten in neutrophilen Granulozyten. Es ist eine lysosomale Protein in Azurgranula der neutrophilen gespeichert. MPO ist eine Häm-Pigment, das seine grüne Farbe verursacht in Sekreten reich an Neutrophilen, wie Eiter und einige Formen von Schleim.
  4. Bakterien in den Organen und Blut zu laden, zu messen als die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Milliliter.

3. Repräsentative Ergebnisse

Der CLP Verfahren wurde zunächst in der C57BL / 6 Maus-Stamm durchgeführt. Wir testeten verschiedene Parameter zu modulieren, die Schwere der Sepsis durch Veränderung der Länge der Ligation und die Dicke der Nadel in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Unter diesen beiden Faktoren scheint die Länge der Ligation effektiver zu sein als die Dicke der Nadel Prozent Überleben zu ändern. Wie in Abbildung 1 dargestellt, provoziert die Erhöhung der Länge der Ligation von mehr als 1 cm einer Zunahme der Mortalität von 100% im Vergleich zu Mäusen mit einem Ligation von ≤ 1cm. Die Erhöhung der Dicke der Nadel reduzierte auch die Prozent Überlebensrate von 100% (mit einer 22G Nadel) auf 55% (mit einer 19G Nadel) mit zwei Reifenschäden. Wir testeten auch die Wirkung von CLP auf C57BL / 6 und 129SvJ Mäusen zu bestimmen, ob verschiedene Mausstämme ähnliche oder unterschiedliche Anfälligkeit Display CLP-induzierten Sepsis. Abbildung 3 zeigt, dass unter den gleichen Bedingungen, 129SvJ Mäuse anfälliger für Infektionen als C57BL / 6, mit einer erhöhten Sterblichkeit Prozent angegeben wurden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Auswirkung der Ligatur Länge des Blinddarms in das Überleben der Tiere. CLP wurde in C57BL / 6 Mäuse mit zwei verschiedenen Längen cecal Ligation durchgeführt. Diese einzelnen Parameter dramatisch wirkt sich das Überleben der Tiere, da alle Tiere in der Gruppe mit einer Ligation Bereich mehr als 1 cm in weniger als 3 Tagen starb, als mit einer Gruppe von Tieren, die eine Ligation Fläche von 1 cm ca. verglichen. (N = 8).

Abbildung 2
Abbildung 2. Einfluss der Nadeldicke auf das Überleben. CLP wurde in C57BL / 6 Mäuse mit zwei verschiedenen Nadel Größen 19G und 22G durchgeführt. Mäuse mit dem Blinddarm perforiert mit einer 19G Nadel zeigte eine 55-60% Überleben. Im Gegensatz dazu zeigten Mäuse mit dem Blinddarm perforiert mit einer 22G Nadel 100% ige Überlebensrate, obwohl sie die typischen Symptome der Entzündung erlebt während der ersten 3-4 Tage; die verschwanden nach 4 Tagen (n = 8).

Abbildung 3
Abbildung 3. Vergleich der Sepsis Anfälligkeit zwischen zwei unterschiedlichen Mausstämme. Die CLP-Modell wurde in 129SvJ und C57BL / 6 unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Am Ende des Testzeitraums die prozentuale Überleben der 129SvJ Stamm wurde 25% weniger als in den C57BL / 6 Stamm, was auf eine höhere Anfälligkeit für Entzündungen, die durch polymikrobiellen Infektion induziert. (N = 6).

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Discussion

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Hier zeigen wir im Detail, wie der CLP-Modell in Mäusen durchführen und modulieren den Grad der Schwere.

Im Vergleich zu anderen Tiermodellen der Sepsis, kann CLP in jedem Mausstamm unterschiedlichen Alters und Geschlechts durchgeführt werden. Es ist eine relativ einfache und kostengünstige chirurgischen Eingriffs. In diesem Modell hat der Grad der Schwere eine direkte Auswirkung auf den Prozentsatz des Überlebens. Die Länge der Ligation werden die Dicke der Nadel und die Anzahl der Einstiche Parameter gesteuert zu modulieren die Schwere / Mortalität von CLP kann. Folglich zu dramatischen Veränderungen in CLP Schwere zu erhalten, kann der Benutzer die Länge der Ligation, während leichte Modifikation in der Schwere durch Einstellung der Dicke der Nadel eingeführt werden können.

Andere wichtige Parameter, die eine erhebliche Variabilität in der CLP Ergebnisse vorstellen könnte sind die Mausstamm 6,7, Geschlecht 8 und Alter des Tieres 9. In diesem Zusammenhang zeigen wir, dass verschiedene Mausstämme unterschiedliche Empfindlichkeiten Display, das Verfahren, wenn unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. In der Tat sind die Unterschiede im Plasma Cytokinspiegel und Gewebeschäden zwischen verschiedenen Mausstämmen 10-12 festgestellt. Einbeziehung der Flüssigkeitszufuhr und analgetische Verwaltung sind Faktoren, die erhebliche Variabilität in der CLP-Modell einführen können. Zum Beispiel erhöht Flüssigkeitszufuhr Überlebensrate möglicherweise durch Verringerung der Produktion von Anfang pro-inflammatorischen Zytokinen 11, 13, 14 so Maskierung der Auswirkungen möglicher therapeutischer Interventionen. Im Gegensatz dazu kann Schmerzmitteln zu unterdrücken Atmung und Bewegung in der Tier-und provozieren eine irreversible Wirkung in keinem Zusammenhang mit Sepsis. Ihre Verwendung kann somit Einfluss Überlebensrate und der Funktion der Immunzellen 15.

Im Ergebnis bei der Durchführung der CLP-Modell alle diese Bedingungen und die technischen Parameter müssen sorgfältig abgewogen werden, um reproduzierbare und konsistente Ergebnisse zu erhalten. Daher ist eine genaue Kenntnis und Beherrschung des Verfahrens absolut notwendig, um die CLP-Modell genau durchzuführen.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der Pennsylvania Department of Health unterstützt.
Dr. Miguel Garcia Toscano wurde ein Postdoc-Fellow an der Temple University, die Alfonso Martin Escudero Foundation im Rahmen dieser Studie finanziert.
Wir wollen Ilija Yordanov und Kevin Kotredes für die Herstellung des Videos danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Ketaset 0856-2013-01
Xylazine AnaSed NADA# 139-236
Insulin syringe 29G Excel Scientific 26028
Silk suture, 6-0 PROLENE Ethicon Inc. 8680G
19G and 25G Needle BD Biosciences 305186
Shaver General Supply General supply
Infrared Heating lamp General Supply General supply
Michel wound clips 7mm Roboz Surgical Instruments Co. RS-9270
Ear Loop Mask Fisher Scientific 19-130-4181
Dissection scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6702
Betadine solution VWR international 63410-992
Surgical forceps Roboz Surgical Instruments Co. RS-5135
70% Isopropyl alcohol pad Fisher Scientific 22-031-350
Buprenorphine Bedford Laboratories 55390-100-10
Tramadol Sigma-Aldrich 42965

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References

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Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).More

Toscano, M. G., Ganea, D., Gamero, A. M. Cecal Ligation Puncture Procedure. J. Vis. Exp. (51), e2860, doi:10.3791/2860 (2011).

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