Intraluminale Occlusion Artère cérébrale moyenne (MCAO) Modèle pour l'AVC ischémique avec guidage laser Doppler chez la souris

Summary

Le intraluminale de l'artère cérébrale occlusion (MCAO) est le modèle le plus fréquemment utilisé chez les modèles expérimentaux ischémiques AVC. Ici, nous allons démontrer tout le modèle en détail avec le guide de Laser Doppler, et ses résultats représentatifs.

Abstract

L'AVC est la troisième cause de décès et la première cause de handicap dans le monde, avec un coût estimé à près de 70 milliards de dollars aux États-Unis en 2009 ^1,2. Le intraluminale de l'artère cérébrale occlusion (MCAO) modèle a été développé par Koizumi ⁴ en 1986 pour simuler cette percutante pathologie humaine chez le rat. Une modification de la méthode MCAO a ensuite été présenté par Longa ^3. Les deux techniques ont été largement utilisées pour identifier les mécanismes moléculaires de lésions cérébrales résultant d'un accident ischémique cérébral et modalités thérapeutiques potentielles ^5. Cette méthode relativement non invasive chez le rat a été étendu pour utiliser la souris pour tirer parti des souches transgéniques et knock-out ^6,7. Pour modéliser une ischémie cérébrale focale, une suture intraluminale est avancé par l'artère carotide interne pour occlure la base de la MCA. Retrait de la suture après une période de temps spécifiée imite reperfusion spontanée, mais la suture peutégalement être maintenue en permanence. Cette vidéo sera de démontrer les deux grandes approches pour effectuer la procédure intraluminale MCAO chez la souris de façon progressive, ainsi que de fournir un aperçu des inconvénients potentiels et les pièges. Le tissu cérébral ischémique seront ensuite colorées par le chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (CTT) pour évaluer l'étendue de l'infarctus cérébral ^8.

Protocol

Ce protocole a été approuvé par le soin des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation (IACUC) à l'Université de Floride et est en conformité avec le «principe de protection des animaux de laboratoire" (NIH publication n ° 86-23, révisée en 1985).

1. Matériels

1. Animaux: Homme souris C57BL / 6 (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA) pesant 20-26 grammes au moment de la chirurgie.
2. Anesthésie:
   1. Appareil d'anesthésie: l'anesthésie par inhalation système VetEquip (VetEquip Inc, Pleasanton, CA, USA).
   2. Anesthésique par inhalation: L'isoflurane (Baxter Pharmacie, Deerfield, IL).
3. Outils chirurgicaux: SuperCut Ciseaux Iris, droites (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis); Vannas micro-ciseaux, droites (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis); Dumont forceps (pointe fine, 45 ° pointes coudées, World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis) et unité de coagulation bipolaire (Salutgh Fréquence Dessiccateur 900, World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, USA), clip navire micro (World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, Etats-Unis)
4. Fournitures chirurgicales: Conseils de coton stériles; lingettes, éponges de gaze; Suture (7-0 suture de soie, Ethicon, Inc, Somerville, NJ, USA); adhésif tissulaire (Vetbond, 3M Company, St Paul, MN, USA); lavage chirurgical des mains : solution saline Bethadine, éthanol à 70%, et de 0,9% stérile; Pommade ophtalmique (Pommade Vétérinaire Puralube, Pharmaderm, Melville, NY, USA).
5. Occlusion de suture préparation pour MCAO:
   1. Filament pour le MCA occlusion: 7-0 suture chirurgicale monofilament en nylon (Ethicon, Inc, Somerville, NJ, USA).
   2. Source de chaleur pour émousser la pointe de suture (Unité cautérisation thermique, World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride).
   3. Caoutchouc de silicone liquide (RTV Silicone adhésif, World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride, USA).
6. Surgical / dissection microscope (Microscope stéréo Leica MZ6).
   1. Fibre optiqueéclairage (éclairage fibre optique FO1-150, Techniquip Corp, Livermore, CA, USA).
7. Laser Doppler (PeriFlux System 5000, Perimed, Stockholm, Suède).
   1. Flexible micropointe (MT B500-0 Microtip droite, Perimed, Stockholm, Suède)
8. Paramètres de température:
   1. Rectale moniteur températures (BAT-12, World Precision Instruments, Inc, Sarasota, Floride).
   2. Couverture thermique (T / PUMP, TP600, Gaymar, NY, USA).
9. La coloration et la mesure quantitative de l'infarctus du volume:
   1. Solution à 2% de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (2% TTC, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).
   2. Souris cerveau matrice trancheuse (Zivic-Miller Lab., Inc, Allison Park, Pennsylvanie, Etats-Unis).
   3. Appareil photo numérique (V1253, Kodak Co., Rochester, NY, USA).
   4. Image J logiciels (ImageJ 1.42q logiciel, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA).

2. Pré-chirurgicaux étapes

1. Avant la chirurgie, les souris sont logés sous un 12:12 lumière / obscurité cycle avec libre accès à l'eau et rongeur.
2. Sutures pour MCAO sont préparés par émousser 1-2mm de la pointe de fil de suture avec de la chaleur et le revêtement 3-4mm de suture à partir de son arbre de pointe de caoutchouc de silicone liquide, ce qui lui permet de sécher (7-0; diamètre de pointe, 0.20-0.25 mm; revêtement longueur, 3-4mm, longueur de suture 11-13mm). Stérilité doit être conservé dans toutes les étapes mentionnées ci-dessus.
3. Après avoir pesé la souris, l'anesthésie est induite avec 4% d'isoflurane dans une chambre d'admission et maintenue pendant la procédure avec l'isoflurane 1,5-2% à 30% d'O ₂ et 70% de N ₂ O mélange de gaz par l'intermédiaire d'un masque facial.
4. La souris est placée dans une position couchée sur un tampon de gaze placé sur une surface de fonctionnement à température contrôlée (couverture thermique); la fourrure tête est rasée.
5. Pommade ophtalmique lubrifiant est appliqué sur les deux yeux et les paupières sont fermées pour empêcher le dessèchement des yeux lors de la surprocessus gique.
6. Une incision médiane (1 cm) est faite sur la peau qui recouvre la calotte crânienne de la ligne nucale supérieure à la nasion et la peau est tirée latéralement d'apposer une microsonde flexible (MT B500-0 Microtip droite; 0,5 mm de diamètre). La micropointe est placé perpendiculairement à la surface du crâne pariétal droit (1 mm et 5 mm postérieure latérale au bregma) pour contrôler le débit sanguin dans le territoire MCA par vélocimétrie laser.
7. Assurez-vous que la micro-pointe flexible est attaché au crâne bien avant que l'animal est tourné vers une position couchée. Cou de l'animal est placé sur un tampon doux et son nez est maintenu en cône du nez de l'appareil d'anesthésie. Cela se traduira par avoir assez d'espace pour la micropointe flexible.
8. Une sonde de température rectale est insérée pour maintenir une température constante pour animaux noyau de 37 ± 0,5 ° C.
9. Les deux pattes de devant et pattes postérieures sont collées à la surface plate-forme d'exploitation, et la queue est collé sur le tube rectal.
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3. MCA occlusion chirurgie:

1. Sous le microscope opératoire, une incision médiane du cou est faite avec des ciseaux entre le manubrium et la mâchoire en soulevant délicatement la peau lâche.
2. Les paires de glandes sous-maxillaires sous-jacents sont carrément divisée, avec la glande gauche laissés sur place. La glande sous-maxillaire droite est rétracté crânienne et sécurisé avec le muscle sterno.
3. La division exposé du muscle omo-hyoïdien recouvrant la gaine carotidienne est soigneusement divisée avec des micros.
4. L'artère carotide commune droite (CCA) est soigneusement séparée et isolée du nerf vague et de sa gaine (situé latérale CCA).
5. Ci-après, les 2 méthodes chirurgicales qui ont été fréquemment utilisés pour effectuer l'occlusion MCA divergent:

Koizumi ⁴ Méthode

1. Trois sutures lâches col de soie (7-0) sont préparés autour du droit du CCA.
2. Une tension suffisante est appliquée à la suture col le plus proximal sur la DPA à occlure le débit sanguin (ligature permanente). L'occlusion flux est vérifiée par une baisse de ~ 50% des valeurs de base perfusion corticale.
3. Puis un clip récipient est placé juste avant la bifurcation CCA afin d'éviter un flux rétrograde au moment de l'artériotomie.
4. Une artériotomie est effectuée entre la ligature et suture proximale de la pince sur le récipient avec des micro-CCA ciseaux (plus proche de ligation).
5. La chaleur émoussée revêtu de silicone 7-0 suture nylon est introduite par l'artériotomie et avancé jusqu'à ce qu'il atteigne le clip pour vaisseau. Les 2 autres sont lâches sutures col gentment serrée autour de la CCA entre la artériotomie et le clip navire pour éviter le retour de débit de fuite à travers la CCA, avec prudence pour ne pas traumatiser la paroi artérielle, puis le clip navire est retirée.

Longa ³ Méthode

1. Le CEA est identifié, disséqué autant que possible (près de sa bifurcation dans les artères linguale et maxillaire), cautérisée (avec alimentation mis à 1), et divisé par des micro-ciseaux.
2. Deux sutures lâches col de soie (7-0) sont préparés dans le proximale ICA juste au-dessus de la bifurcation du CCA.
3. Le CCA est temporairement fermé avec un clip navire. L'occlusion flux est vérifiée par une baisse de ~ 50% des valeurs de base perfusion corticale.
4. Puis l'ICA est temporairement fermée avec un clip récipient au-dessus des deux sutures lâches collier pour éviter un écoulement rétrograde au moment de l'artériotomie.
5. Une artériotomie est réalisée à l'aide de micro-ciseaux dans le proche CEA reflète à la souche.
<li> La chaleur émoussée revêtu de silicone 7-0 suture nylon est introduite par l'artériotomie dans CEA et avancé jusqu'à ce qu'il atteigne le clip pour vaisseau appliqué à l'ICA. Les 2 sutures lâches col proximale de l'ICA sont légèrement resserré autour de la partie proximale ICA pour éviter l'écoulement du sang reflux par l'ICA, avec une attention pour ne pas traumatiser la paroi artérielle, puis le clip navire est retirée.

Le reste de la procédure est largement convergentes:

1. Le fil de suture est en train d'occlusion avancé à travers l'artère carotide interne (ACI) en direction de la base du crâne jusqu'à ce qu'une légère résistance se fait sentir. Une baisse concomitante de la valeur du débit sanguin cérébral en pourcentage (= 80%) par rapport à la valeur initiale est confirmée par laser Doppler. Les 2 points de suture cols sont serrés autour du filament inséré.
2. Pour transitoires expériences ischémie cérébrale, la suture occlusive est retirée doucement au bout de 45 minutes. Ce point peut être modifié de temps pour divers objectifs expérimentaux.
3. After retirer le filament de suture, le site artériotomie est fermé pour éviter une hémorragie post-opératoire. Dans la méthode de M. Koizumi, il s'agit de serrer fermement les sutures collier autour du CCA. En technique Longa, le site artériotomie à la base du CEA est cautérisé, puis les fils de suture à la collerette proximale ICA sont desserrées et retirées à rétablir le flux carotidien.
4. Pour fermer l'incision, la glande sous-maxillaire et SMC sont posés sur le champ opératoire. Les bords de la plaie sont ensuite estimés avec de la colle tissulaire dans les zones cervicales et le cuir chevelu. Alternativement, un fil résorbable ou une agrafe métallique peut être utilisé pour fermer la plaie surtout quand survie à long terme de l'animal est destiné.
5. Après la fermeture de l'incision, l'animal reçoit 1 ml de solution saline chaude voie sous-cutanée à la reconstitution du volume. Une dose d'analgésiques appropriés (c.-à buprénorphine à 0,05-0,1 mg / kg) doit être utilisé pour réduire la douleur et l'inconfort des animaux au cours de la période de récupération. L'animal est retiré de la salle d'opération et placé dans une zone de récupération à chaud / cage pour éviter l'hypothermie, avec libre accès facile et à l'alimentation en eau douce et.

4. Post-Op évaluation neurologique

Après que l'animal ne reprenne conscience totale, les déficits neurologiques peut être évaluée par une échelle simple (échelle de cinq points) comme suit ^3:

0. pas de déficits observables
1. non-renouvellement de patte controlatérale (léger déficit neurologique focal)
2. évoluent dans une direction controlatéral à un infarctus (déficit neurologique focal modéré)
3. tomber dans une direction controlatéral à un infarctus sévère (déficit neurologique focal)
4. diminution du niveau de conscience sans mouvement spontané

5. La coloration et la mesure quantitative du volume de l'infarctus cérébral

1. Après 24 heures de reperfusion MCA, la souris survivant est pesé, profondément anesthésiés avec isoflorane 4%,et sacrifié selon le protocole approuvé.
2. Le cerveau est soigneusement enlevé et placé dans un cerveau de souris matrice trancheuse, et le cerveau tout entier est sectionnée au niveau coronaire intervalles de 2 mm.
3. Les sections sont immergés dans 2% TTC en tampon phosphate salin (PBS) à 37 ° C pendant 20 minutes. Après coloration TTC, infracted zone est indiquée par un blanc (non coloré) les tissus adjacents à la brique rouge (viable) du tissu (figure 1).
4. Des coupes sériées sont photographiés avec un appareil photo numérique et la zone de l'infarctus est mesurée à l'aide du programme J image.
5. La zone de l'infarctus (blanc, sans tache), la zone de l'hémisphère ipsilatéral (blanc et rouge brique, taché), et la zone de l'hémisphère controlatéral (rouge brique, teinté) sont mesurées pour chaque section. Le volume est calculé en faisant la somme des zones représentatives de toutes les sections et en multipliant par l'épaisseur de coupe. Après correction pour l'œdème, le volume de l'infarctus est calculé comme suit ^9:
   Corrigezed infarctus du volume (CIV),% = [volume hémisphère contralatéral - (volume hémisphère ipsilatéral - volume de l'infarctus)] volume hémisphère / controlatéral x 100

6. Les résultats représentatifs

Après l'occlusion et la reperfusion du MCA via gauche CCA pour établir ischémie cérébrale transitoire, les animaux sont sacrifiés et leur cerveau en coupe coronale sont colorées avec TTC pour évaluer le volume de l'infarctus (figure 1).


Figure 1. TTC teinté sériées coronales du cerveau (2 mm) de souris soumises à une occlusion MCA.

Discussion

Le modèle MCAO est un modèle établi qui reproduit l'ischémie cérébrale chez les espèces murines. Ce modèle a été utilisé pour la première chez les rats et par la suite adaptée à la souris. Éviter craniectomie pour éliminer l'influence de la manipulation chirurgicale sur la perméabilité barrière hémato-encéphalique et la pression intracrânienne est un avantage de cette technique. Cependant, de nombreuses variables, comme la souche des différences liées à la taille ^10, la suture pointe ^11, la durée de l'occlusion ^{6, 12} de la température corporelle, l'anesthésie ^13, et d'autres facteurs peuvent conduire à des incohérences dans les volumes d'infarctus dans ce modèle.
Il existe des détails techniques qui méritent mention:

1. Le revêtement de la fin de suture va créer une suture lisse et facile à gérer pour l'occlusion de la MCA avec risque de perforation diminué.
2. Délicatement distinct et sûr du nerf vague dans les artères adjacentes, de sorte qu'il n'est pas par inadvertance restreint dans un fil de suture col. Assurez-vous d'utiliser deux collaires sutures pour éviter une hémorragie rétrograde à travers l'artériotomie pendant la remontée de la suture occlusive et serrez doucement pour éviter de traumatiser la paroi artérielle.
3. L'artère ptérygo s'écarte de la CIA après la DPA bifurcation. Pour éviter de s'écarter de la pointe de suture ascendante dans l'artère ptérygo-lieu de la CIA, mis en place la plate-forme chirurgicale de garder la tête et le cou de la souris dans une direction rectiligne. Cet écart est commun aux deux Koizumi et technique Longa, donc le soin doit être pris dans les deux procédures.
4. Laser Doppler est une méthode de surveillance en temps réel du flux sanguin dans les différentes régions anatomiques, et est appliquée dans notre expérience pour mesurer le débit sanguin dans la zone du cerveau alimenté par MCA. Il augmente considérablement la précision du positionnement de suture, et assure ainsi obtenir des résultats cohérents. Il s'agit d'un avantage indiqué sur des techniques moins précises de mesure de la longueur de la suture d'être insérée,qui est sensible à l'interférence des variations anatomiques.
5. Une augmentation temporaire de la vélocimétrie laser tout en insérant votre suture à travers l'ACC et de l'ICA assure que vous vous déplacez dans la bonne direction et à proximité de l'ostium MCA.
6. L'artère occipitale se pose le plus souvent à partir de la CEA proximale (bien que parfois de l'ICA) dans une direction postéro-latérale. Il faut être identifié (dans certains cas ligaturés) pour éviter toute confusion lors de l'insertion de la suture.
7. Pour diminuer la variabilité de l'infarctus, de maintenir la température du corps de la souris immobile pendant la chirurgie et éviter l'hypothermie après la chirurgie.
8. Utilisez TTC coloration jusqu'à 72 heures après la chirurgie MCAO pour analyser le volume de l'infarctus appropriée. Pour une plus longue survie points dans le temps d'utiliser d'autres méthodes de coloration comme la coloration crésyl violet pour déterminer la taille de l'infarctus.

	Koizumi méthode	Longa méthode
Site d'insertion de suture	Ipsilatéral l'artère carotide commune	Ipsilatéral l'artère carotide externe
Permanent sacrifice artérielle	Carotide commune et externe artères carotides	L'artère carotide externe
Risque de rupture artérielle peropératoire mortelle / hémorragie	Moins de préoccupation	Une plus grande préoccupation
Possibilité d'un détournement de suture dans l'artère ptérygo	Oui	Oui
Délais de procédure	Généralement plus rapide	Généralement plus
Laser Doppler: baisse en pourcentage du niveau de référence	> = 80%	> = 80%
Laser Doppler: l'occlusion / reperfusisur la tendance	Deux gouttes de base au cours de la procédure d'occlusion Un saut durant la procédure de reperfusion	Deux gouttes de base au cours de la procédure d'occlusion Deux sauts pendant la procédure de reperfusion

Tableau 1. Comparaison de deux méthodes de intraluminale occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) chez la souris

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Male C57BL/6 mice	Animal	Harlan Laboratories		20-26 grs
Dissection microscope	Microscope	Leica Microsystems		6.3:1 zoom
Fiber optic illuminator	Illuminator	TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA	FO1–-150
Isoflurane	Anesthesia	Baxter Internationl Inc.	1001936060
SuperCut Iris scissor, straight	Surgical tool	World Precision Instruments, Inc.	14218
Vannas micro-scissor, straight	Surgical tool	World Precision Instruments, Inc.	14003
Dumont fine tip forceps	Surgical tool	World Precision Instruments, Inc.	503290
Vessel clip	Surgical tool	World Precision Instruments, Inc.	14120
High Frequency Desiccator 900	Surgical tool	World Precision Instruments, Inc.	500397
7-0 surgical Nylon monofilament suture	Suture	Ethicon Inc.	1647G	Suture for occlusion
7-0 surgical Silk suture	Suture	Ethicon Inc.	7733G	Suture for ligation
Silicone RTV adhesive	Silicone rubber	World Precision Instruments, Inc.	1571
Vetbond	Tissue adhesive	3M	70200746587
Puralube Vet Ointment	Eye ointment	Pharmaderm Animal Health
Buprenorphine hydrochlorode	Analgesics	Hospira Inc.	NDC 0409-2012-32
Thermal Cautery Unit		World Precision Instruments, Inc.	501292
PeriFlux System 5000	TCD flowmetry	Perimed
BAT-12	Rectal thermometer	World Precision Instruments, Inc.	BAT-12R
T/PUMP, TP600	Thermal blanket	Gaymar Industries
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	T8877
Mice brain matrix slicer	Brain slicer	Zivic Instruments	BSMAS001-1