Summary
腔内大脑中动脉闭塞（MCAO）模型是最常见的缺血性中风的实验模型中使用的模型。在这里，我们将展示在整个模型用激光多普勒血流计指南的细节，其代表性的成果。
Abstract
中风是第三大死因，在世界上的残疾的首要原因，美国在2009 年 1,2的近70亿美元，估计所需费用。腔内大脑中动脉闭塞（MCAO）模型，于1986年，以模拟在大鼠有影响力的人类病理学由小泉纯一郎 4 。缺血法的修改后由龙格 3 。这两种技术已被广泛用来识别脑损伤的分子机制，导致缺血性中风和潜在的治疗方式5。一直延续这相对无创的方法，在大鼠，小鼠的使用，利用转基因和基因敲除株6,7优势。局灶性脑缺血模型，线栓是先进的经颈内动脉闭塞MCA的基地。回缩后，在指定的时间内缝合模仿自发再灌注损伤，但缝合，也可永久保留。该视频将展示在小鼠进行腔内缺血过程在逐步时尚的两个主要方法，以及为潜在的弊端和缺陷的见解。缺血性脑组织也将随之由2,3,5 -三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，评估脑梗塞 8的程度。
Protocol
该协议被批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在佛罗里达大学，并遵守的“实验动物保健的原则”（美国国立卫生研究院出版号86-23，1985年修订）。
1。材料
- 动物：雄性C57BL / 6小鼠（哈伦实验室，印第安纳波利斯，在美国）在手术时重达20-26克。
- 麻醉：
- 麻醉机：VetEquip吸入麻醉系统（VetEquip公司，Pleasanton的，CA，美国）。
- 吸入麻醉药异氟醚（百特制药，迪尔菲尔德，IL）。
- 手术工具：SuperCut虹膜剪刀，直（世界精密仪器公司，美国，佛罗里达州，萨拉索塔）; Vannas微型剪刀，直（世界精密仪器公司，美国，佛罗里达州，萨拉索塔）;杜蒙钳（精尖， 45 °弯曲的技巧，世界精密仪器公司，美国，佛罗里达州，萨拉索塔），双极电凝单元（高频干燥器900，世界精密仪器公司，萨拉索塔，佛罗里达州，美国）;微型血管夹（世界精密仪器，公司，美国，佛罗里达州，萨拉索塔）
- 手术用品：无菌棉提示;湿巾，纱布海绵，缝合（7-0丝线缝合，爱惜康公司，萨默维尔，新泽西州，美国）;组织粘合剂（Vetbond，3M公司，圣保罗，明尼苏达，美国）;手术擦洗Bethadine，70％的乙醇和无菌0.9％生理盐水;眼膏（Puralube兽医软膏，Pharmaderm，梅尔维尔，纽约，美国）。
- 闭塞缝合准备缺血：
- MCA闭塞长丝：7-0手术尼龙单丝缝合（爱惜康公司，萨默维尔，新泽西州，美国）。
- 钝化缝合头（热烧灼单位，世界精密仪器公司，萨拉索塔，佛罗里达州）的热源。
- 液体硅橡胶（美国佛罗里达州萨拉索塔，有机硅室温胶，世界精密仪器公司，）。
- 外科/解剖显微镜（徕卡立体显微镜MZ6）。
- 光纤照明（光纤照明FO1 - 150，TechniQuip公司，利弗莫尔，CA，美国）。
- 激光多普勒血流计（5000，斯德哥尔摩，瑞典，Perimed PeriFlux系统）。
- 灵活的微尖（MT B500 - 0直微尖，Perimed，斯德哥尔摩，瑞典）
- 温度参数：
- 直肠温度监测（BAT - 12，世界精密仪器公司，萨拉索塔，佛罗里达州）。
- 隔热毯（T /泵，TP600，Gaymar，纽约，美国）。
- 染色和定量测量体积梗死：
- 2％的溶液2,3,5 - 三苯基氯化（2％TTC，Sigma - Aldrich公司有限公司，圣路易斯，密苏里州，美国）。
- 小鼠脑矩阵切片（Zivic米勒实验室，公司艾里逊公园，PA，美国）。
- 数码相机（V1253，柯达公司，罗彻斯特，纽约州，美国）。
- Image J软件（ImageJ 1.42q软件，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，MA，USA）。
2。手术前的步骤
- 手术前，小鼠被安置在一个12:12的光/暗周期免费获得水和灭鼠议员。
- 缺血缝线钝化为1 - 2mm的热和其与液态硅橡胶的尖端3 - 4mm的缝合轴涂层缝合提示准备，允许它干（7-0;尖端直径0.20 -0.25毫米;涂层长3 - 4mm的缝合长度为11 - 13MM）。不孕症应予以保留，在上述所有步骤。
- 称重鼠标后，麻醉诱导用4％的异氟醚在感应室内保持在1.5-2％，30％O 2和70％N 2 O的混合气体通过口罩异氟醚的程序。
- 鼠标被放置在俯卧姿势趴在一个温度控制的作业面（隔热毯）上的纱布垫;剃光头皮毛。
- 应用润滑剂眼药膏双眼，眼睑闭合，以防止在手术过程中的眼干燥。
- 一个正中切口（1厘米）的皮肤上覆的颅骨上项线到鼻根皮肤拉横向贴上一个灵活的微尖（MT B500 - 0直微尖，直径0.5mm）。微尖是垂直放置右顶叶头骨表面（后1毫米和5毫米，前囟门外侧），监测激光多普勒血流计血流在MCA领土。
- 确保灵活的微尖是颅骨，坚定地前动物转向仰卧位。动物的脖子上放置一个软垫，它的鼻子是在鼻锥麻醉设备举行。这将导致有足够的空间，灵活的微尖。
- 直肠温度探头插入，以保持恒定的动物核心温度为37 ± 0.5 ° C。
- 这两个前爪和hindpaws录音操作平台表面，和尾巴是贴在直肠管。 </ OL>
- 中线颈部切口手术显微镜下，用剪刀柄和下颚之间，轻轻提起皮肤松弛。
- 配对的基础颌下腺直言不讳地划分，留在原地左腺。右颌下腺缩回颅，沿胸锁乳突肌和担保。
- 肩胛舌骨肌覆盖颈动脉鞘暴露分工仔细划分与皮卡。
- 仔细分离右侧颈总动脉（CCA），并从中分离出的迷走神经和鞘（位于外侧共同国家评估）。
- 此后，2，经常被用来执行MCA闭塞的手术方法不同 ：
- 右CCA是围绕着三个宽松的领口缝合（7-0丝绸）。
- 颈外动脉（ECA）是确定的，孤立的，和烧灼（2 - 3mm的远端分叉）。随后，它可以分为微型剪刀。为了避免不慎周边损害烧灼网站，电源应设置在1使用电源旋钮。这是所有cauterizations一致。
- 足够的张力是适用于对CCA最领缝合近端闭塞的血流量（永久性结扎）。流闭塞验证了〜基线皮质灌注值下降50％。
- 然后一个血管夹是放在前文建会分岔动脉切开术的时间，以避免在逆行流。
- 动脉切开术之间的近端结扎缝合，并用微型剪刀（靠近结扎）的船只上的CCA剪辑。
- 热迟钝硅涂层7-0尼龙缝线是通过动脉切开术和引入先进的，直到它到达血管夹。 2其余宽松的领口缝合轻轻收紧各地的CCA之间通过共同国家评估，以避免流漏，谨慎，不创伤动脉壁的动脉切开术和血管夹，然后血管夹被撤回。
- 非洲经济委员会鉴定，解剖尽可能（近到语言和上颌动脉的分叉处），烧灼（设置为1的电源），分为微型剪刀。
- 是围绕着以上的文建会分叉近端ICA的两个宽松的领口缝合（7-0丝绸）。
- 文建会暂时封闭，用血管夹。流闭塞验证了〜基线皮质灌注值下降50％。
- ICA是暂时关闭与上述两个宽松的领口缝合血管夹，动脉切开术的时间，以避免在逆行流。
- 动脉切开术是使用微型剪刀，在反映非洲经委会密切残端。
- 热迟钝硅涂层7-0尼龙缝线是通过动脉切开术在非洲经委会和引入先进的，直到它到达应用血管夹在ICA。近端ICA的2宽松的领口缝合近端ICA周围轻轻地拧紧，以避免通过ICA回流血流足够的重视，没有创伤的动脉壁，血管夹，然后被撤回。
- 正在慢慢走向颅底颈内动脉（ICA）的通过先进的咬合缝合，直到感到一种轻微的抵抗。一个并发下降一个百分点（= 80％），相对于基线脑血流量值是用激光多普勒血流仪证实。 2领口缝合收紧周围插入长丝。
- 短暂性脑缺血的实验，45分钟后，轻轻咬合缝合撤回。这个时间点，可以改变各种实验的目的。
- 撤回缝合长丝后，动脉切开术的网站被关闭，以避免手术后出血。在小泉的方法，这涉及到各地的CCA安全收紧的领口缝合。龙格的技术，在非洲经委会的基础动脉切开术网站是烧灼，然后松开领口缝合近端ICA和删除，以恢复颈动脉流。
- 要关闭切口，下颌下腺和SCM奠定了手术领域。伤口边缘，然后在宫颈癌组织粘合剂和头皮地区近似。另外，可吸收缝合线或金属主食可以用来关闭，特别是当动物的长期生存的目的是伤口。
- 关闭切口后，动物收到温生理盐水1毫升皮下注射量补货。应使用一个适当的止痛药的剂量（即丁丙诺啡在0.05-0.1毫克/公斤），以尽量减少在恢复期动物的疼痛和不适。阴性特质L是从手术套房，并放置在一个温暖的恢复面积/笼，以防止低温，自由，方便地访问柔软的食物和水。
- 没有观察到的赤字
- 故障，延长对侧前爪（轻度局灶性神经功能缺损）
- 绕在一个方向对侧梗死（中度局灶性神经功能缺损）
- 在一个方向对侧坠落，以梗死（严重的局灶性神经赤字）
- 郁闷的意识水平，无自发运动
- 马华再灌注24小时后，幸存的小鼠称重，深为4％isoflorane麻醉，并根据批准的协议牺牲。
- 大脑是小心取出，放置在小鼠大脑矩阵切片，和整个大脑是在2毫米间隔冠状切片。
- 部分都沉浸在2％TTC磷酸缓冲液（PBS）在37 ° 20分钟。 TTC染色后，梗死面积是白色（未染色）组织相邻的红砖（可行）组织（图1）所示。
- 连续切片拍摄使用数码相机和梗死面积测量与图像J计划。
- 梗塞面积（白，不染），同侧半球面积（白色和红色的砖，染色），和对侧半球的面积（红砖，彩色），测量每个节。体积的计算方法是在所有路段的总结有代表性的地区和乘以层厚。水肿纠正后，梗死体积的计算方法如下9：
更正梗死体积（CIV），％= [对侧大脑半球额- （同侧半球体积-梗塞体积）] /对侧大脑半球体积× 100
3。 MCA闭塞手术：
小泉的4方法
龙格的方法3
该过程的其余部分主要是收敛：
4。术后神经功能评价
动物恢复后总的意识，神经功能缺损可以通过一个简单的规模（五点量表） 评估如下3：
5。染色及脑梗死体积的定量测量
6。代表性的成果
后，左文建会闭塞，并通过建立短暂性脑缺血再灌注MCA的，动物的牺牲和他们的大脑冠状切片，用TTC染色评价梗死体积（图1）。
图1。TTC染色串行冠状从小鼠的脑切片（2毫米）MCA闭塞。
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Discussion
MCAO模型是一个既定的模式，复制脑缺血小鼠物种。第一次使用这个模型是在大鼠和以后适应小鼠。避免去骨瓣，以消除对血脑屏障通透性和颅内压手术操作的影响，是该技术的优点。然而，许多变量，如应变相关的差异 10，大小缝合技巧 11，持续时间 6闭塞， 体温 12， 麻醉 13，以及其他因素，可能导致梗塞体积在这个模型不一致。
值得一提的有具体的技术细节：
- 涂层缝合年底将创建一个咬合马华穿孔的危险下降的顺利和管理的缝合。
- 娇柔的独立和安全的从相邻的血管迷走神经，所以它是不会在无意中限制在领口缝合。确保使用两个领缝线通过动脉切开术，以避免逆行出血升序咬合缝合的同时，轻轻地拧紧，以避免创伤动脉壁。
- 翼腭动脉分流从文建会分岔后的ICA。为了避免偏离到翼腭动脉，而不是在ICA升序缝合的尖端，成立了手术平台，以保持在一条直线的方向鼠标的头部和颈部。这种偏差是常见的小泉纯一郎和龙格的技术，所以必须在任一过程中采取护理。
- 激光多普勒血流计是一个在各个解剖区域的血流量的实时监测的方法，并应用在我们的实验来测量通过民政部提供的大脑区域的血液流动。它缝合定位精度显着提高，从而确保获得一致的结果。这是一个不太精确的测量长度要插入的缝合，这是易受干扰解剖变异技术，指出优势。
- 一个激光多普勒血流计的临时增加，同时通过CCA和ICA插入您的缝合，确保你是在朝着正确的方向，并关闭马华开口。
- 枕动脉，最经常出现在外侧方向从近端经委会（虽然有时从ICA）。应确定（在某些情况下结扎），以避免以后的混淆，而插入缝合。
- 为了减少梗死的变异，手术过程中保持鼠标体温稳定，避免手术后的低温。
- 使用TTC染色缺血手术后72小时内，适当地分析梗死体积。对于更长的生存时间点使用其他如甲酚紫染色染色方法，以确定梗死面积。
| 小泉的方法 | 龙格法 | |
| 网站缝合插入 | 同侧颈总动脉 | 同侧颈外动脉 |
| 常驻动脉牺牲 | 常见的颈动脉和颈外动脉 | 颈外动脉 |
| 致命的术中动脉破裂/出血的风险 | 减关注 | 更令人关注 |
| 到翼腭动脉缝合转移的可能性 | 是 | 是 |
| 程序的时间 | 通常较快 | 一般较长 |
| 激光多普勒血流计：从基线下降的百分比 | > = 80％ | > = 80％ |
| 激光多普勒血流计：闭塞/再灌注损伤的趋势 |
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腔内大脑中动脉闭塞（MCAO）两个方法在小鼠比较表1。
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Disclosures
作者宣布，他们已经没有利益冲突。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Animal | Harlan Laboratories | 20-26 grs | |
| Dissection microscope | Microscope | Leica Microsystems | 6.3:1 zoom | |
| Fiber optic illuminator | Illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–-150 | |
| Isoflurane | Anesthesia | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| SuperCut Iris scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14218 | |
| Vannas micro-scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Dumont fine tip forceps | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 503290 | |
| Vessel clip | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14120 | |
| High Frequency Desiccator 900 | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 500397 | |
| 7-0 surgical Nylon monofilament suture | Suture | Ethicon Inc. | 1647G | Suture for occlusion |
| 7-0 surgical Silk suture | Suture | Ethicon Inc. | 7733G | Suture for ligation |
| Silicone RTV adhesive | Silicone rubber | World Precision Instruments, Inc. | 1571 | |
| Vetbond | Tissue adhesive | 3M | 70200746587 | |
| Puralube Vet Ointment | Eye ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Buprenorphine hydrochlorode | Analgesics | Hospira Inc. | NDC 0409-2012-32 | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, Inc. | 501292 | ||
| PeriFlux System 5000 | TCD flowmetry | Perimed | ||
| BAT-12 | Rectal thermometer | World Precision Instruments, Inc. | BAT-12R | |
| T/PUMP, TP600 | Thermal blanket | Gaymar Industries | ||
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Mice brain matrix slicer | Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS001-1 |
References
- Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
- Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
- Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
- Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
- Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
