Summary
Çekal ligasyon ve ponksiyon insan sepsis çalışma için değerli bir araç olarak fare modeli.
Abstract
İnsan sepsis, yanıt olarak, yerel ev sahibi tarafından yer olmak için başarısız yoğun ve şiddetli enfeksiyon sistemik reaksiyonlar bir dizi ile karakterizedir. Şu anda, ABD'de yoğun bakım ünitelerinde 1 ilk on ölüm nedenleri arasında sepsis sırada yer alıyor. Sepsis sırasında çakışabilir iki kurulan hemodinamik evreleri vardır. İlk faz (hiperdinamik), makrofaj ve nötrofiller damar geçirgenliği (hipotansiyon), kalp fonksiyonu etkiler ve doku nekrozu ve organ yetmezliği ile sonuçlanan metabolik değişiklikler oluşturur proinflamatuvar sitokinler ve reaktif oksijen türlerinin büyük bir üretim olarak tanımlanır. Sonuç olarak, en yaygın ölüm nedeni akut böbrek hasarı. Ikinci aşaması (hypodynamic) değişmiş monosit antijen sunumu içeren bir anti-enflamatuar süreç, lenfosit proliferasyonu ve fonksiyon ve artan apoptozis azalmıştır. Immünosupresyon veya immün depresyon olarak bilinen bu devlet keskin nocosomial enfeksiyonları ve sonuçta, ölüm riskini artırır. Bu patofizyolojik süreçlerin mekanizmaları iyi karakterize değildir. Sepsis her aşamasında geri dönüşü olmayan ve telafisi mümkün olmayan hasara neden olabileceğinden, hastanın immünolojik ve fizyolojik durumunu belirlemek için esastır. Bu, pek çok tedavi edici ilaçların neden başarısız oldu ana sebebidir. Sepsis farklı aşamalarında verilen aynı ilaç tedavi ya da başka zararlı veya etkisi 2,3 hiçbir çeşitli düzeylerde sepsis anlamak için hastalığın klinik seyri üretir uygun ve kapsamlı hayvan modeli için çok önemlidir. Sepsis sırasında meydana gelen patofizyolojik mekanizmalar karakterize ve potansiyel terapötik ajanlar test etmek için model koşulları kontrol etmek için önemlidir.
Insan sepsis araştırmacıların etiyolojisi araştırmak için farklı hayvan modelleri geliştirdik. En yaygın olarak kullanılan klinik modeli çekal ligasyon ve ponksiyon (CLP). CLP modeli periton boşluğuna fekal madde salınımını polimikrobiyal enfeksiyon tarafından uyarılan bir şiddetlenir bağışıklık yanıtı oluşturmak için izin çekum perforasyonu oluşur. Bu model, klinik olarak anlamlı olan insan bir koşulu yerine getirmektedir. İnsanlarda olduğu gibi, sıvı resüsitasyon CLP geçiren fareler zaman içinde ikinci (geç) hypodynamic aşaması ilerledikçe ilk (erken) hiperdinamik faz göstermektedir. Buna ek olarak, sitokin profili insan sepsis lenfosit apoptozis (gözden 4,5) artmış olduğu görülen benzer. Sepsis dahil birden fazla ve üst üste mekanizmaları nedeniyle, araştırmacılar, tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kontrollü şiddeti uygun bir sepsis modeli gerekir.
Protocol
1. İnsan Sepsis Fare Modeli çekal ligasyon ve Delinme
Bu yordamı C57BL / 6 farelerinde (eski 7-9 hafta) kullanılır.
- Intraperitoneal 01:01 ketamin (75mg/kg) ve ksilizin (15mg/kg) bir çözüm enjekte fare anestezisi. Bir referans olarak, 20 gram ağırlığında bir fare 1:1 çözüm 30 ul enjekte edilir. Alternatif olarak, fare, bir anestezik vaporizatör kullanılarak inhale izofluran ile anestezi olabilir.
- Fare karın Tıraş ve% 70 alkol sürüntü (aşağıdaki resim dizisi 1 numara) ile silerek ilk uygulayarak betadin çözüm alanı dezenfekte. Klorheksidin alternatif bir antiseptik olarak kullanılabilir. İsteğe Bağlı: alanını temiz steril bir örtüyü korumak için kullanılıyor olabilir.
- Aseptik koşullar altında, 1 ila 2 cm orta hat laparotomi uygulama ve bitişik bağırsak (2 ve 3) ile çekum maruz.
- 6.0 ipek sütür (6-0 prolen, 8680G; Ethicon) ile çekum sıkıca bağlandı, bağırsak-çekal kapak altında baz ve aynı delikli bir veya iki kez bir 19-gauge iğne (4 ve 5) çekum tarafında. Çekum ligasyonu noktası distal ucu mesafe olarak tanımlanan bağlanan çekum uzunluğu şiddetinin derecesini belirlemek olacağını lütfen unutmayınız. > 1cm mesafe yüksek dereceli sepsis ≤ 1 cm mesafe, orta-düşük dereceli sepsis üretir üretir. Ayrıca, burada gösterilen çekum perforasyonu yöntemi kullanarak ve ponksiyon tekniği ile (çekum bir iğne tanıtan) ile standart farklı olduğunu unutmayın. Her iki yöntem de aynı sepsis sonucu güvenilir bir şekilde üretirler. Ancak, bir dezavantajı yoluyla yoluyla tekniği çekum sıkılmış ekstrüde dışkı miktarı kontrol kolaylaştırmakla kalmaz ki.
- Çekum perforasyonu siteleri (6), küçük bir miktarda dışkı a'ya yavaşça sıkılmış. Çekum periton boşluğuna geri döndü ve periton 6.0 ipek dikişlerle kapatılır. (7).
- Cilt Refleks 7mm klipleri (RS-9258, Roboz Cerrahi Aletler) ya da Michel yara klipleri (7 mm, RS-9270) (8) ile kapatılır.
- Subkutan 1 ml 25G iğne kullanılarak, önceden ısıtılmış% 0.9 salin solüsyonu enjekte edilerek farelerin Resüsite. Bu sıvı resüsitasyon önlemi sepsis hiperdinamik aşaması neden olacaktır. Bu kritik adım daha fazla tartışma bölümünde açıklanmıştır.
- İsteğe bağlı: subkutan enjekte buprenorfin (0.05mg / kg vücut ağırlığı) ya da ameliyat sonrası analjezi için tramadol (20mg/kg vücut ağırlığı). Bu opiatlar solunum ve hareket bastırmak için tavsiye edilebilir ve bu etkiler, sepsis belirtileri olarak yanlış yorumlanabilir.
- Hayvanların geçici olarak yerleştirilen bir ısıtma yastığı veya anestezi kurtarmak kadar alternatif bir kızılötesi ısıtma 150W lamba pozlama ile bir kafes hemen döndü. Iyileşme süresi 1 saat 30 dk.
- Kafesin altına yerleştirilen yiyecek ve su (hidrojel) ücretsiz erişim sağlayın.
- Fare, 1-2 hafta boyunca hayatta kalmak için her 12 saat denetim altında tutulan ya da farklı zaman noktalarında farklı parametrelerin analizi için ötenazi vardır.
Deneysel tasarım için kontrol olarak, sahte hayvanlar ligasyonu ve delinme olmadan laparotomi tekniği takip edecek.
Altı ila 12 saat sonra cerrahi işlem fareler uyuşuk olmak ve ateş, piloerection, ishal huddling, ve halsizlik gelişir; sepsis belirtileri. Çok ağır sepsis Fare ancak ölüm öncesinde hareket ve vücut ısısı dramatik bir azalma gösterirler. Bu adım fareler uzun süreli ağrı ve acı önlemek için ötenazi olmalı.
2. En Yaygın Analiz Parametreleri
Prosedürünün sonuçlarını değerlendirmek için farklı parametreler, organların, hücre özleri veya vücut sıvıları analiz edilebilir. Örnekleri cerrahi işlem bir hafta sonra 3 saat kadar farklı zaman noktalarında toplanabilir.
- Fareler hayatta kalma.
- Serum, peritoneal kavite ve organ özleri Sitokinler ve kemokinler.
- İnterlökin-6: monositler, dendritik hücreler, makrofajlar, B hücreleri, T hücreleri, granülositler, mast hücreleri ve daha birçok hücre tipleri tarafından üretilen ve piyasaya. Bu akut faz reaksiyonu ve inflamasyon önemli bir rol oynar.
- Tümör nekroz faktörü-α: pleiotrofik sitokin inflamasyon ve apoptosis merkezi bir rol oynar. , Monositler, makrofajlar, nötrofiller, dendritik hücreler ve fibroblastlar tarafından üretilir.
- nterleukin-1β: monositler, NK hücreleri, dendritik hücreler, B hücreleri ve T hücreleri tarafından üretilir. Ateş ve akut faz protein sentezini indükler.
- İnterlökin 10: fagositik alımı ve Th2 yanıtları teşvik ama antig bastırırtr sunum ve Th1 proinflamatuvar yanıtları.
- İnterlökin 10: fagositik alımı ve Th2 yanıtları teşvik ama antijen sunumu ve Th1 proinflamatuvar yanıtları bastırır.
- Monosit kemotaktik protein-1 (CCL2 olarak da bilinir): Acemi monositler, bellek T hücreleri ve doku hasarı ve enfeksiyon sitelerine dendritik hücreler .
- KC (CXCL1): makrofaj ve endotel hücreleri tarafından üretilir. Fare KC güçlü bir nötrofil cezbedici ve aktivatör.
- RANTES: monosit kemoatraktan. Unstimulated CD4 chemoattract + / CD45RO + bellek T hücreleri ve uyarılmış CD4 + ve na ve ve hafıza fenotipleri ile CD8 + T hücreleri.
- İnterferon-γ: Th1 hücreleri, sitotoksik T hücreleri, dendritik hücreler ve doğal öldürücü (NK) hücreleri tarafından salgılanan. Antijen sunumu ve makrofajlarda litik aktivite artırır ve Th2 hücre aktivitesi bastırır. Yapışma ve bağlama lökosit göçü için gerekli teşvik ve NK hücre aktivitesini destekler.
- Yüksek hareketliliği grubu B-1 proteininin: monositler bir nükleer faktör kappa B aktivatörü, sepsis geç fazda proinflamatuar mediatörlerin salınımını aktive, önceden glikasyon ürünleri (RAGE) hücresel reseptör bağlayıcı .
- Nötrofil infiltrasyonu bir önlem olarak organlarda miyeloperoksidaz belirlenmesi. Miyeloperoksidaz (MPO), peroksidaz enzim nötrofil granülositler en bol miktarda mevcut. Nötrofil azurophilic granül saklanan bir lizozomal protein. MPO, irin ve mukus bazı formları gibi nötrofillerin zengin salgıları, yeşil renk neden olan bir pigment, hem vardır.
- Bakteri sayısı mililitrede koloni oluşturan birimler olarak, organ ve kan akışı ölçmek yük.
3. Temsilcisi Sonuçlar
CLP prosedürü başlangıçta C57BL / 6 fare zorlanma yapıldı. Şekil 1 ve 2'de gösterildiği gibi, iğne ligasyonu ve kalınlığı uzunluğu değiştirerek sepsis şiddetini modüle çeşitli parametrelere test etti . Ligasyonu uzunluğu, bu iki faktör arasında, yüzde hayatta değiştirmek için iğne kalınlığında daha etkili gibi görünmektedir. ≤ 1cm ligasyonu sahip fareler ile karşılaştırıldığında,% 100 mortalite fazla 1cm ligasyonu uzunluğu artan bir artış, Şekil 1'de kışkırtır gösterilmiştir . Iğne kalınlığının arttırılması da iki delikler ile% 55 (19G iğne ile),% 100 (22G iğne kullanılarak) yüzde hayatta kalma azaldı. Ayrıca, farklı fare suşları CLP-kaynaklı sepsis, benzer veya farklı duyarlılık gösterilecek olup olmadığını belirlemek için C57BL / 6 ve 129SvJ fareler üzerinde CLP etkisi test edilmiştir. Şekil 3'te görüldüğü aynı koşullar altında, yüzde bir artış ölüm ile gösterilir C57BL / 6, daha 129SvJ farelerin enfeksiyona karşı daha duyarlı olduğunu.
Şekil 1. C57BL / 6 farelerin iki farklı boyda çekal ligasyon kullanarak hayvanın hayatta kalma çekum ligasyonu uzunluğu etkisi CLP yapıldı. Bu tek parametre 1 cm yaklaşık bir ligasyonu alana sahip bir hayvan grubu ile kıyaslandığında en az 3 gün içinde öldü 1 cm'den daha uzun bir ligasyonu alana sahip gruptaki hayvanların tüm bu yana dramatik bir hayvan hayatta kalma etkiler. (N = 8).
Şekil 2. C57BL / 6 fareler kullanarak iki farklı iğnelerin, 19G ve 22G iğne kalınlığında sağkalım üzerine etkisi. CLP yapıldı. 19G iğne ile perfore çekum Fareler sağkalımı% 55-60 gösterdi. Buna karşılık, ilk 3-4 gün boyunca inflamasyon tipik belirtileri deneyimli olmasına rağmen, 22G iğne ile perfore çekum ile farelerin% 100 hayatta kalma gösterdi; (n = 8) 4 gün sonra kayboldu.
Şekil 3. Iki farklı fare suşları arasında sepsis duyarlılık karşılaştırılması. CLP modeli, aynı koşullar altında 129SvJ ve C57BL / 6 yapıldı . 129SvJ suşu değerlendirme süresi sonunda yüzde sağkalım polimikrobiyal enfeksiyon tarafından indüklenen inflamasyon daha yüksek bir duyarlılık gösteren C57BL / 6 zorlanma göre% 25 daha az idi. (N = 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada farelerde CLP modeli nasıl gerçekleştirmek için ayrıntılı göstermek ve şiddetinin derecesi modüle.
Sepsis diğer hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında, CLP, farklı yaş ve cinsiyet herhangi bir fare zorlanma yapılabilir. Bu nispeten kolay ve ucuz bir cerrahi işlemdir. Bu modelde, şiddet derecesi hayatta kalma oranı üzerinde doğrudan bir etkisi vardır. Ligasyonu uzunluğu, iğne kalınlığı ve delikler sayısı, şiddeti CLP mortalite / modüle kontrol edilebilir parametreler. Sonuç olarak, şiddeti hafif değişiklikler iğne kalınlığı ayarlayarak sokulabilir dramatik değişiklikler CLP şiddeti elde etmek için, kullanıcı ligasyonu uzunluğunu değiştirebilirsiniz.
Diğer önemli parametreler CLP sonuçları önemli bir değişkenlik tanıtmak fare suşu 6,7, cinsiyet, 8 ve 9 hayvanın yaşı. Bu bağlamda, aynı koşullar altında yapıldığında farklı fare suşlarının prosedür farklı duyarlılıkları ekran göstermektedir. Gerçekten de, plazma sitokin düzeyleri ve doku hasarı farklılıklar, farklı fare suşlarının 10-12 arasında tespit edilmiştir . Sıvı resüsitasyon dahil edilmesi ve analjezik yönetim CLP modeli önemli bir değişkenlik tanıtmak faktörleri. Örneğin, sıvı resüsitasyon böylece potansiyel terapötik müdahalelerin etkileri maskeleme erken pro-inflamatuar sitokinlerin 11, 13, 14 üretim azalması muhtemelen hayatta kalma oranı artar. Buna karşılık, narkotik analjezikler hayvan solunum ve hareket bastırmak ve geri dönüşü olmayan bir etkisi sepsis ilgisiz kışkırtmak. Bunların kullanımı, bu nedenle sağ kalım oranı ve immün hücre fonksiyonu 15 etkileyebilir.
Sonuç olarak, CLP modeli yaparken tüm bu koşullar ve teknik parametreler dikkatle tekrarlanabilir ve tutarlı sonuçlar elde etmek için dikkate alınması gerekir. Bu nedenle, işlemin derin bir bilgi ve mastering kesinlikle doğru CLP modeli gerçekleştirmek için gerekli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Pennsylvania Sağlık Bakanlığı bir hibe ile desteklenmiştir.
Dr. Miguel Garcia Toscano Alfonso Martin Escudero Vakfı tarafından finanse edilen bu çalışma sırasında Temple Üniversitesi'nde bir doktora sonrası Üyesi oldu.
Biz Iliya Yordanov ve Kevin Kotredes video yapmak için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Ketaset | 0856-2013-01 | |
| Xylazine | AnaSed | NADA# 139-236 | |
| Insulin syringe 29G | Excel Scientific | 26028 | |
| Silk suture, 6-0 PROLENE | Ethicon Inc. | 8680G | |
| 19G and 25G Needle | BD Biosciences | 305186 | |
| Shaver | General Supply | General supply | |
| Infrared Heating lamp | General Supply | General supply | |
| Michel wound clips 7mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9270 | |
| Ear Loop Mask | Fisher Scientific | 19-130-4181 | |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6702 | |
| Betadine solution | VWR international | 63410-992 | |
| Surgical forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 70% Isopropyl alcohol pad | Fisher Scientific | 22-031-350 | |
| Buprenorphine | Bedford Laboratories | 55390-100-10 | |
| Tramadol | Sigma-Aldrich | 42965 |
References
- Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).
- Riedemann, N. C., Guo, R. F., Ward, P. A. The enigma of sepsis. J Clin Invest. 112, 460-467 (2003).
- Eichacker, P. Q., Gerstenberger, E. P., Banks, S. M., Cui, X., Natanson, C. Meta-analysis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome trials testing low tidal volumes. Am J Respir Crit Care Med. 166, 1510-1514 (2002).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
- Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J Surg Res. 102, 45-49 (2002).
- De Maio, A., Torres, M. B., Reeves, R. H. Genetic determinants influencing the response to injury, inflammation, and sepsis. Shock. 23, 11-17 (2005).
- Diodato, M. D., Knoferl, M. W., Schwacha, M. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. Gender differences in the inflammatory response and survival following haemorrhage and subsequent sepsis. Cytokine. 14, 162-169 (2001).
- Turnbull, I. R. Effects of age on mortality and antibiotic efficacy in cecal ligation and puncture. Shock. 19, 310-313 (2003).
- Miyaji, T. Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice. Kidney Int. 64, 1620-1631 (2003).
- Torres, M. B., De Maio, A. An exaggerated inflammatory response after CLP correlates with a negative outcome. J Surg Res. 125, 88-93 (2005).
- Doi, K. AP214, an analogue of alpha-melanocyte-stimulating hormone, ameliorates sepsis-induced acute kidney injury and mortality. Kidney Int. 73, 1266-1274 (2008).
- Wilson, M. A. Fluid resuscitation attenuates early cytokine mRNA expression after peritonitis. J Trauma. 41, 622-627 (1996).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Med. 35, 748-754 (2009).
- Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34, 250-260 (2010).
