Summary
O modelo do rato de ligadura e punção cecal como uma ferramenta valiosa para o estudo da sepse humana.
Abstract
Sepse humana é caracterizada por um conjunto de reações sistêmicas em resposta à infecção intensivo e massivo que não conseguiu ser contido localmente pelo anfitrião. Atualmente, ocupa o sepse entre os dez maiores causas de mortalidade nas unidades de terapia intensiva EUA 1. Durante a sepse, há duas fases estabelecidas hemodinâmicas que podem se sobrepor. A fase inicial (hiperdinâmico) é definido como uma produção maciça de citocinas pró-inflamatórias e espécies reativas de oxigênio por macrófagos e neutrófilos, que afeta a permeabilidade vascular (levando à hipotensão), a função cardíaca e induz a alterações metabólicas, culminando com necrose de tecidos e falência de órgãos. Consequentemente, a causa mais comum de mortalidade é lesão renal aguda. A segunda fase (hipodinâmicos) é um processo anti-inflamatório envolvendo apresentação de antígenos alterados monócitos, diminuição da proliferação de linfócitos e função e aumento da apoptose. Este estado conhecido como imunossupressão ou depressão imunológica aumenta consideravelmente o risco de infecções nocosomial e, finalmente, a morte. Os mecanismos destes processos fisiopatológicos não estão bem caracterizados. Porque ambas as fases da sepse pode causar danos irreversíveis e irreparáveis, é essencial para determinar o estado imunológico e fisiológicas do paciente. Esta é a principal razão pela qual muitas drogas terapêuticas falharam. A mesma droga dada em diferentes estágios de sepse pode ser terapêutico ou de outra forma prejudicial ou não têm nenhum efeito 2,3. Para entender sepse em vários níveis é fundamental para ter um modelo animal adequado e abrangente, que reproduz o curso clínico da doença. É importante caracterizar os mecanismos fisiopatológicos que ocorrem durante a sepse e controlar as condições do modelo para testar potenciais agentes terapêuticos.
Para estudar a etiologia da sepse humana pesquisadores desenvolveram diferentes modelos animais. O modelo mais utilizado é a ligadura cecal clínicos e punção (CLP). O modelo CLP consiste na perfuração do ceco permitindo a liberação de material fecal na cavidade peritoneal para gerar uma resposta exacerbada imune induzida por infecção polimicrobiana. Este modelo cumpre a condição humana que é clinicamente relevante. Como em humanos, ratos que passam por CLP com reposição volêmica mostram a fase (início), primeiro hiperdinâmica que com o tempo progride para a fase (final) segundo hipodinâmicos. Além disso, o perfil de citocinas é semelhante ao observado na sepse humana, onde há aumento da apoptose de linfócitos (revisto em 4,5). Devido aos mecanismos de múltiplas e sobrepostas envolvidos na sepse, os pesquisadores precisam de um modelo adequado de gravidade da sepse controlada a fim de obter resultados consistentes e reprodutíveis.
Protocol
1. Ligadura cecal e punção como um modelo de camundongo para Sepsis Humanos
Para este procedimento C57BL / 6 ratos (7-9 semanas de idade) são utilizados.
- Anestesiar o rato pela injeção intraperitoneal de uma solução de 1:1 de quetamina (75mg/kg) e xilazina (15mg/kg). Como referência, injetar 30 mL da solução de 1:01 em um rato pesando 20 gramas. Alternativamente, os camundongos podem ser anestesiados com isoflurano inalado através de um vaporizador anestésico.
- Raspar o abdome do rato e desinfectar área pela solução betadine primeira aplicação seguido por limpeza com uma gaze com álcool 70% (número 1 na seqüência imagem abaixo). Clorexidina pode ser utilizada como um anti-séptico alternativa. Opcional: uma cortina estéril pode ser usada para manter a área limpa.
- Sob condições assépticas, uma prática 1 a 2 cm laparotomia mediana e expor o ceco com intestino adjacente (2 e 3).
- O ceco é firmemente ligada com um fio de seda 6.0 (6-0 PROLENE, 8680G, Ethicon) em sua base abaixo da válvula íleo-cecal, e é perfurado uma ou duas vezes com uma agulha de calibre 19 (4 e 5) na mesma lado do ceco. Por favor, note que o comprimento do ceco ligada definido como a distância entre a extremidade distal do ceco ao ponto de ligadura vai determinar o grau de severidade. A distância de> um centímetro produz sepse de alta qualidade, enquanto uma distância de 1 cm ≤ produz meio-de-baixo grau sepse. Observe também que utilizando o método de perfuração cecal mostrado aqui é diferente do padrão através de e através da técnica de punção (introdução de uma agulha através do ceco). Ambos os métodos de produzir o resultado confiável sepse mesmo. No entanto, uma desvantagem da técnica de ponta a ponta é que não facilita controlar a quantidade de fezes extrudados quando o ceco é espremido.
- O ceco é, então, pressiona suavemente para expulsar uma pequena quantidade de fezes dos locais de perfuração (6). O ceco é retornado para a cavidade peritoneal e peritônio é fechado com 6,0 suturas de seda. (7).
- A pele é fechada com grampos Reflex 7mm (RS-9258, Instrumentos Cirúrgicos Roboz) ou grampos de sutura Michel (7 mm, RS-9270) (8).
- Ressuscitar ratos através da injeção por via subcutânea 1 ml de solução pré-aquecido 0,9% com uma agulha de 25G. Esta medida fluidoterapia irá induzir a fase hiperdinâmica da sepse. Este passo crítico é descrito mais adiante na seção de discussão.
- Opcional: Inject por via subcutânea buprenorfina (0,05 mg / kg de peso corporal) ou tramadol (20mg/kg peso corporal) para analgesia pós-operatória. Ser advertidos de que estes opiáceos pode suprimir a respiração e locomoção e estes efeitos podem ser interpretados como sinais de sepsis.
- Os animais são colocados temporariamente em uma almofada de aquecimento ou, alternativamente, voltou imediatamente para uma gaiola com a exposição a uma lâmpada de aquecimento infravermelho de 150W, até que se recuperar da anestesia. O tempo de recuperação é de 30 min a 1 hora.
- Fornecer acesso livre à comida e água (hidrogel) colocado no fundo da gaiola.
- Ratos são monitorados a cada 12 horas para a sobrevivência de uma a duas semanas ou eutanásia em momentos diferentes para análise de parâmetros diferentes.
Como controle para o projeto experimental, os animais sham iria seguir a técnica de laparotomia sem ligadura e punção.
Seis a 12 horas após o procedimento cirúrgico os ratos se tornarão letárgicos e desenvolver febre, piloereção, diarréia, encolhendo-se, mal-estar e, todos os sintomas de sepse. Camundongos com sepse grave muito mal consegue se mover antes da morte e exibem uma diminuição drástica da temperatura corporal. Neste ratos etapa deve ser sacrificados para evitar a dor e sofrimento prolongado.
2. Mais comuns Parâmetros Analisados
Para avaliar o resultado do procedimento, diversos parâmetros podem ser analisados em órgãos, extratos celulares ou fluidos corporais. Amostras podem ser coletadas em momentos diferentes de 3 horas para uma semana após o procedimento cirúrgico.
- Sobrevivência camundongos.
- Citocinas e quimiocinas na cavidade, soro peritoneal e extratos de órgãos.
- Interleucina-6: Produzido e lançado por monócitos, células dendríticas, macrófagos, células B, células T, granulócitos, mastócitos e tipos de células muito mais. Ela desempenha um papel importante na reação de fase aguda e inflamação.
- Fator de necrose tumoral α: Pleiotrophic citocina que desempenha um papel central na inflamação e apoptose. Produzido por monócitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas e fibroblastos.
- nterleukin-1β: Produzido por monócitos, células NK, células dendríticas, células B e células T. Induz febre e síntese de proteínas de fase aguda.
- Interleucina 10: Promove a absorção fagocíticas e Th2, mas suprime antigen apresentação e respostas Th1 pró-inflamatórias.
- Interleucina 10: Promove a absorção fagocíticas e Th2, mas suprime a apresentação de antígenos e respostas Th1 pró-inflamatórias.
- Monócitos quimiotáticos proteína-1 (também conhecido como CCL2): Recrutas monócitos, células T de memória e células dendríticas aos locais de lesão tecidual e infecção.
- KC (CXCL1): Produzido por macrófagos e células endoteliais. KC rato é um atrativo de neutrófilos potente e ativador.
- RANTES: A quimiotática de monócitos. Pode chemoattract CD4 unstimulated + / CD45RO + células de memória T CD4 e estimulado + e CD8 + T com nd ve e fenótipos de memória.
- Interferon-γ: Secretada por células Th1, células T citotóxicas, células dendríticas e natural killer (NK). Aumenta a apresentação de antígenos e atividade lítica de macrófagos e suprime a atividade das células Th2. Promove a adesão e de ligação necessários para a migração de leucócitos e promove a atividade das células NK.
- Alta mobilidade do grupo B-1 de proteínas: No monócitos é um fator nuclear kappa B ativador pela ligação ao receptor celular para produtos de glicação antecedência final (RAGE), ativando a liberação de mediadores pró-inflamatórios na fase tardia da sepse.
- Determinação mieloperoxidase em órgãos como medida de infiltração de neutrófilos. Mieloperoxidase (MPO) é uma enzima peroxidase presente em abundância na maioria dos granulócitos neutrófilos. É uma proteína lisossomal armazenado em grânulos azurófilos dos neutrófilos. MPO tem um pigmento heme, que faz com que sua cor verde nas secreções ricas em neutrófilos, como o pus e algumas formas de muco.
- Bactérias carga em órgãos e sangue, medida como o número de unidades formadoras de colônia por mililitro.
3. Resultados representante
O procedimento CLP foi realizada inicialmente em camundongos C57BL / 6. Testamos vários parâmetros para modular a gravidade da sepse, alterando o comprimento da ligação e da espessura da agulha, conforme mostrado nas Figuras 1 e 2. Entre esses dois fatores, o comprimento da ligadura parece ser mais eficaz do que a espessura da agulha para alterar a sobrevivência por cento. Conforme mostrado na Figura 1, aumentando o comprimento da ligação por mais de um centímetro provoca um aumento da mortalidade de 100% em comparação com camundongos com uma ligadura de ≤ 1cm. Aumentando a espessura da agulha também diminuiu a sobrevivência por cento de 100% (com uma agulha 22G) para 55% (usando uma agulha 19G) com dois furos. Também testamos o efeito do CLP em camundongos C57BL / 6 e 129SvJ ratos para determinar se diferentes linhagens de camundongos mostrar susceptibilidade semelhantes ou distintas para CLP-induzida a sepse. A Figura 3 mostra que, nas mesmas condições, os ratos foram 129SvJ mais suscetíveis à infecção do que C57BL / 6, indicado por uma porcentagem de mortalidade aumentou.
Figura 1. Efeito do comprimento da ligadura do ceco na sobrevivência animal. CLP foi realizada em camundongos C57BL / 6 com dois diferentes comprimentos de ligadura cecal. Este único parâmetro afeta drasticamente a sobrevida do animal desde que todos os animais do grupo com uma área de ligação mais do que 1 cm morreu em menos de três dias quando comparados com um grupo de animais com uma área de ligadura de 1 cm aprox. (N = 8).
Figura 2. Influência da espessura da agulha sobre a sobrevivência. CLP foi realizada em camundongos C57BL / 6 com dois tamanhos diferentes da agulha, 19G e 22G. Camundongos com o ceco perfurado com uma agulha de 19G mostrou uma sobrevida de 55-60%. Em contraste, os ratos com o ceco perfurado com uma agulha de 22G mostrou 100% de sobrevivência, embora eles experimentaram sintomas típicos de inflamação durante os primeiros 3-4 dias, o que desapareceu depois de 4 dias (n = 8).
Figura 3. Comparação da susceptibilidade a sepse entre duas linhagens de camundongos diferentes. O modelo CLP foi realizada em 129SvJ e C57BL / 6, nas mesmas condições. No final do período de avaliação por cento a sobrevivência da cepa 129SvJ foi de 25% menos do que na cepa C57BL / 6, indicando uma maior susceptibilidade à inflamação induzida por infecção polimicrobiana. (N = 6).
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Discussion
Aqui nós mostramos em detalhes como realizar o modelo CLP em camundongos e modular o grau de severidade.
Comparado a outros modelos animais de sepse, CLP pode ser realizado em qualquer tensão do rato de diferentes idades e sexo. É um procedimento relativamente fácil e barato cirúrgico. Neste modelo, o grau de gravidade tem um impacto direto sobre a porcentagem de sobrevivência. O comprimento da ligação, a espessura da agulha e do número de punções são parâmetros que podem ser controlados para modular a gravidade / mortalidade da CLP. Conseqüentemente, para obter mudanças dramáticas em termos de gravidade CLP, o usuário pode alterar o comprimento da ligadura, enquanto ligeira modificação na gravidade pode ser introduzido, ajustando a espessura da agulha.
Outros parâmetros importantes que poderiam introduzir uma variabilidade substancial nos resultados do CLP são a tensão do rato 6,7, sexo 8 e idade do animal 9. A este respeito, mostram que linhagens de camundongos de exibição diferente suscetibilidades distintas para o procedimento quando realizado sob as mesmas condições. De fato, as diferenças nos níveis plasmáticos das citocinas e danos nos tecidos foram detectados entre linhagens de camundongos diferentes 10-12. Inclusão de reposição volêmica e administração de analgésicos são fatores que podem introduzir uma variabilidade significativa no modelo CLP. Por exemplo, reposição volêmica aumenta taxa de sobrevivência, possivelmente diminuindo a produção de início de citocinas pró-inflamatórias 11, 13, 14 mascarando os efeitos de potenciais intervenções terapêuticas. Em contraste, analgésicos narcóticos pode suprimir a respiração e na locomoção do animal e provocar um efeito irreversível não relacionada à sepse. Seu uso, portanto, pode influenciar a taxa de sobrevivência e função das células imunes 15.
Em conclusão, ao executar o modelo CLP em todas estas condições e os parâmetros técnicos devem ser cuidadosamente considerados, a fim de obter resultados reprodutíveis e consistentes. Portanto, um profundo conhecimento e domínio do procedimento é absolutamente necessário para executar o modelo CLP com precisão.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma concessão do Departamento de Saúde da Pensilvânia.
Dr. Miguel Garcia Toscano foi um pós-doutorado na Universidade de Temple, financiado pela Fundação Martin Alfonso Escudero durante este estudo.
Queremos agradecer Iliya Yordanov e Kevin Kotredes para a confecção do vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Ketaset | 0856-2013-01 | |
| Xylazine | AnaSed | NADA# 139-236 | |
| Insulin syringe 29G | Excel Scientific | 26028 | |
| Silk suture, 6-0 PROLENE | Ethicon Inc. | 8680G | |
| 19G and 25G Needle | BD Biosciences | 305186 | |
| Shaver | General Supply | General supply | |
| Infrared Heating lamp | General Supply | General supply | |
| Michel wound clips 7mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9270 | |
| Ear Loop Mask | Fisher Scientific | 19-130-4181 | |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6702 | |
| Betadine solution | VWR international | 63410-992 | |
| Surgical forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 70% Isopropyl alcohol pad | Fisher Scientific | 22-031-350 | |
| Buprenorphine | Bedford Laboratories | 55390-100-10 | |
| Tramadol | Sigma-Aldrich | 42965 |
References
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