Summary
Мышиной модели слепой кишки перевязки и проколы, как ценным инструментом для изучения человеческих сепсиса.
Protocol
1. Лигирование слепой кишки и прокол, как мышь Модель по правам Сепсис
Для этой процедуры C57BL / 6 мышей (7-9 недель) используются.
- Анестезию мыши путем введения внутрибрюшинно раствор 1:1, кетамина (75mg/kg) и ксилазина (15мг/кг). В качестве примера можно вводить 30 мкл раствора в 1:01 мышь весом 20 граммов. Кроме того, мышь может быть анестезии ингаляционными изофлуран использования испарителя анестетиков.
- Бритье брюшко мыши и дезинфекции области, первое применение бетадин решение следует вытирая с 70% спиртом (номер 1 на рисунке последовательности ниже). Хлоргексидин может быть использован как альтернативный антисептиком. Дополнительно: стерильный драпировка может быть использована для поддержания в чистоте.
- В асептических условиях, практика 1 до 2 см срединной лапаротомии и подвергать слепой кишки с прилегающей кишечника (2 и 3).
- Слепая кишка плотно лигировали с 6,0 шелковых шва (6-0 PROLENE, 8680G; Ethicon) на его базе ниже подвздошно-слепой кишки клапан, и перфорированные один или два раза с 19-иглы (4 и 5) на том же стороны слепой кишки. Пожалуйста, обратите внимание, что длина лигируют слепой кишки определяется как расстояние от дистального конца слепой кишки перевязки точка будет определять степень тяжести. Расстоянии> 1 см производит высококачественных сепсисом при расстоянии ≤ 1 см производит средне-и низкосортных сепсиса. Также обратите внимание, что использование метода слепой кишки перфорация, показанный здесь, отличается от стандартного насквозь проколов техника (введение иглы через слепой кишки). Оба способа надежно производить тот же исход сепсиса. Однако один недостаток техники насквозь том, что она не способствует регулирования количества кала экструдированного, когда слепая кишка сжимается.
- Слепая кишка затем мягко сжала чтобы выдавить небольшое количество кала от перфорации сайтов (6). Слепая кишка возвращается в брюшную полость и брюшины закрыта с 6,0 швов шелка. (7).
- Кожа закрыта с 7 мм клипы Reflex (RS-9258, Roboz Хирургические инструменты) или Мишель раны клипов (7 мм, RS-9270) (8).
- Resuscitate мышей путем введения подкожно 1 мл подогретого 0,9% солевого раствора с использованием 25G иглу. Эта жидкость мера реанимации будет побуждать гипердинамического фазы сепсиса. Это важный шаг описан далее в разделе обсуждения.
- Дополнительно: Inject подкожно бупренорфин (0.05mg / кг массы тела) или трамадола (20mg/kg массы тела) для послеоперационного обезболивания. Имейте в виду, что эти опиатов может подавлять дыхание и передвижения, и эти эффекты могут быть ошибочно интерпретированы как признаки сепсиса.
- Животные размещаются временно на грелку или же немедленно возвращены в клетку с воздействием инфракрасной лампой нагрева 150W, пока они не оправиться от наркоза. Время восстановления составляет от 30 мин до 1 часа.
- Обеспечить свободный доступ к пище и воде (гидрогель), размещенные на дно клетки.
- Мыши контролируются каждые 12 часов за выживание в течение одного-двух недель или эвтаназии в различные моменты времени для анализа различных параметров.
В качестве контрольных для опытно-конструкторских, шам животных будут следовать лапаротомии технику без перевязки и пункции.
От шести до 12 часов после хирургического мышей процедуры станут вялыми и развитие лихорадки, пилоэрекции, диарея, сбившись, и недомогание, и все признаки сепсиса. Мыши с очень тяжелым сепсисом едва ли могут двигаться до смерти и демонстрируют резкое снижение температуры тела. На данном этапе мышам должны быть умерщвлены, чтобы избежать длительной боли и страданий.
2. Наиболее распространенные анализируемых параметров
Для оценки результатов процедуры, различные параметры могут быть проанализированы в органах, клеточных экстрактов или другими биологическими жидкостями. Образцы могут быть собраны в различные моменты времени от 3 часов до одной недели после хирургического вмешательства.
- Мыши выживания.
- Цитокины и хемокинов в сыворотке крови, брюшной полости и органов экстрактов.
- Интерлейкина-6: Производство и выпущен моноциты, дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, Т-лимфоциты, гранулоциты, тучные клетки и многие другие типы клеток. Он играет важную роль в фазу острой реакции и воспаление.
- Фактор некроза опухоли-α: Pleiotrophic цитокина, который играет центральную роль в воспалении и апоптоза. Подготовлено моноциты, макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки и фибробласты.
- nterleukin-1β: Продюсеры моноциты, НК-клетки, дендритные клетки, В-клетки и Т-клеток. Вызывает лихорадку и синтез белков острой фазы.
- Интерлейкин 10: Способствует фагоцитарной поглощения и Th2 ответа, но подавляет antigан презентации и провоспалительных Th1 ответа.
- Интерлейкин 10: Способствует фагоцитарной поглощения и Th2 ответа, но подавляет презентации антигена и провоспалительных Th1 ответа.
- Моноцитарный хемотаксиса белка-1 (также известный как CCL2): Новобранцы моноциты, ячеек памяти T, и дендритные клетки к местам повреждения тканей и инфекции.
- KC (CXCL1): Продюсер макрофаги и эндотелиальные клетки. Мышь KC является мощным аттрактанта нейтрофилов и активатор.
- RANTES: моноцитов хемоаттрактант. Он может chemoattract нестимулированных CD4 + / CD45RO + Т-клеток памяти и стимулировало CD4 + и CD8 + Т-клеток с наивны и памяти фенотипы.
- Интерферон-γ: выделяемый Th1 клеток, цитотоксических Т-лимфоцитов, дендритных клеток и естественных киллеров (НК) клетки. Увеличивает презентации антигена и литической активности в макрофагах и подавляет активность клеток Th2. Способствует адгезии и обязательным, необходимые для миграции лейкоцитов и способствует активности клеток NK.
- Высокая мобильность группы В-1 белка: в моноцитов является ядерного фактора каппа-B активатора путем связывания с клеточным рецептором для продвижения гликирования конечных продуктов (RAGE), активизируя высвобождение провоспалительных медиаторов в поздней стадии сепсиса.
- Миелопероксидаза определения в органах в качестве меры нейтрофилов инфильтрации. Миелопероксидазы (МПО) является ферментом пероксидазой наиболее обильно присутствующие в нейтрофильных гранулоцитов. Это лизосомальных белков, хранящихся в азурофильных гранул нейтрофилов. МРО гема пигмент, который вызывает его в зеленый цвет выделений богат нейтрофилов, таких как гной и некоторые формы слизи.
- Бактерии нагрузки в органах и крови, измерить как количество колониеобразующих единиц на миллилитр.
3. Представитель Результаты
Процедура CLP изначально производится в штамм мыши C57BL / 6. Мы протестировали несколько параметров для модуляции тяжести сепсиса, изменяя длину труб и толщина иглы как показано на рисунках 1 и 2. Среди этих факторов, но длина перевязки, кажется, более эффективным, чем толщина иглы изменить процент выживания. Как показано на рисунке 1, увеличение длины перевязки более чем на 1 см провоцирует рост смертности на 100% по сравнению с мышами, имеющие перевязки ≤ 1см. Увеличение толщины иглы также снизился процент выживаемости с 100% (с помощью иглы 22G) до 55% (с помощью иглы 19G) с двумя проколами. Мы также проверили влияние на CLP C57BL / 6 и 129SvJ мышей для определения различных линий мышей дисплей аналогичных или различных восприимчивость к CLP-индуцированной сепсисом. Рисунок 3 показывает, что при тех же условиях, 129SvJ мышей были более восприимчивы к инфекции, чем C57BL / 6, свидетельствует увеличение смертности процентов.
Рисунок 1. Влияние перевязки длина слепой кишки на животных выживание. CLP был выполнен в C57BL / 6 мышей с использованием двух различных длин слепой кишки труб. Это единственный параметр существенно влияет на выживаемость животных, так как все животные в группе с перевязкой площадь более 1 см умер менее чем за 3 дня по сравнению с группой животных, имеющих перевязки площадью 1 см прим. (П = 8).
Рисунок 2. Влияние толщины иглы на выживание. CLP был выполнен в C57BL / 6 мышей с использованием двух различных размеров иглы 19G и 22G. Мыши с использованием перфорированной слепой кишки 19G иглу показали 55-60% выживаемости. В отличие от мышей с использованием перфорированных слепой кишки 22G иглу показали 100% выживаемости, хотя они испытывали типичные симптомы воспаления в течение первых 3-4 дней, которые исчезли после 4 дней (п = 8).
Рисунок 3. Сравнение сепсис восприимчивости между двумя различными штаммами мыши. Модель CLP был выполнен в 129SvJ и C57BL / 6, на тех же условиях. В конце периода оценки процент выживания 129SvJ штамм был на 25% меньше, чем в C57BL / 6, напряжение, что указывает на более высокую восприимчивость к воспалению индуцированных полимикробная инфекции. (П = 6).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы подробно показать, как выполнить модель CLP у мышей и модулировать степени тяжести.
По сравнению с другими моделями животных сепсиса, CLP могут быть выполнены в любой мыши штамма разного возраста и пола. Это относительно простой и недорогой хирургической операции. В этой модели, степень тяжести имеет непосредственное влияние на процент выживания. Длина труб, толщина иглы и число проколов являются параметрами, которыми можно управлять для модуляции тяжести / смертность CLP. Следовательно, для получения резких изменений в CLP тяжести, пользователь может изменить длину лигирования в то время как небольшая модификация степени тяжести могут быть введены путем изменения толщины иглы.
Другими важными параметрами, которые могли бы ввести существенные различия в результатах CLP являются мыши штамма 6,7, пола 8 и возраста животного 9. В связи с этим мы покажем, что различные штаммы мыши обладают ярко выраженными восприимчивости к процедуре, когда производится на тех же условиях. В самом деле, различия в плазме крови уровня цитокинов и повреждение тканей были обнаружены между различными штаммами мыши 10-12. Включение инфузионной терапии и болеутоляющее администрации факторов, которые могут внести существенные различия в модели CLP. Например, инфузионной терапии увеличивает выживаемость возможно за счет уменьшения производства рано провоспалительных цитокинов, 11, 13, 14 таким образом маскировки последствий потенциального терапевтического вмешательства. В отличие от наркотических анальгетиков может подавлять дыхание и передвижения в животном и спровоцировать необратимые последствия не связаны с сепсисом. Их использование, таким образом, могут влиять на выживаемость и иммунной функции клеток 15.
В заключение, при выполнении CLP модели все эти условия и технические параметры должны быть тщательно продуманы, чтобы получить воспроизводимые и устойчивые результаты. Таким образом, глубокие знания и освоение Процедура абсолютно необходимо для выполнения CLP модель точно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Пенсильвании Министерства здравоохранения.
Доктор Мигель Гарсия Тоскано был докторской сотрудник в Университете Темпл, который финансируется Альфонсо Мартин Эскудеро Фонд в течение этого исследования.
Мы хотим поблагодарить Илья Йорданов и Кевин Kotredes для изготовления видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Ketaset | 0856-2013-01 | |
| Xylazine | AnaSed | NADA# 139-236 | |
| Insulin syringe 29G | Excel Scientific | 26028 | |
| Silk suture, 6-0 PROLENE | Ethicon Inc. | 8680G | |
| 19G and 25G Needle | BD Biosciences | 305186 | |
| Shaver | General Supply | General supply | |
| Infrared Heating lamp | General Supply | General supply | |
| Michel wound clips 7mm | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-9270 | |
| Ear Loop Mask | Fisher Scientific | 19-130-4181 | |
| Dissection scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6702 | |
| Betadine solution | VWR international | 63410-992 | |
| Surgical forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| 70% Isopropyl alcohol pad | Fisher Scientific | 22-031-350 | |
| Buprenorphine | Bedford Laboratories | 55390-100-10 | |
| Tramadol | Sigma-Aldrich | 42965 |
References
- Angus, D. C. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 29, 1303-1310 (2001).
- Riedemann, N. C., Guo, R. F., Ward, P. A. The enigma of sepsis. J Clin Invest. 112, 460-467 (2003).
- Eichacker, P. Q., Gerstenberger, E. P., Banks, S. M., Cui, X., Natanson, C. Meta-analysis of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome trials testing low tidal volumes. Am J Respir Crit Care Med. 166, 1510-1514 (2002).
- Buras, J. A., Holzmann, B., Sitkovsky, M. Animal models of sepsis: setting the stage. Nat Rev Drug Discov. 4, 854-865 (2005).
- Doi, K., Leelahavanichkul, A., Yuen, P. S., Star, R. A. Animal models of sepsis and sepsis-induced kidney injury. J Clin Invest. 119, 2868-2878 (2009).
- Godshall, C. J., Scott, M. J., Peyton, J. C., Gardner, S. A., Cheadle, W. G. Genetic background determines susceptibility during murine septic peritonitis. J Surg Res. 102, 45-49 (2002).
- De Maio, A., Torres, M. B., Reeves, R. H. Genetic determinants influencing the response to injury, inflammation, and sepsis. Shock. 23, 11-17 (2005).
- Diodato, M. D., Knoferl, M. W., Schwacha, M. G., Bland, K. I., Chaudry, I. H. Gender differences in the inflammatory response and survival following haemorrhage and subsequent sepsis. Cytokine. 14, 162-169 (2001).
- Turnbull, I. R. Effects of age on mortality and antibiotic efficacy in cecal ligation and puncture. Shock. 19, 310-313 (2003).
- Miyaji, T. Ethyl pyruvate decreases sepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice. Kidney Int. 64, 1620-1631 (2003).
- Torres, M. B., De Maio, A. An exaggerated inflammatory response after CLP correlates with a negative outcome. J Surg Res. 125, 88-93 (2005).
- Doi, K. AP214, an analogue of alpha-melanocyte-stimulating hormone, ameliorates sepsis-induced acute kidney injury and mortality. Kidney Int. 73, 1266-1274 (2008).
- Wilson, M. A. Fluid resuscitation attenuates early cytokine mRNA expression after peritonitis. J Trauma. 41, 622-627 (1996).
- Zanotti-Cavazzoni, S. L. Fluid resuscitation influences cardiovascular performance and mortality in a murine model of sepsis. Intensive Care Med. 35, 748-754 (2009).
- Hugunin, K. M., Fry, C., Shuster, K., Nemzek, J. A. Effects of tramadol and buprenorphine on select immunologic factors in a cecal ligation and puncture model. Shock. 34, 250-260 (2010).
