Summary
O intraluminal cerebral média de oclusão da artéria modelo (MCAO) é o modelo mais freqüente dentre os modelos experimentais acidente vascular cerebral isquêmico. Aqui vamos demonstrar todo o modelo em detalhes com o guia de Laser Doppler fluxometria, e os resultados do seu representante.
Abstract
AVC é a terceira principal causa de morte e a principal causa de incapacidade no mundo, com um custo estimado de perto de US $ 70 bilhões nos Estados Unidos em 2009 1,2. O intraluminal cerebral média de oclusão da artéria modelo (MCAO) foi desenvolvido por Koizumi 4 em 1986 para simular esta patologia de grande impacto humano no rato. A modificação do método de MCAO mais tarde foi apresentado por Longa 3. Ambas as técnicas têm sido amplamente utilizados para identificar mecanismos moleculares de lesão cerebral resultante de acidente vascular cerebral isquêmico e potencial modalidades terapêuticas 5. Este método relativamente não-invasivo em ratos foi estendido para uso em camundongos para tirar proveito de transgênicos e knockout cepas 6,7. À isquemia focal modelo cerebral, uma sutura intraluminal é avançado através da artéria carótida interna para ocluir a base do MCA. Retração da sutura, após um período de tempo especificado imita reperfusão espontânea, mas a sutura pode também ser mantida em permanência. Este vídeo estará demonstrando as duas abordagens principais para a realização de procedimento MCAO intraluminal em ratos de forma gradual, bem como fornecer insights para potenciais inconvenientes e perigos. O tecido cerebral isquêmico, posteriormente, ser manchada por 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto (TTC) para avaliar a extensão do infarto cerebral 8.
Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Institutional Animal Care e Use Committee (IACUC) da Universidade da Flórida e está em conformidade com o "Princípio do Laboratório Animal Care" (NIH Publication No. 86-23, revisado em 1985).
1. Materiais
- Animais: Camundongos machos C57BL / 6 (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, EUA) pesando 20-26 gramas no momento da cirurgia.
- Anestesia:
- Aparelho de anestesia: VetEquip sistema de anestesia inalatória (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EUA).
- Anestésicos inalatórios: O isoflurano (Farmacêutica Baxter, Deerfield, IL).
- Instrumentos cirúrgicos: uma tesoura SuperCut Iris, em linha reta (Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, FL, EUA); Vannas micro-tesouras, em linha reta (Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, FL, EUA); Dumont fórceps (ponta fina, 45 ° dicas dobrados, instrumentos de precisão World, Inc., Sarasota, FL, EUA); Bipolar unidade de coagulação (Exsicador High Frequency 900, Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, FL, EUA); clipe navio micro (Instrumentos de Precisão Mundial, Inc., Sarasota, FL, EUA)
- Materiais cirúrgicos: estéreis dicas de algodão; Wipes; esponjas de gaze; sutura (7-0 sutura de seda, Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EUA); adesivo tecidual (Vetbond, a 3M Company, St Paul, MN, EUA); matagal Cirúrgica : Bethadine, etanol 70%, e estéril 0,9%; pomada Eye (Puralube Pomada Vet, Pharmaderm, Melville, NY, EUA).
- Oclusão de sutura preparação para MCAO:
- Incandescência para MCA oclusão: 7-0 sutura cirúrgica de monofilamento de nylon (Ethicon, Inc., Somerville, NJ, EUA).
- Fonte de calor para embotamento da ponta de sutura (Unidade Térmica Cauterização, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL).
- Borracha de silicone líquido (silicone RTV adesiva, de precisão Mundial Instruments, Inc., Sarasota, FL, EUA).
- Cirúrgica / Dissecting microscópio (Leica Microscópio estéreo MZ6).
- Iluminador de fibra ótica (iluminador de fibra óptica Fo1-150, TechniQuip Corp, Livermore, CA, EUA).
- Laser doppler fluxometria (PeriFlux System 5000, Perimed, Estocolmo, Suécia).
- MICROTIP flexível (MT MICROTIP B500-0 Straight, Perimed, Estocolmo, Suécia)
- Parâmetros de temperatura:
- Monitorar a temperatura retal (BAT-12, instrumentos de precisão World, Inc., Sarasota, FL).
- Cobertor térmico (T / PUMP, TP600, Gaymar, NY, EUA).
- Coloração e medição quantitativa de infarto volume:
- 2% solução de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (2% TTC, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, EUA).
- Camundongos cérebro matriz slicer (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, EUA).
- Câmera digital (V1253, a Kodak Co., Rochester, NY, EUA).
- Imagem J software (software ImageJ 1.42q, EUA National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA).
2. Pré-cirúrgica passos
- Antes da cirurgia, os ratos estão alojados sob um ciclo claro / escuro 12:12 com livre acesso à água e para roedores.
- Suturas para MCAO são preparados por embotamento 1-2mm da ponta de sutura com o calor e revestimento 3-4mm de eixo de sutura de sua ponta com borracha de silicone líquido, permitindo-o secar (7-0; ponta de diâmetro, 0,20-0,25 milímetros; revestimento comprimento, 3-4mm; sutura comprimento 11-13mm). Esterilidade deve ser preservado em todas as etapas acima mencionadas.
- Após a pesagem do mouse, a anestesia é induzida com 4% de isoflurano em uma câmara de indução e mantida durante o procedimento com 1,5-2% isoflurano em 30% O 2 e 70% N 2 O mistura de gás através de uma máscara.
- O mouse é colocado em uma posição de bruços em uma gaze deitado sobre uma superfície de operação com temperatura controlada (manta térmica); a pele da cabeça é raspada.
- Pomada oftálmica lubrificante é aplicado a ambos os olhos, e as pálpebras estão fechadas para evitar a dessecação dos olhos durante o processo cirúrgico.
- A incisão mediana (1 cm) é feita sobre a pele que recobre a calvária da linha nucal superior ao násio ea pele é puxada lateralmente para afixar um MICROTIP flexível (MT B500-0 MICROTIP reta, diâmetro de 0,5 mm). O MICROTIP é colocado perpendicular à superfície do crânio parietal direita (1 mm e 5 mm posterior ao bregma laterais) para monitorar o fluxo de sangue no território MCA fluxometria por laser doppler.
- Certifique-se que o MICROTIP flexível é ligado ao crânio firmemente antes de o animal está ligado a uma posição supina. Pescoço do animal é colocada sobre uma almofada macia e seu nariz é mantido no cone do nariz do aparelho anestésico. Isto irá resultar em ter espaço suficiente para o MICROTIP flexível.
- Uma sonda de temperatura rectal é inserida para manter uma temperatura central constante de animais de 37 ± 0,5 ° C.
- Ambas as patas dianteiras e patas traseiras são gravadas para a superfície da plataforma operacional, ea cauda é colado o tubo retal. </ Ol>
- Sob o microscópio cirúrgico, uma incisão é feita na linha média do pescoço com uma tesoura entre o manúbrio e da mandíbula suavemente levantando a pele solta.
- A par subjacente glândulas submandibular são francamente dividida, com a glândula esquerda esquerda in situ. A glândula submandibular direita é retraída cranialmente e garantiu junto com o músculo esternocleidomastóideo.
- A divisão exposta do músculo omo-hióideo cobrindo a bainha carotídea é cuidadosamente dividido com pickups.
- A artéria carótida comum direita (CCA) é cuidadosamente separado e isolado do nervo vago e sua bainha (localizado lateralmente ao CCA).
- Daqui por diante, os 2 métodos cirúrgicos que têm sido usados com freqüência para realizar MCA oclusão diverge:
- Três pontos gola solta (7-0 seda) são preparados em todo o CCA direita.
- A artéria carótida externa (ACE) é identificado, isolado, e cauterizados (2-3mm distal a bifurcação). Ela pode posteriormente ser dividido com micro-tesoura. Para evitar danos acidentais periféricos no local de cauterização, o poder deve ser fixado em 1 usando o botão de energia. Isto é consistente para todos os cauterizações.
- Tensão suficiente é aplicada para a sutura de colarinho mais proximal sobre o CCA para oclusão do fluxo sanguíneo (ligadura permanente). A oclusão do fluxo é verificado por uma queda de ~ 50% dos valores basais cortical perfusão.
- Em seguida, um clipe de navio é colocado logo antes da bifurcação CCA para evitar fluxo retrógrado no momento da arteriotomia.
- Uma arteriotomia é executada entre a sutura proximal ligada e o clipe de navio no CCA com micro-tesoura (mais perto de ligadura).
- O calor blunted silicone revestido de sutura nylon 7-0 é introduzido através da arteriotomia e avançado até alcançar o clipe de navio. Os restantes 2 suturas colarinho soltos são gentilmente apertado ao redor do CCA entre o arteriotomia eo clipe de navio para evitar a volta de fuga através do fluxo CCA, com cuidado para não traumatizar a parede arterial, em seguida, o clipe de embarcação é retirada.
- O ECA é identificado, dissecado tanto quanto possível (perto de sua bifurcação em artérias lingual e maxilar), cauterização (com poder de definir a 1), e dividiu com micro-tesoura.
- Duas suturas gola solta (7-0 seda) são preparados em todo o ICA proximal um pouco acima da bifurcação CCA.
- O CCA está temporariamente fechada com um clipe navio. A oclusão do fluxo é verificado por uma queda de ~ 50% dos valores basais cortical perfusão.
- Em seguida, o ICA está temporariamente fechada com um clipe embarcação acima as duas suturas soltas colar para evitar fluxo retrógrado no momento da arteriotomia.
- Uma arteriotomia é executada usando micro-tesoura na próxima ECA refletida para o coto.
- O calor blunted silicone revestido de sutura nylon 7-0 é introduzido através da arteriotomia no ECA e avançado até alcançar o clipe de navio aplicada no ICA. Os 2 suturas gola solta no ICA proximal são gentilmente apertado ao redor da ACI proximal para evitar o fluxo de sangue através de refluxo ICA, com bastante atenção para não traumatizar a parede arterial, em seguida, o clipe de embarcação é retirada.
- A sutura oclusão está lentamente avançado através da artéria carótida interna (ACI) em direção à base do crânio até uma resistência moderada é sentida. A queda simultânea no valor do fluxo sanguíneo cerebral como uma porcentagem (= 80%) em relação à linha de base é confirmada por laser doppler fluxometria. Os 2 suturas são apertadas colar ao redor do filamento inserido.
- Para experimentos isquemia cerebral transitória, a sutura oclusão é retirado delicadamente após 45 minutos. Neste ponto o tempo pode ser alterado para vários objetivos experimentais.
- Depois de retirar o filamento de sutura, o site arteriotomia é fechada para evitar sangramento pós-cirúrgico. No método de Koizumi, isso envolve firmemente apertando as suturas colar em volta do CCA. Na técnica de Longa, o site arteriotomia na base do ECA é cauterizada, então as suturas colar no ICA proximal são afrouxados e removido para restaurar o fluxo de carótida.
- Para fechar a incisão, a glândula submandibular e SCM são colocados sobre o campo operatório. As bordas da ferida são então aproximados com adesivo em tecido cervical e áreas do couro cabeludo. Alternativamente, um grampo de sutura absorvíveis ou metal poderiam ser usados para fechar a ferida, especialmente quando sobrevivência a longo prazo do animal se destina.
- Após o encerramento da incisão, o animal recebe uma solução salina morna ml por via subcutânea, reposição de volume. Uma dose de analgésicos apropriados (ie Buprenorfina em 0,05-0,1 mg / kg) devem ser utilizados para minimizar a dor animal e desconforto durante o período de recuperação. A animal é removido da sala de cirurgia e colocado em uma gaiola de recuperação da área quente / para evitar a hipotermia, com acesso fácil e gratuito a uma alimentação suave e água.
- déficits não observáveis
- não-prorrogação forepaw contralateral (déficit neurológico leve focal)
- circulando em uma direção contralateral ao infarto (moderado déficit neurológico focal)
- caindo em uma direção contralateral ao infarto (grave déficit neurológico focal)
- depressão do nível de consciência sem movimento espontâneo
- Após 24 horas de reperfusão MCA, o mouse sobreviventes é pesado, profundamente anestesiados com isoflorane 4%, e sacrificado de acordo com o protocolo aprovado.
- O cérebro é cuidadosamente removido e colocado em um rato slicer cérebro matriz, e do cérebro inteiro é coronalmente seccionados em intervalos de 2 mm.
- As seções são imersos em 2% TTC em tampão fosfato salino (PBS) a 37 ° C por 20 minutos. Após a coloração TTC, área de infarto é mostrado como um tecido branco (sem manchas) adjacente ao tijolo vermelho (viável) tecido (Figura 1).
- Cortes seriados são fotografados usando uma câmera digital e na área de infarto é medido com o programa J imagem.
- A área de infarto (branco, imaculado), a área do hemisfério ipsilateral (branco e vermelho tijolo, manchado), ea área do hemisfério contralateral (tijolo vermelho manchado,) são medidos para cada seção. O volume é calculado pela soma das áreas de representação em todas as seções e multiplicando pela espessura do corte. Depois de corrigir para o edema, o volume de infarto é calculado da seguinte 9:
Volume Infarct corrigido (CIV),% = [volume hemisfério contralateral - (volume hemisfério ipsilateral - volume de infarto)] volume hemisfério / contralateral x 100
3. MCA cirurgia de oclusão:
Método de Koizumi 4
Longa método de 3
O restante do procedimento é em grande parte convergentes:
4. Pós-Op avaliação neurológica
Depois que o animal recupere a consciência total, déficits neurológicos podem ser avaliados por uma escala simples (cinco vírgula escala) da seguinte 3:
5. Coloração e medição quantitativa do volume de infarto cerebral
6. Resultados representante
Após a oclusão e reperfusão da MCA através deixou CCA para estabelecer isquemia cerebral transitória, os animais são sacrificados e seus cérebros coronalmente seccionado estão manchadas com TTC para avaliar o volume de infarto (Figura 1).
Figura 1. TTC-manchada seriados cérebro coronal (2 mm) de ratos submetidos a oclusão MCA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O modelo MCAO é um modelo estabelecido que replica isquemia cerebral em espécies murina. Este modelo foi usado pela primeira vez em ratos e, posteriormente adaptado para ratos. Evitando craniectomia para eliminar a influência da manipulação cirúrgica na permeabilidade da barreira do sangue cerebral e pressão intracraniana é uma vantagem desta técnica. No entanto, muitas variáveis, tais como tensão diferenças relacionadas 10, tamanho da ponta de sutura 11, a duração da oclusão 6, a temperatura do corpo 12, anestesia 13, e outros fatores podem levar à inconsistência nos volumes de infarto neste modelo.
Há detalhes técnicos específicos que merecem destaque:
- Revestimento final da sutura criará uma sutura lisa e controlável para a oclusão do MCA com risco de perfuração diminuiu.
- Delicadamente separados e seguros o nervo vago das artérias adjacentes por isso não é restrito inadvertidamente em uma sutura colar. Certifique-se usar duas suturas colar para evitar sangramento retrógrado através da arteriotomia ascendente enquanto a sutura oclusão e aperte-os com cuidado para não traumatizar a parede arterial.
- A artéria pterigopalatina diverge do ICA após CCA bifurcação. Para evitar desviar a ponta de sutura ascendente na artéria pterigopalatina em vez do ICA, configurar a sua plataforma cirúrgica para manter a cabeça de rato e pescoço em uma direção reta. Este desvio é comum a ambos de Koizumi e técnica Longa, então cuidado deve ser tomado em qualquer procedimento.
- Laser doppler fluxometria é um método de monitoramento em tempo real do fluxo de sangue em diversas regiões anatômicas, e é aplicada em nosso experimento para medir o fluxo de sangue na área do cérebro fornecida através de MCA. Aumenta significativamente a precisão do posicionamento da sutura, e, portanto, garante a obtenção de resultados consistentes. Esta é uma vantagem observado em relação às técnicas menos precisas de medir o comprimento da sutura a ser inserido, que é suscetível à interferência de variações anatômicas.
- Um aumento temporário de laser doppler fluxometria ao inserir o seu sutura através CCA e ICA garante que você está se movendo na direção certa e próximo ao óstio MCA.
- A artéria occipital na maioria das vezes surge a partir da ECA proximal (embora às vezes a partir do ICA) em uma direção póstero-lateral. Deve ser identificado (em alguns casos ligados) para evitar confusão mais tarde durante a inserção da sutura.
- Para diminuir a variabilidade de infarto, manter a temperatura corporal constante do mouse durante a cirurgia e evitar a hipotermia após a cirurgia.
- Use TTC coloração até 72 horas após a cirurgia MCAO para analisar o volume de infarto adequadamente. Para os pontos mais tempo de sobrevivência use métodos de coloração, tais como coloração violeta cresil para determinar o tamanho do infarto.
| Método de Koizumi | Método de Longa | |
| Local de inserção da sutura | Artéria carótida comum ipsilateral | Artéria carótida externa ipsilateral |
| Sacrifício arterial permanente | Carótida comum e artérias carotídeas externas | Artéria carótida externa |
| Risco de letal intra-arterial rotura e / ou hemorragia | Menos preocupação | Maior preocupação |
| Possibilidade de desvio de sutura na artéria pterigopalatina | Sim | Sim |
| Tempo processual | Geralmente mais rápido | Geralmente mais |
| Laser Doppler Fluxometria: queda percentual desde o início | > = 80% | > = 80% |
| Laser Doppler Fluxometria: tendência oclusão / reperfusão |
|
|
Tabela 1. Comparação de dois métodos de oclusão da artéria cerebral média intraluminal (MCAO) em camundongos
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Animal | Harlan Laboratories | 20-26 grs | |
| Dissection microscope | Microscope | Leica Microsystems | 6.3:1 zoom | |
| Fiber optic illuminator | Illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–-150 | |
| Isoflurane | Anesthesia | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| SuperCut Iris scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14218 | |
| Vannas micro-scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Dumont fine tip forceps | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 503290 | |
| Vessel clip | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14120 | |
| High Frequency Desiccator 900 | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 500397 | |
| 7-0 surgical Nylon monofilament suture | Suture | Ethicon Inc. | 1647G | Suture for occlusion |
| 7-0 surgical Silk suture | Suture | Ethicon Inc. | 7733G | Suture for ligation |
| Silicone RTV adhesive | Silicone rubber | World Precision Instruments, Inc. | 1571 | |
| Vetbond | Tissue adhesive | 3M | 70200746587 | |
| Puralube Vet Ointment | Eye ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Buprenorphine hydrochlorode | Analgesics | Hospira Inc. | NDC 0409-2012-32 | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, Inc. | 501292 | ||
| PeriFlux System 5000 | TCD flowmetry | Perimed | ||
| BAT-12 | Rectal thermometer | World Precision Instruments, Inc. | BAT-12R | |
| T/PUMP, TP600 | Thermal blanket | Gaymar Industries | ||
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Mice brain matrix slicer | Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS001-1 |
References
- Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
- Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
- Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
- Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
- Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
