Écrans concurrentiel des bibliothèques génomiques de levure Barcoded

Summary

Nous avons développé complètes, impartiales échelle du génome écrans à comprendre gène-médicament et les interactions gènes-environnement. Méthodes de dépistage de ces collections de mutants sont présentées.

Abstract

En vertu de progrès dans les technologies de prochaine génération de séquençage, nous avons accès à de nouvelles séquences du génome presque quotidiennement. Le tempo de ces avances est l'accélération, en promettant une plus grande profondeur et la largeur. À la lumière de ces avancées extraordinaires, le besoin de méthodes rapides, parallèlement à définir la fonction des gènes devient de plus en plus important. Les collections de mutants de délétion du génome entier dans les levures et E. coli ont servi comme bêtes de somme pour la caractérisation fonctionnelle de la fonction des gènes, mais cette approche n'est pas extensible, le courant de gènes de suppression des approches nécessitent chacune des milliers de gènes qui composent un génome à être supprimé et vérifiées. C'est seulement après ce travail est terminé nous pouvons poursuivre le phénotypage à haut débit. Au cours des dix dernières années, notre laboratoire a affiné un portefeuille de la concurrence, miniaturisé et à haut débit l'ensemble du génome des dosages qui peuvent être effectuées en parallèle. Cette parallélisation est possible en raison de l'inclusion des «balises» de l'ADN, ou «code-barres," dans chaque mutant, avec le code à barres servant de proxy pour la mutation et l'on peut mesurer l'abondance de codes à barres pour évaluer l'aptitude de mutants. Dans cette étude, nous cherchons à combler le fossé entre la séquence d'ADN et de code-barres collections de mutants. Pour ce faire, nous introduisons un transposon combinés des perturbations-barcoding approche qui ouvre de tests de codes à barres parallèles à nouveau séquencé, mais mal caractérisé les microbes. Pour illustrer cette approche, nous présentons une nouvelle collection de Candida albicans perturbations code-barres et décrire comment les deux basé sur un microréseau et la prochaine génération de plates-formes basées séquençage peut être utilisé pour collecter 10.000 - 1.000.000 gène-gène et gène-médicament interactions en une seule expérience.

Protocol

1. Informations générales

Il ya plusieurs façons de générer des mutants qui portent étiquettes code-barres. La norme de référence actuelle est le KnockOut levure (YKO) collection créée par un consortium de laboratoires et achevé en 2002 ^1. Depuis l'origine YKO a été introduit, les collections d'autres levures ont été générés, en milieux souche différente, en utilisant la sur-expression des constructions, et dans d'autres microbes tels que E. coli ^2. En parallèle, l'effort de créer un code à barres des bibliothèques shRNA progresse rapidement, et en fait, de nombreux principes de conception de ces collections de mammifères ont été adoptées à partir de la levure. Pour démontrer comment les transposons code-barres peut être rapide, stratégie largement applicable pour la création systématique de collections de mutants, nous nous concentrons sur une seule collection, nous avons récemment créé dans le pathogène fongique humain, Candida albicans. Notre travail sur Candida était basée sur le succès des écrans de codes barres en S. cerevisiae, et est utilisée ici comme un organisme par exemple. Le protocole d'échantillonnage, avec des modifications mineures peuvent être utilisés pour dépister tout organisme qui peut être cultivé en culture en suspension. Parce que peu d'organismes ont des taux élevés de condition de transformation et de recombinaison mitotique efficaces nécessaires pour créer des mutants de délétion parfaite, en conséquence, nous avons développé un protocole qui utilise la mutagenèse in vitro pour transposon mutagénéiser une banque d'ADN génomique, puis transformé ces fragments génomiques code-barres dans les Candida albicans ^{3 , 4.} Inspiré par le succès de la collection originale YKO et son rôle dans les découvertes fondamentales sur la nature des gènes réseaux ^5-8, l'échelle du génome haplo ^9, cible de médicament et mécanisme d'action ^10,11, et l'essentialité de tous les gènes dans le génome ¹² nous prévoyons d'élargir cette approche à d'autres microbes seront extrêmement fructueux.

Le protocole ci-dessous suppose que la collection désirée mutant a été créé (par exemple, ou la collecte YKO Candida albicans perturbations) et est disponible en tant individuellement souches archivées. Pour une description détaillée de la construction de la souche voir ^1,13,14.

2. Combinez mutants individuels en un seul pool

1. Comptez une semaine pour produire des cellules aliquotes commun (peut être stocké indéfiniment à -80 ° C).
2. Décongeler les stocks de glycérol congelés pour les souches d'intérêt tout à fait, mais ne laissez pas décongeler les cellules restent pour> 2h.
3. Stériliser un outil broches de 96 puits, tremper l'outil dans la broche de l'eau pour enlever toutes les cellules restantes, suivi par deux trempettes dans des bains d'éthanol à 70% (par exemple, les couvercles pipette boîte de pointe), la flamme de l'outil de broche et laisser refroidir pendant 1 minute. Prendre soin de la flamme de l'outil de broche loin des bains d'éthanol. Le niveau des bains d'éthanol devrait dépasser le niveau dans le bain d'eau pour s'assurer que tous les reports cellules sont flambé et enlevé. Remplacer l'eau tous les 4-6 brochages.
4. Insérez l'outil de broches 96 puits stériles dans une dégelée plaque de 96 puits, agiter doucement et le transfert des cellules d'un bac contenant YPD Nunc Omni-agar, y compris l'antibiotique approprié. Cultivez des colonies jusqu'à ce qu'elles atteignent la taille maximale à 30 ° C (2-3d). Pour conserver les plaques, il nous paraît plus utile de regrouper quatre plaques de 96 puits sur un seul Omni-plateau avec ~ 384 souches.
5. Après les colonies se sont développées, noter toutes les souches manquantes ou à croissance lente et Repin celles-ci à ~ 2X la masse cellulaire comme le reste des souches.
6. Travailler dans un environnement de microbiologie (avec la flamme et du matériel de laboratoire stérile, la plaque d'inondation avec les médias 5-10 ml, faire tremper pendant 5 min et les colonies resuspendre avec un épandeur cellule. Verser le liquide ainsi que les cellules dans un tube à centrifuger conique de 50 ml, et ajouter du glycérol à 15% ou le DMSO à 7% (vol / vol).
7. Mesurer la DO ₆₀₀ de la piscine et ajustez (par dilution ou centrifugation) à une concentration finale de 50 ₆₀₀ OD / ml avec un milieu contenant du glycérol à 15% ou 7% de DMSO.
8. Aliquoter dans 40 volumes ul dans des tubes PCR de bande et congeler à -80 ° C.

3. La croissance piscine expérimental

Cette procédure est décrite dans la figure 1.

1. Aliquotes piscine dégel (dans des tubes PCR) sur la glace. Si vous n'utilisez pas la robotique, passez à l'étape 5.
2. Immédiatement diluée (gently!) la piscine dans les médias à la drogue ou la condition de choix, inoculant à une DO ₆₀₀ de 0,0625 dans un volume total de 700 ul dans une plaque de 48 puits. Inclure au moins un contrôle approprié du solvant sur la plaque. Pour les expériences qui se prolongent au delà de 5 générations de croissance (soit plus de 1 puits), remplir les puits adjacents avec les médias ou la condition de choix, mais pas de cellules.
3. Sceau avec un joint de la plaque en plastique; si l'état nécessite une croissance aérobie (par exemple, des sources de carbone non fermentescibles), utiliser une aiguille de calibre 21 pour percer les trous dans les membranes d'étanchéité vers le côté de chaque puits.
4. Croître dans un spectrophotomètre, en agitant à 30 ° C avec une détermination expérimentaleNed secouer le régime (par exemple, secouer 14 min à réglage le plus élevé (ou à température contrôlée agitateur), lire des puits, reprendre secouant). Une partie de la suspension de cellules peuvent être récoltées par le robot et enregistrées sur une plaque froide sur le pont robotique au définies par l'utilisateur des points temps de génération, typiquement 5, 10, 15 et 20 générations de croissance. (Http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html, pour plus de détails contactez C. Nislow ou G. Giaever).
5. Pour la croissance des cellules manuel, inoculer une culture de 50 ml à un point de départ DO ₆₀₀ de 0,002 dans un flacon de 250 ml de culture. Agiter à 30 ° C à 250 rpm jusqu'à atteindre une finale cellules DO ₆₀₀ de 2,0 (pour Saccharomyces ou Candida) pour ~ 10 générations de croissance. Générations de croissance supplémentaire peut être obtenue par les cellules de dilution à une DO600 de 2,0 à 0,02 revenir dans un flacon de frais.
6. Récolte d'au moins 2 ~ OD ₆₀₀ unités de cellules pour chaque échantillon / heure-point dans des microtubes Safe-Lock.

Remarque: Toujours prélever un échantillon de cellules de départ (c'est à dire un "point de T0 temps») pour évaluer la représentation de contrainte initiale dans toute piscine nouvellement créé en ajoutant 1-2 DO ₆₀₀ de la piscine directement du congélateur aliquotes à un tube de 1,5 ml et le traitement tel que décrit ci-dessous.

4. L'extraction d'ADN génomique, puces à ADN par PCR et d'hybridation ou de séquençage

1. Purifier l'ADN génomique à partir de ~ 2 DO ₆₀₀ de cellules avec le kit Zymo recherche YeaStar conformément aux instructions du fabricant (Protocole I, si en utilisant l'ADN de la levure), ou toute autre méthode appropriée spécifique à l'organisme d'intérêt (en standard d'extraction phénol / chloroforme suivie d'une précipitation d'alcool fonctionne bien pour les microbes divers). Si vous utilisez le kit YeaStar, éluer l'ADN avec 300 ul de TE 0,1 X au lieu de la uL 60 de TE 1X spécifiés dans le protocole. L'ADN génomique peut être stocké indéfiniment à -80 ° C.
2. Mettre en place des deux réactions PCR pour chaque échantillon, un pour le uptags et un pour le downtags, avec les conditions de la réaction comme suit: 33 ul ddH ₂ O, 6 pl de tampon 10X PCR sans MgCl _2, 3 pi 50 mM MgCl _2, 1,2 ul 10 mM de dNTPs, 1,2 ul 50 uM Up ou mélange d'amorces de Down, 0,6 ul 5 U / ul Taq polymérase, ~ 0,1 ug d'ADN génomique dans 15 pl. Le volume total est de 60 pi. Thermocycle dans les conditions suivantes: 94 ° C pendant 3 min, 30 cycles de 94 ° C 30s, 30s à 55 ° C, 72 ° C 30 ans, puis 72 ° C 3min, et maintenir à 4 ° C. Vérifiez les produits résultant de PCR sur un gel, un produit 60 pb pour les deux PCR est attendue pour amplicons utilisées pour l'hybridation et de 130bp des amplicons pour le séquençage de codes à barres). Les produits de PCR peut ensuite être stocké à -80 ° C indéfiniment.
3. Préchauffer le four à la température de l'hybridation à 42 ° C et mis en place un bain d'eau bouillante et seau à glace contenant une bouillie de glace-eau.
4. Pré-humides des tableaux par les remplit lentement avec 120 ul de tampon d'hybridation 1X.
5. Incuber dans le tampon d'hybridation à 42 ° C et 20 tours par minute pendant 10 minutes.
6. Préparer 90 ul de mélange d'hybridation par échantillon, plus un extra comme un tampon, comme suit: 75 pi de tampon d'hybridation 2X, 0,5 pi B213 oligonucléotide contrôle (0,2 fm / pi), 12 pl oligonucléotides mixtes (12h05 / ul), 3 pi 50X Denhardt solution) en lock-dessus tubes de 0,5 ml.
7. Ajouter 30 ul uptag PCR et 30 pl downtag PCR à 120 ul mélange d'hybridation pour un volume total de 150 pi. Faire bouillir pendant 2 minutes et mis dans l'eau glacée pendant au moins 2 minutes. Centrifuger brièvement les tubes avant utilisation.
8. Retirer le tampon de pré-hybridation à partir des tableaux et d'ajouter 90 ul hybridation / mix PCR. Pour éviter l'évaporation, la couverture des joints tableau avec une tache difficile-. Hybrider pendant 16 heures à 42 ° C, 20 rpm.
9. Fraîchement préparer 600 mélangez ul marquage à la biotine par échantillon, plus un supplémentaire, comme suit: 180 pl 20X SSPE, 12 pl 50X Denhardt, 6 pl 1% de Tween 20 (vol / vol), 1 pi 1 mg / ml de streptavidine-phycoérythrine, 401 ul ddH ₂ O. Magasin de tous les échantillons de streptavidine-PE dans l'obscurité. Aliquoter 600 pi en tubes de 2 ml. Enlever les taches de Tough-puces.
10. Retirer lentement mélange d'hybridation à partir des tableaux à la pipette et remplir microarrays avec 120 ul Laver A. Premier de la station d'Affymetrix fluidique.
11. Lavez les deux tableaux en utilisant une Affymetrix fluidique station selon les instructions du fabricant, en utilisant «Gene-Flex_Sv3_450" protocole avec les modifications suivantes: 1 étape supplémentaire avec lavage A (1 cycle, 2 mixes) avant la coloration, la température de lavage B 42 ° C au lieu de 40 ° C, une teinture à 42 ° C au lieu de 25 ° C. Il est également possible d'effectuer le lavage après l'hybridation, la coloration biotine, et le lavage après coloration manuelle (voir p. 396 en référence 15). Après les opérations de fluidique, exécutez la station fluidique »SHUTDOWN_450« protocole.
12. Après le lavage, s'assurer qu'aucune bulle d'air sont présents. Si nécessaire, ajouter 90 ul Laver Une pipette et lentement jusqu'à ce que les bulles disparaissent. S'il ya des marques ou smes juges sur la surface du tableau, nettoyer la vitre avec de l'isopropanol et un tissu non pelucheux. Appliquez de Tough-Spots sur les joints d'étanchéité / cloisons et le lieu des tableaux dans le scanner.
13. Numériser dans un scanner Affymetrix GeneArray à une longueur d'onde d'émission de 560 nm.

5. Analyse Array (voir Figure 2 pour un exemple obtenu en utilisant la collection de Candida albicans perturbations)

1. Masquage des valeurs aberrantes: Parce que le tableau d'Affymetrix tag4 contient 5 répliques de chaque code à barres dispersés au hasard de compléter n'importe quelle sonde de codes à barres qui s'écarte de la réplication peuvent être masqués et mis au rebut. Pour ce faire, pour chaque fonctionnalité de tableau qui semble être une donnée aberrante en fonction de son signal par rapport à l'autre 4 répétitions de cette fonctionnalité, notre logiciel examine d'abord les cinq éléments qui entourent la valeur aberrante suspect, réalisation d'une matrice de 25 fonctions avec le suspect fonction au centre. Si> 13/25 sondes dans cette région diffèrent de chacun de leurs différents de leur moyenne de reproduire parées (la moyenne des trois moyennes reproduit, à l'exclusion hauts et les bas répétitions) de plus de 10%, cette sonde est ensuite jeté de l'analyse. Parce que ces valeurs aberrantes sont le plus souvent le résultat d'incohérences lavage post-hybridation, nous étendre ou "pad" de la région contenant des sondes suspectes. Sondes Pad tel par toutes les sondes, y compris dans un rayon de 5 sonde, telle que définie par ((x _{1-x ²⁾ 2} + (y _{1-y ²⁾ 2)} ^½ <6, où x _1, x _2, y _1, et Y ₂ sont les coordonnées x et y pour les deux fonctions. Enfin, jetez fonctionnalités pour lesquelles l'écart-type (inclus dans le fichier. CEL pour Affymetrix) de pixels fonction / dire pixels fonction. Après avoir enlevé les valeurs aberrantes, les valeurs moyennes de l'intensité pour toutes les autres répliques.
2. Retrait de balises inutilisable: Balises de faible intensité des valeurs donnera mauvaise qualité des résultats et doit être enlevé. Une coupure d'exclusion pour ces sondes de faible intensité peut être calculée comme suit:
   1. Pour chaque paire de traitement de contrôle de tableaux, de calculer log ₂ ((i _{c-b g)} / (i _{t-b g))} pour chaque balise, où i _c est l'intensité de contrôle, je _t est l'intensité du traitement, et b _g est l'intensité moyenne des sondes tag non affectés.
   2. Paire du uptag et les ratios downtag par la souche et pour chaque paire de balises, prendre le minimum d'intensité pour les deux balises dans les deux échantillons. Trier les paires ratio par cette intensité minimum.
   3. Utilisez une taille de fenêtre coulissante de 50 sur les paires de ratio de classement, de calculer la corrélation de paires uptag et downtag rapport existant dans la fenêtre. Aussi calculer la moyenne des intensités minimale calculée à l'étape précédente.
   4. Faites glisser la fenêtre en 25 paires, et répétez l'étape précédente jusqu'à ce que toutes les paires ont été croisées.
   5. Parcelle l'intensité minimale moyenne contre la corrélation uptag-downtag pour toutes les fenêtres.
   6. Enfin, choisissez un seuil d'intensité, généralement, nous utilisons la valeur d'intensité où la corrélation atteint en premier 80% de son niveau maximum. Drapeau et retirer de l'analyse ultérieure des balises en dessous de ce seuil.
3. Correction de la saturation: Parce que chaque caractéristique sur la puce de codes à barres peuvent devenir saturés, le signal sur le tableau tag4 n'est pas linéairement liée à la concentration tag. Pour corriger cette saturation de suivre le protocole décrit dans la référence ^16.
4. La normalisation de tableau: Pour chaque tableau, et de normaliser la uptags downtags séparément. Pour quantile normaliser, de classer les valeurs obtenues à partir de chaque tableau pour uptags et downtags par ordre d'intensité croissante. Pour signifier à normaliser pour chaque ensemble de uptags et downtags, divisez par la moyenne. La normalisation signifie de tous les tableaux suivants est une seconde étape de transformer les données brutes pour la moyenne de chaque tableau.
5. Calcul des scores de sensibilité pour le contrôle de traitements des comparaisons: Pour utiliser ₂ log des ratios comme une métrique de sensibilité: Pour chaque souche, calculer log ₂ ((μ _{c-b g)} / (μ _{t-b g)),} où μ _c est la intensité moyenne pour les échantillons de contrôle, μ _t est l'intensité moyenne pour les échantillons de traitement, et b _g est l'intensité moyenne des sondes non affectés. Les souches avec un ratio positif log ₂ sont sensibles au traitement, et ceux qui sont résistants avoir des effets négatifs log ₂ ratios.

6. Évaluer l'aptitude des souches de levures code-barres par séquençage

1. Isoler l'ADN de la suppression des piscines comme décrit pour les microarrays.
2. Amplifier chaque code à barres 20-mer avec des amorces uptag composite constitué de séquences des amorces de codes à barres commun et les séquences nécessaires à l'hybridation de la cellule de débit Illumina (Voir Tableau des amorces d'Illumina et la figure 3 pour un diagramme de l'amplicon). Cesamorces peuvent être utilisées dessalée sans purification supplémentaire. PCR est réalisée dans 100 ul, en utilisant la PCR Supermix Invitrogen Platinum (Cat. n ° 11306-016) avec les conditions suivantes: 95 ° C / 3 min, 25 cycles de 94 ° C/30 sec, 55 ° C/30 sec, 68 ° C/30 sec, suivie par 68 ° C/10 min.
3. Purifier le produit de PCR (~ 130bp) avec kit Qiagen MinElute 96 UF PCR Purification (réf. 28051).
4. Après purification par PCR, de quantifier l'ADN avec le Invitrogen Quant-iT ADNdb BR Assay Kit (Cat n ​​° Q32853). Ne comptez pas sur 260/280 lectures!
5. Normaliser la concentration d'ADN à des volumes 10μg/ml et piscine égales d'ADN normalisée.
6. Séparer l'ADN en commun sur un gel de polyacrylamide TBE 12% pour les 3-4 heures selon la tension utilisée.
7. Tache des gels au bromure d'éthidium (SYBR Green devrait fonctionner aussi bien) pendant 30 minutes.
8. Repérez la bande d'intérêt sur ​​une visionneuse UV ondes longues (portant un masque de protection approprié), le découper et extraire l'ADN en utilisant la méthode de l'écrasement et tremper ¹⁷ suivie par précipitation à l'éthanol.
9. Confirmez que l'ADN de taille appropriée (130bp) a été isolé et que les amorces ont été enlevés à l'aide de la haute sensibilité Agilent Bioanalyzer l'ADN kit (Cat n ​​° 5067-4626).
10. Séquençage de l'échantillon:
    1. Illumina GAIIx plateforme:
       1. Générer des clusters sur une cuve à circulation unique Lire utilisant le kit de grappe CBOT et unique Lire Generation (Cat n ​​° GD-300-1001). Pour lire une, HAUT et BAS-tag modifiés amorces de séquençage sont regroupés à une concentration des stocks 100uM et ajouté à un strip-tube (0.6μL de chaque amorce de séquençage 100uM dans 120 ul HT1). SR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0 recette est utilisée pour générer des clusters R1.
       2. Séquençage du génome IIx Analyzer. Après 18 cycles de séquençage, le module de paires de gamme est utilisé pour dépouiller le brin synthétisé première et de la cellule de débit rehybridize, en utilisant la R1 Illumina (ci-dessous). Les clusters sont régénérées et séquencé pour 5 cycles pour capturer la balise d'index.
11. La séquence tag indice est utilisé pour des séquences dans des bacs expérimentaux bin.
12. Dans chaque bac expérimental, les séquences de codes à barres de la levure sont comptés pour donner un nombre total de coups pour chaque code-barres.
13. Comtes sont normalisées de sorte que chaque quantile expérience a la distribution même chef d'accusation. Par analogie avec les expériences de biopuces code à barres de fitness, les ratios d'adéquation à défaut de chaque souche sont calculées et exprimées comme le rapport de log ₂ (contrôle / traitement). Positif scores défaut de remise en forme signifier une diminution de l'abondance de contrainte pendant le traitement et suggèrent que la version de type sauvage du gène supprimé dans cette souche est nécessaire pour la résistance à ce médicament ou d'un inhibiteur.

Remarque: Compte tenu de Bar-seq comme alternative à l'hybridation de tableau. Avec les coûts de séquençage à haut débit diminue, en utilisant séquençage à haut débit comme une lecture de l'abondance tag devient possible et dans de nombreux cas, est plus rentable ^18. De cette façon, amplifié produit PCR est mesurée directement en tant que "compte", plutôt que comme l'intensité du signal que hybridé à un tableau. Ceci élimine les faux négatifs et positifs qui découlent de tag contamination croisée, la saturation, ou des problèmes découlant de l'intensité du signal très élevée ou très basse. Par ailleurs, des expériences multiples peuvent être combinés avant le séquençage par l'ajout d'un indice de base d'ADN 4-8 ^19. Parce que les codes-barres de la levure sont 20 pb, un seul, 2-étape de lecture de 26-28 bases capte l'indice de multiplex à la fois et de code à barres unique, permettant à 100 Extreme + multiplexage. Au moment d'écrire ces lignes, Bar-seq offre un avantage de coût sur ​​la barre-code biopuces, et en outre, de Bar-seq est intrinsèquement flexibles telles que l'augmentation du nombre de lit / run, le niveau de multiplexage peut augmenter à diminuer les coûts supplémentaires . Plusieurs «à mi-capacité" séquenceurs de tous les fabricants de plate-forme importante sera de démocratiser davantage Bar-seq, avec le séquençage susceptibles de devenir la lecture de son choix.

Ce protocole a également été validé sur le HiSeq2000 Illumina.

Une excellente démonstration de l'utilisation de Bar-seq pour répondre à une question biologique fondamentale dans le contrôle de Saccharomyces cerevisiae de croissance est présenté dans une étude récente de Gresham et al. ^{20 ans} qui aperçu important de la conception de plusieurs expérimentales et les lignes directrices d'interprétation.

7. Validation des données de dépistage mis en commun

Les résultats de n'importe quel écran de génomique fonctionnelle devrait être vérifiée en utilisant les souches individuelles de culture isolée. Parce que chaque expérience sera différente en termes de nombre de souches sensibles, en sélectionnant le nombre de souches candidat pour confirmer est quelque peu arbitraire. A titre indicatif, le classement des souches les plus sensibles par le journal _deux ratios ou Z-score et le test du haut de 25-50% des candidats (qui se traduit généralement à 2-3 norme desabilité sans accord écrit de la moyenne de toutes les souches dans la piscine) est un bon équilibre entre coûts et bénéfices. Confirmations individuelles peuvent être effectués dans n'importe quel flacon, mais nous effectuons ces tests depuis 5 générations de la croissance dans des plaques de 96 puits en utilisant un inoculum de départ de 0,06 OD ₆₀₀ dans 100 ul de médias dans un spectrophotomètre secouant, en prenant des mesures toutes les 15 minutes (voir figure 4) .

8. Les résultats représentatifs

Une fois un écran l'échelle du génome est terminé, et les tableaux ont été normalisées et le comportement de chaque souche par rapport à un traitement de contrôle (par exemple en comparant les intensités microarray ou séquençage compte / souche), les données sont plus facilement manipulables dans un fichier Excel avec des gènes Classé par le log2 des ratios de contrôle / expérience. De cette manière, plus le ratio de log2 négatif, le plus sensible que la souche particulière est de la condition de test. Ces fichiers Excel peuvent être tracées dans une variété de logiciels graphiques. Nous le plus simple à trouver pour tracer les ratios log2 sur l'axe Y et le gène ou les noms de l'ORF sur l'axe X. Dans l'exemple montré dans la figure 2a, un tel complot d'un traitement de clotrimazole (un agent antifongique connu) est montré. Toutes les souches qui sont significativement sensibles au traitement avec un ratio de 2 log2 sont surlignées en rouge, et nous aurions normalement de vérifier plusieurs de ces souches dans des dosages de croissance individuelle de chaque mutant en présence de la même concentration de la drogue. Dans cet exemple, 4 souches sont mises en évidence, NCP1, ERG2 et 2 allèles indépendants de ERG11, la protéine cible connue de clotrimazole. Chacun de ces quatre gènes est directement impliqué dans la biosynthèse de l'ergostérol, la levure équivalent de cholestérol. Par exemple, NCP1 code une réductase NADP-cytochrome P450 qui est impliqué dans la biosynthèse de l'ergostérol et qui est associée et coordonnée réglementé avec Erg11. Cet exemple souligne le fait que la cible de médicaments connus (Erg11) est identifié dans cet écran sans parti pris, ainsi que plusieurs autres éléments clés de la voie de cible. Enfin, plusieurs des gènes mis en évidence en rouge représentent les gènes qui peuvent être impliqués dans la biosynthèse de l'ergostérol ou dans différents processus biologiques. Comme mentionné ci-dessus, chaque souche détectée comme sensibles dans un écran de mise en commun doivent être vérifiés quant à sa sensibilité au dosage de la croissance individuelle. Dans l'exemple illustré à la Figure 2b, quatre souches sont confirmés à être sensibles à clotrimazole en fonction de leur croissance a baissé par rapport à la souche parentale de type sauvage, BWP17. Ces courbes de croissance individuelles en évidence une caractéristique importante de ces mises en commun gène-médicament écrans, c'est le rang absolu d'une souche particulière ne reflète pas nécessairement son niveau exact de la sensibilité. Par ailleurs, la figure 2b montre aussi l'importance d'avoir des allèles multiples pour chaque gène, dans ce cas, les deux mutants erg11 perturbations ont légèrement différentes sensibilités. La corrélation de la nature de ces perturbations avec le degré de sensibilité peut fournir des informations supplémentaires sur le mécanisme d'action des médicaments.

Figure 1. Workflow pour le dosage de la croissance mises en commun et de détection de codes-barres. Les cultures sont inoculées avec des aliquotes dégelées de cellules regroupées (étape 1), puis cultivées pour le nombre désiré de générations (étape 2) soit robotically (option A) ou manuellement (option B). Les cellules sont récoltées par centrifugation (étape 3) et l'ADN génomique est ensuite isolé des cellules récoltées (étape 4), et uptags downtags sont indépendamment amplifié (étape 5), et hybridé à un tableau (étape 6a ou séquencé directement l'étape 6b).

Figure 2. Exemple de données recueillies à certains points du protocole. (A) Exemple de données à partir des résultats de dépistage (adapté de ^13). Le bassin de mutants étiquetés a été cultivé pendant 20 générations, en présence de clotrimazole et le DMSO (témoin). Connexion ₂ rapport (contrôle de l'intensité / traitement d'intensité) a été calculée et tracée en fonction des gènes. Souches hautement sensibles (rouge) inclus la cible connue de clotrimazole, ERG11p. Notez que ce test révèle souvent d'autres mutants sensibles, en plus de cibles réelles du composé. Généralement, ces mutants sont ceux qui agissent de façon synthétique avec la cible, ceux qui font partie d'un général de stress / la réponse au traitement, ou sont des faux positifs que ne confirment pas. (B) Exemple de données de confirmation (adapté de ^13). Résultats des dosages de croissance mis en commun peuvent être validés par la croissance de la souche en culture individuelle et comparé à une croissance de type sauvage (noir).

Figure 3. Structure de l'amplicon produit à partir de tests de codes à barres regroupées pour l'hybridation microarray ou séquençage Barcode. L'amplicon produite pour chaque mutant in la collection contient une homologie avec le génome de l'intégration (régions bleu marqué ATG et TAA), code-barres unique (étiqueté AG et indiqué par un trait noir). Pour l'hybridation biopuces, les amorces bleue communs sont utilisés pour amplifier une sonde d'hybridation 60bp biopuces. Pour le séquençage de codes à barres, les amorces étendues sont utilisées dans la réaction PCR, composé de séquences codant pour l'adaptateur Illumina (barre rouge), et l'indice de 6bases cross-trappes) et l'amorce bleue commune pour l'amorce en amont, et la même amorce composite (moins l'indice de base 6) pour la seconde amorce.

Figure 4. Croissance des dosages individuels pour 1) Prescreening composés contre la levure de type sauvage afin de déterminer une dose appropriée pour l'ensemble du génome de dépistage et 2) Confirmant les résultats de criblage du génome entier. (A) Une plaque de 96 puits à fond plat est rempli avec 100 pl de suspension cellulaire à une DO de 0,062. Chaque puits peut contenir la même souche (pour la dose de détermination) ou différentes combinaisons de souche et de médicaments (pour les dosages de confirmation). 2 pi de composé (généralement dissous dans du DMSO) est ajouté et les cellules sont cultivées avec agitation constante pour 16-20 h à 30 ° C. La concentration finale de DMSO ne devrait pas dépasser 2%. Dans cet exemple, dans chaque puits de la plaque de la courbe de croissance est tracée en noir sur un tracé de la courbe de croissance de contrôle dans le rouge. (B) l'image plus haute résolution de plusieurs prescreens obtenus avec un médicament par exemple superposées les unes sur les autres. Dans cette série de titrage, un IC _10-15 est obtenu avec la dose pourpre et serait approprié pour le profilage de la suppression (HIP HOP et). En raison de la non-linéarité des densités plus élevées optique, Tecan (ou tout autre lecteur de plaque similaire) ODS doivent être étalonnés à l'aide à ceux obtenus avec un «traditionnels» 1mm chemin de longueur cuvette.

Discussion

Ici, nous avons présenté un protocole qui, avec une modification modeste, peut facilement être adapté à un large éventail de collections existantes des codes-barres collections de mutants de microorganismes différents pour créer des collections de mutants étiquetés. Nous soulignons que, bien que nous avons rapporté un protocole sur la mutagenèse transposon marqués pour la levure pathogène C. albicans, un protocole très similaire pourrait être adapté à une grande variété de champignons unicellulaires. Mise à jour, ce protocole fonctionne bien chez les bactéries ^13, et actuellement les collections d'un certain nombre d'autres génomes fongiques et bactériennes sont en construction. A l'heure actuelle, ce test fournit la seule complète, l'ensemble du génome d'écran impartiale pour les interactions gène-petite molécule. Une caractéristique particulièrement convaincante de l'essai est qu'aucune connaissance préalable du gène ou de petites molécules est nécessaire. En dépit de la portée et la puissance de ces tests, leur transférabilité à d'autres laboratoires a été entravée par le peu d'investissement initial et outils informatiques pour l'analyse des résultats. Avec l'adoption d'une lecture séquence prochaine génération combinée avec des outils robustes pour l'analyse, nous nous attendons à leur adoption à augmenter.