Summary
cecal और मानव पूति के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में ligation पंचर के माउस मॉडल.
Protocol
1. Cecal और मानव पूति के लिए एक माउस मॉडल के रूप में Ligation पंचर
/ 6 चूहों (7-9 पुराने सप्ताह) इस प्रक्रिया C57BL के लिए उपयोग किया जाता है.
- Intraperitoneally 01:01 (75mg/kg) ketamine और xylazine (15mg/kg) के एक समाधान इंजेक्शन द्वारा माउस anesthetize. एक संदर्भ के रूप में, एक चूहे में 20 ग्राम वजन 01:01 समाधान के 30 μl इंजेक्षन. वैकल्पिक रूप से, चूहों के साथ साँस एक चतनाशून्य करनेवाली औषधि vaporizer का उपयोग isoflurane anesthetized किया जा सकता है.
- माउस के पेट में दाढ़ी है और पहली आवेदन betadine बाद एक 70% शराब झाड़ू (नीचे चित्र अनुक्रम में नंबर 1) के साथ पोंछते समाधान से क्षेत्र कीटाणुरहित. Chlorhexidine एक वैकल्पिक एंटीसेप्टिक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक: एक बाँझ टांगना बनाए रखने के क्षेत्र को साफ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- सड़न रोकनेवाला शर्तों के तहत, एक 1 से 2 सेमी midline laparotomy अभ्यास और आसपास आंत (2 और 3) के साथ cecum बेनकाब.
- cecum 6.0 रेशम सीवन (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) के साथ कसकर ligated ileo - cecal वाल्व के नीचे इसके आधार पर, और उसी पर छिद्रित एक या एक 19 गेज सुई (4 और 5) के साथ दो बार है cecum के पक्ष. कृपया ध्यान दें कि ligated cecum cecum के बाहर ligation के बिंदु के अंत से दूरी के रूप में परिभाषित की लंबाई गंभीरता की डिग्री का निर्धारण करेगा. > 1cm के एक दूरी उच्च ग्रेड पूति उत्पादन है जबकि ≤ 1 सेमी की दूरी मध्य से कम ग्रेड पूति का उत्पादन. यह भी ध्यान दें कि cecal वेध यहाँ दिखाया विधि का उपयोग कर के माध्यम से और पंचर तकनीक के माध्यम से (cecum के माध्यम से एक सुई शुरू) मानक से अलग है. दोनों तरीकों मज़बूती से एक ही पूति परिणाम उपज. हालांकि, के माध्यम से और के माध्यम से तकनीक का एक नुकसान यह है कि यह extruded जब cecum निचोड़ा हुआ है मल की राशि को नियंत्रित करने की सुविधा नहीं है.
- cecum फिर धीरे से वेध साइटों (6) से मल की एक छोटी राशि बाहर निकालना निचोड़ा. cecum peritoneal गुहा में लौट रहा है और peritoneum 6.0 रेशम sutures के साथ बंद कर दिया है. (7).
- त्वचा पलटा 7mm (रुपये 9258, Roboz सर्जिकल उपकरण) क्लिप या मिशेल घाव (7 मिमी, 9270 रुपये) क्लिप (8) के साथ बंद कर दिया है.
- Subcutaneously पूर्व गर्म 0.9% खारा एक 25g सुई का उपयोग समाधान के 1 मिलीग्राम इंजेक्शन लगाने के द्वारा चूहों पुनर्जीवित. यह तरल पदार्थ पुनर्जीवन उपाय पूति के hyperdynamic चरण प्रेरित करेगा. यह महत्वपूर्ण कदम आगे चर्चा खंड में वर्णित है.
- वैकल्पिक: subcutaneously इंजेक्षन buprenorphine (0.05mg / किलोग्राम शरीर के वजन) या पोस्ट ऑपरेटिव analgesia के लिए tramadol (20mg/kg शरीर के वजन). सलाह दी है कि इन opiates श्वसन और हरकत को दबाने कर सकते हैं और इन प्रभावों को पूति के संकेत के रूप में misinterpreted किया जा सकता है है.
- पशुओं को अस्थायी रूप से एक हीटिंग पैड पर रखा जाता है या वैकल्पिक रूप से एक पिंजरे तुरंत 150W के एक अवरक्त हीटिंग दीपक के लिए जोखिम के साथ जब तक वे संज्ञाहरण से उबरने लौटे. वसूली समय 30 मिनट से 1 घंटे से है.
- भोजन और पानी (hydrogel) पिंजरे के तल पर रखा करने के लिए स्वतंत्र पहुँच प्रदान करें.
- चूहे एक से दो सप्ताह के लिए अस्तित्व के लिए हर 12 घंटे की निगरानी कर रहे हैं या विभिन्न मापदंडों के विश्लेषण के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर euthanized.
प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए नियंत्रण के रूप में, नकली पशुओं ligation और पंचर बिना laparotomy तकनीक का पालन होगा.
शल्य प्रक्रिया चूहों के बाद छह से 12 घंटे सुस्त हो जाते हैं और बुखार, piloerection, दस्त, huddling अस्वस्थता, और विकसित होगा, पूति के सभी लक्षण है. बहुत गंभीर पूति के साथ चूहे मुश्किल मौत से पहले कदम है और शरीर के तापमान में एक नाटकीय कमी प्रदर्शन कर सकते हैं. इस कदम चूहों कम करने के लिए लंबे समय तक दर्द और पीड़ा से बचने के euthanized किया जाना चाहिए.
2. हाल आम पैरामीटर विश्लेषण
प्रक्रिया के परिणाम का मूल्यांकन करने के लिए, विभिन्न मापदंडों अंगों, सेल के अर्क या शरीर के तरल पदार्थ में विश्लेषण किया जा सकता है. नमूने अलग समय बिंदुओं पर 3 घंटे से शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के बाद एक सप्ताह के लिए एकत्र किया जा सकता है.
- चूहे अस्तित्व.
- सीरम, peritoneal गुहा और अंग के अर्क में साइटोकिन्स और chemokines.
- इंटरल्युकिन 6: monocytes, वृक्ष के समान कोशिकाओं, मैक्रोफेज, बी कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, granulocytes, मस्तूल कोशिकाओं और कई और अधिक प्रकार की कोशिकाओं द्वारा उत्पादित और जारी है . यह तीव्र चरण प्रतिक्रिया और सूजन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है.
- ट्यूमर परिगलन कारक α: Pleiotrophic cytokine कि सूजन और apoptosis में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है. Monocytes, मैक्रोफेज, neutrophils, वृक्ष के समान कोशिकाओं और fibroblasts द्वारा उत्पादित किया जाता है.
- nterleukin - 1β: monocytes, एन.के. कोशिकाओं वृक्ष के समान कोशिकाओं बी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित किया जाता है. बुखार और तीव्र चरण प्रोटीन संश्लेषण लाती है.
- 10 इंटरल्युकिन: phagocytic तेज और Th2 प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देता है लेकिन antig दबाएन प्रस्तुति और TH1 proinflammatory प्रतिक्रियाओं.
- 10 इंटरल्युकिन: phagocytic तेज और Th2 प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देता है लेकिन प्रतिजन प्रस्तुति और TH1 proinflammatory प्रतिक्रियाएं दबाएगा.
- Monocyte प्रोटीन-1 chemotactic (CCL2 रूप में भी जाना जाता है): रंगरूट monocytes, स्मृति टी कोशिकाओं, और वृक्ष के समान कोशिकाओं ऊतक चोट और संक्रमण की साइटों के लिए.
- के.सी. (CXCL1): मैक्रोफेज और endothelial कोशिकाओं द्वारा उत्पादित. माउस के.सी. एक शक्तिशाली न्युट्रोफिल attractant और उत्प्रेरक है.
- RANTES एक monocyte chemoattractant:. यह unstimulated chemoattract सीडी 4 + / CD45RO + स्मृति टी कोशिकाओं और उत्तेजित सीडी 4 + और ना किया है और स्मृति phenotypes के साथ CD8 + टी कोशिकाओं कर सकते हैं.
- इंटरफेरॉन-γ: TH1 कोशिकाओं साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं वृक्ष के समान कोशिकाओं और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.) द्वारा secreted. प्रतिजन प्रस्तुति और मैक्रोफेज में lytic गतिविधि बढ़ जाती है और Th2 सेल गतिविधि को दबा. आसंजन और बाध्यकारी ल्युकोसैट प्रवास के लिए आवश्यक को बढ़ावा देता है और एन.के. सेल गतिविधि को बढ़ावा देता है.
- उच्च गतिशीलता समूह B-1 प्रोटीन: monocytes में अग्रिम glycation अंत उत्पाद (गुस्से) के लिए सेलुलर रिसेप्टर के लिए बाध्य पूति के देर चरण में proinflammatory मध्यस्थों की रिहाई को सक्रिय करके परमाणु कारक रूई बी उत्प्रेरक है.
- Myeloperoxidase न्युट्रोफिल घुसपैठ के एक उपाय के रूप में अंगों में दृढ़ संकल्प. Myeloperoxidase (MPO) peroxidase सबसे बहुतायत न्युट्रोफिल granulocytes में मौजूद एंजाइम है. यह एक lysosomal प्रोटीन न्युट्रोफिल के azurophilic granules में संग्रहीत है. MPO एक heme वर्णक, जो neutrophils में अमीर मवाद और बलगम के कुछ रूपों जैसे स्राव में अपने हरे रंग का कारण बनता है.
- जीवाणु अंगों और रक्त प्रवाह में लोड करने के लिए, मिली लीटर प्रति कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या के रूप में उपाय.
3. प्रतिनिधि परिणाम
CLP प्रक्रिया शुरू C57BL 6 / माउस तनाव में प्रदर्शन किया था. हम कई मापदंडों का परीक्षण किया ligation और सुई की मोटाई की लंबाई बदलने के रूप में आंकड़े 1 और 2 में दिखाया गया है द्वारा पूति की गंभीरता मिलाना. इन दो कारकों के अलावा, ligation की लंबाई प्रतिशत अस्तित्व को बदलने के लिए सुई की मोटाई की तुलना में ज्यादा प्रभावी हो रहा है. जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, 1cm से अधिक द्वारा ligation की लंबाई बढ़ाने के 100% मृत्यु दर में एक ≤ 1cm के एक ligation वाले चूहों के साथ तुलना में वृद्धि भड़काती. सुई की मोटाई बढ़ाने से भी दो punctures के साथ 55% (एक 19G सुई का उपयोग) 100% (22G सुई का उपयोग) प्रतिशत अस्तित्व की कमी हुई. हम भी C57BL / 6 और 129SvJ चूहों पर CLP चिली के प्रभाव का परीक्षण किया निर्धारित करने के लिए क्या अलग माउस उपभेदों CLP प्रेरित पूति के लिए समान या अलग संवेदनशीलता प्रदर्शन. चित्रा 3 से पता चलता है कि एक ही परिस्थितियों में, 129SvJ चूहों C57BL / 6, एक प्रतिशत मृत्यु दर में वृद्धि ने संकेत दिया की तुलना में अधिक संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील थे.
चित्रा 1. जानवरों की अस्तित्व में cecum के ligation लंबाई के प्रभाव CLP C57BL / 6 cecal ligation के दो अलग अलग लंबाई का उपयोग चूहों में प्रदर्शन किया गया था. यह एक पैरामीटर नाटकीय रूप से ligation 1 कम से कम 3 दिनों में मृत्यु हो गई सेमी से अधिक क्षेत्र के साथ समूह में पशुओं के सभी जब लगभग 1 सेमी ligation के क्षेत्र वाले पशुओं के एक समूह के साथ तुलना के बाद से जानवर के अस्तित्व को प्रभावित करता है. (N = 8).
चित्रा 2. अस्तित्व पर सुई मोटाई के प्रभाव CLP C57BL / 6 दो अलग सुई आकार, 19G और 22G का उपयोग चूहों में प्रदर्शन किया गया था. एक 19G सुई का उपयोग छेदा cecum के साथ चूहे एक 55-60% अस्तित्व दिखाया. इसके विपरीत, एक 22G सुई का उपयोग छेदा cecum के साथ चूहों को 100% के अस्तित्व से पता चला है हालांकि वे पहले 3-4 दिनों के दौरान सूजन के विशिष्ट लक्षणों का अनुभव है, जो 4 दिनों के बाद गायब हो गया (n = 8).
चित्रा 3. दो अलग अलग माउस उपभेदों के बीच पूति संवेदनशीलता की तुलना CLP मॉडल 129SvJ और / C57BL 6 में एक ही परिस्थितियों में प्रदर्शन किया गया था . मूल्यांकन अवधि के अंत में 129SvJ तनाव का प्रतिशत अस्तित्व तनाव / 6 C57BL में कम से कम 25% थी, सूजन के लिए एक उच्च संवेदनशीलता polymicrobial संक्रमण से प्रेरित का संकेत है. (N = 6).
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Discussion
यहाँ हम विस्तार से बताते हैं कि कैसे चूहों में CLP मॉडल का प्रदर्शन करने के लिए और गंभीरता के ग्रेड मिलाना.
पूति के अन्य पशु मॉडल की तुलना में, CLP विभिन्न आयु और लिंग के किसी भी माउस तनाव में प्रदर्शन किया जा सकता है. यह एक अपेक्षाकृत आसान और सस्ती शल्य प्रक्रिया है. इस मॉडल में, गंभीरता का ग्रेड अस्तित्व का प्रतिशत पर सीधा प्रभाव पड़ता है. ligation की लंबाई, सुई की मोटाई और punctures की संख्या पैरामीटर है कि गंभीरता / CLP चिली की मृत्यु मिलाना नियंत्रित किया जा सकता हैं. नतीजतन, CLP गंभीरता में नाटकीय परिवर्तन प्राप्त, उपयोगकर्ता ligation की लंबाई को बदलने जबकि गंभीरता में मामूली संशोधन सुई की मोटाई का समायोजन करके पेश किया जा सकता है सकते हैं.
अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि CLP परिणामों में एक बड़ा परिवर्तनशीलता मिलवा सकता है माउस तनाव 6,7, 8 सेक्स और 9 जानवर की उम्र हैं . इस संबंध में हम दिखाने के लिए है कि अलग माउस उपभेदों प्रक्रिया अलग भावनाएँ प्रदर्शन जब एक ही परिस्थितियों में प्रदर्शन. दरअसल, प्लाज्मा cytokine स्तर और ऊतकों को नुकसान में मतभेद अलग माउस उपभेदों 10-12 के बीच पाया गया है . तरल पदार्थ पुनर्जीवन और एनाल्जेसिक प्रशासन के शामिल कर रहे हैं कारकों है कि CLP मॉडल में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता शुरू कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, तरल पदार्थ पुनर्जीवन संभवतः जीवित रहने की दर बढ़ जाती है जल्दी समर्थक भड़काऊ 11 साइटोकिन्स, 13, 14 का उत्पादन कम इस प्रकार संभावित उपचारात्मक उपायों के प्रभाव मास्किंग द्वारा. इसके विपरीत, मादक दर्दनाशक दवाओं और जानवर में श्वसन हरकत को दबाने और एक अपरिवर्तनीय पूति के लिए असंबंधित प्रभाव भड़काने कर सकते हैं. उनका उपयोग करते हैं, इसलिए, जीवित रहने की दर और प्रतिरक्षा सेल समारोह 15 को प्रभावित कर सकते हैं .
अंत में, जब CLP मॉडल प्रदर्शन इन शर्तों और तकनीकी मानकों के सभी ध्यान से विचार किया जाना चाहिए क्रम में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और अनुरूप परिणाम प्राप्त करने के लिए. इसलिए, एक गहरी ज्ञान और प्रक्रिया के माहिर बिल्कुल CLP मॉडल सही करने की जरूरत है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के स्वास्थ्य के पेंसिल्वेनिया विभाग से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
डॉ. Miguel Garcia Toscano मंदिर विश्वविद्यालय में एक postdoctoral साथी, इस अध्ययन के दौरान Alfonso मार्टिन Escudero फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
हम वीडियो के बनाने के लिए Iliya Yordanov और केविन Kotredes शुक्रिया अदा करना चाहता हूँ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Ketaset | 0856-2013-01 | |
| Xylazine | AnaSed | NADA# 139-236 | |
| Insulin syringe 29G | Excel Scientific | 26028 | |
| Silk suture, 6-0 PROLENE | Ethicon Inc. | 8680G | |
| 19G and 25G Needle | BD Biosciences | 305186 | |
| Shaver | General Supply | General supply | |
| Infrared Heating lamp | General Supply | General supply | |
| Michel wound clips 7mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9270 | |
| Ear Loop Mask | Fisher Scientific | 19-130-4181 | |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6702 | |
| Betadine solution | VWR international | 63410-992 | |
| Surgical forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 70% Isopropyl alcohol pad | Fisher Scientific | 22-031-350 | |
| Buprenorphine | Bedford Laboratories | 55390-100-10 | |
| Tramadol | Sigma-Aldrich | 42965 |
References
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