Summary
Intraluminal orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli deneysel iskemik inme modelleri arasında en sık kullanılan model. Burada Lazer Doppler flowmetre kılavuzu ile ayrıntılı olarak tüm model ve onun temsilcisi sonuçları gösterecektir.
Abstract
İnme, 1,2 2009 yılında Amerika Birleşik Devletleri 70 milyar ABD doları yakın bir tahmini maliyeti, üçüncü önde gelen ölüm nedeni ve özürlülük dünyanın önde gelen nedenidir. Koizumi 4 sıçan bu etkileyici insan patoloji simüle etmek için 1986 yılında intraluminal orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli geliştirilmiştir. MCAO yöntemi bir değişiklik daha sonra Longa 3 tarafından takdim edildi. Her iki teknikte de yaygın iskemik inme ve olası tedavi yöntemleri 5 kaynaklanan beyin hasarının moleküler mekanizmaları tanımlamak için kullanılmaktadır. Bu nispeten noninvaziv bir metod sıçanlarda, farelerde transgenik ve nakavt suşları 6,7 yararlanmak kullanmak uzatıldı . Fokal serebral iskemi modeli için, intraluminal sütür internal karotid arter yoluyla MCA tabanı kapamak için ileri düzeydedir. Katlanması zaman belirli bir süre sonra dikiş spontan reperfüzyon taklit eder, ancak sütür de kalıcı olarak muhafaza edilebilir. Bu video, kademeli bir biçimde farelerde intraluminal MCAO prosedürü gerçekleştirmek için iki ana yaklaşım gösteren yanı sıra potansiyel sakıncaları ve tuzaklar anlayışlar olacaktır. Iskemik beyin dokusu daha sonra beyin enfarktüsü 8 ölçüde değerlendirmek için 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) ile boyanan olacaktır .
Protocol
Bu protokol, Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Florida Üniversitesi'nde Komitesi (IACUC) kullanın ve "Laboratuvar Hayvanları Bakım ilkesi" (NIH yayın No 86-23, 1985 revize) ile uyum içerisindedir.
1. Malzemeler
- Hayvanlar: cerrahi anda 20-26 gram ağırlığında Erkek C57BL / 6 fareler (Harlan Laboratuvarları, Indianapolis, IN, ABD).
- Anestezi:
- Anestezi makinesi: VetEquip inhalasyon anestezi sistemi (VetEquip A.Ş., Pleasanton, CA, USA).
- Anestezik Soluma: İsofluranın (Baxter İlaç, Deerfield, IL).
- Cerrahi araçları: SUPERCUT Iris makas, düz (Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD); Vannas mikro-makas, düz (Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD); Dumont forseps (ince uçlu, 45 ° bükülmüş ipuçları, Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD); Bipolar koagülasyon birimi (Yüksek Frekanslı Desikatör 900, Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD), mikro damar klip (Dünya Hassas Aletler A.Ş., Sarasota, FL, ABD)
- Cerrahi malzemeler: Steril pamuk ipuçları; Mendil, tül süngerler; Sütür (dikiş 7-0 İpek, Ethicon, Inc, Somerville, NJ, ABD); Doku yapıştırıcı (Vetbond, 3M Company, St Paul, MN, ABD); Cerrahi fırçalayın : Bethadine,% 70 etanol ve steril salin% 0.9; Göz merhemi (Puralube Veteriner Merhem, Pharmaderm, Melville, NY, ABD).
- Tıkanıklığı sütür MCAO için hazırlanması:
- MCA oklüzyonu Filament: 7-0 cerrahi naylon monofilament sütür (Ethicon, Inc, Somerville, NJ, ABD).
- Isı kaynağı sütür ucu (Termal Koter Birimi, Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL) küntleşme.
- Sıvı silikon kauçuk (Silikon RTV yapıştırıcı, Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD).
- / Cerrahi mikroskop Diseksiyon (Leica Stereo Mikroskop MZ6).
- Fiber optik aydınlatma (Fiber Optik aydınlatma FO1-150, TechniQuip Corp Livermore, CA, USA).
- Lazer Doppler flowmetre (PeriFlux Sistemi 5000 Perimed, Stockholm, İsveç).
- Esnek mikrotip (MT B500-0 Düz mikrotip, Perimed, Stockholm, İsveç)
- Isı parametreleri:
- Rektal ısı monitörü (BAT-12, Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL).
- Termal battaniye (T / POMPA, TP600, Gaymar, NY, ABD).
- Boyama ve hacim infarkt kantitatif ölçümü:
- % 2 solüsyon 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (2% TTC, Sigma-Aldrich Co-St Louis, MO, ABD).
- Fareler beyin matris dilimleme makinesi (Zivic-Miller Lab. Inc, Allison Park, PA, USA).
- Dijital fotoğraf makinesi (V1253, Kodak Co, Rochester, NY, ABD).
- Görüntü J yazılımı (ImageJ 1.42q yazılımı, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MA, ABD).
2. Cerrahi öncesi adımlar
- Ameliyat öncesinde, farelerin, su ve kemirgen yemi ücretsiz erişim ile 12:12 ışık / karanlık döngüsü altında muhafaza edilir.
- (7-0 kuru izin MCAO için Dikişler, ısı ve ucundan sıvı silikon kauçuk kaplama dikiş şaft 3-4mm ile sütür ucu 1-2mm küntleşme tarafından hazırlanan; ucu çapı, 0.20-0.25mm; kaplama uzunluğunda, 3-4mm; dikiş uzunluğu 11-13mm). Sterilite, söz konusu adımların tüm korunmuş olması gerekir.
- Fare ağırlığında sonra, anestezi indüksiyon odasında izofluran% 4 ile indüklenen ve% 30 O 2 ve% 70 N 2 O gaz karışımı bir yüz maskesi ile% 1.5-2 izofluran ile prosedür boyunca sürdürülmüştür.
- Fare (termal battaniye) sıcaklık kontrollü bir işletim yüzey üzerinde duran bir gazlı bez üzerine yüzükoyun pozisyonda yerleştirilir; baş kürk traş.
- Yağ oftalmik merhem iki göz için uygulanır ve göz kapaklarının cerrahi işlemi sırasında göz kuruma önlemek için kapalı.
- Nasion ve cilt esnek bir mikrotip (0.5mm çap MT B500-0 Düz mikrotip) yapıştırmayın yanal çekilir üstün ense hattan kalvaryumda örten cilt üzerinde orta hat insizyonu (1 cm) yapılır. Mikrotip lazer Doppler flowmetre MCA topraklarında kan akışını izlemek için sağ parietal kafatası yüzeyi (1 mm arka ve bregma lateral 5 mm) dik olarak yerleştirilir.
- Hayvan supin pozisyonda açılmadan önce esnek mikrotip kafatasına sıkıca takılı olduğundan emin olun. Hayvanın boyun yumuşak bir yastık yerleştirilir ve burun burun konisi anestezi cihazların tutulur. Bu esnek mikrotip için yeterli alana sahip neden olacaktır.
- Rektal ısı probu 37 ± 0.5 ° C sabit bir hayvan çekirdek sıcaklığını korumak için eklenir
- Her iki forepaws ve hindpaws işletim platformu yüzeye bantlanmış ve kuyruk rektal tüp bantlanmış. </ Ol>
- Operasyon mikroskobu altında, orta hat boyun insizyonu gevşek deri hafifçe kaldırarak manubrium ve çene arasındaki makas ile yapılır.
- In situ sol sol bezi ile eşleştirilmiş yatan submandibular bezlerin açık açık ayrılır. Sağ submandibular bezi cranially retrakte ve sternokleidomastoid kas ile birlikte güvence altına alınmıştır.
- Carotica'nın kapsayan omohyoid kas maruz kalan bölümü dikkatle manyetikler ile ayrılmıştır.
- Sağ karotis arter (CCA), vagus siniri ve kılıf (CCA lateralinde bulunan) dikkatlice ayrılmış ve izole edilmiştir.
- Bundan sonra, farklı MCA oklüzyonu gerçekleştirmek için sık sık kullanılan 2 cerrahi yöntemler :
- Üç gevşek yakalı sütür (7-0 ipek) sağ CCA etrafında hazırlanmıştır.
- Eksternal karotid arter (ECA), tespit izole ve koterize (bifurkasyon için distal 2-3mm). Bu daha sonra mikro makas ile ayrılabilir. Koterizasyon yerinde yanlışlıkla periferik hasarları önlemek için, güç, güç düğmesini kullanarak 1 ayarlanmış olmalıdır. Bu tüm cauterizations için tutarlı.
- Yeterli gerilim, kan akımı (kalıcı ligasyonu) CCA kapamak için en proksimal yaka dikiş uygulanır. Akış tıkanma temel kortikal perfüzyon değerlerinin ~ 50% düşüş tarafından doğrulanmadı.
- Sonra bir gemi klibi arteriyotomi zaman retrograd akışını önlemek için sadece CCA çatallanma önce yerleştirilir.
- Bir arteriyotomi mikro-makas (yakın ligasyonu) ile proksimal bağlandı dikiş ve CCA damar klip arasında yapılır.
- Arteriyotomi ısı köreldiğini silikon kaplı 7-0 naylon sütür ile tanıştırdı ve damar klip ulaşana kadar gelişmiş. Arter duvarında travmatize dikkatli, CCA üzerinden akış kaçağı önlemek için arteriyotomi ve damar klip arasında CCA çevresinde kalan 2 gevşek yakalı sütür hafifçe sıkılır, daha sonra damar klip çekilmiş.
- ECA, tespit koterize (1 gücü ile), (dilli ve maksiller arterlerin ayrılmasından yakınında) mümkün olduğu kadar disseke ve mikro-makas ile bölünmüş.
- İki gevşek yakalı sütür (7-0 ipek) CCA çatallanma sadece yukarıda proksimal ICA çevresinde hazırlanmıştır.
- CCA geçici bir gemi klibi ile kapatılır. Akış tıkanma temel kortikal perfüzyon değerlerinin ~ 50% düşüş tarafından doğrulanmadı.
- Sonra ICA arteriyotomi zaman retrograd akışını önlemek için iki gevşek yakalı sütür üzerinde bir gemi klip ile geçici olarak kapatıldı.
- Güdük yansıyan ECA yakın bir arteriyotomi mikro-makas kullanılarak yapılır.
- ECA arteriyotomi ısı köreldiğini silikon kaplı 7-0 naylon sütür ile tanıştırdı ve ICA uygulanan damar klip ulaşana kadar gelişmiş. Proksimal ICA 2 gevşek yakalı sütür, arter duvarındaki travmatize yeterince ilgi, ICA reflü kan akışını önlemek için proksimal ICA etrafında hafifçe sıkılır, daha sonra damar klip çekilmiş.
- Hafif bir direnç hissedilir kadar kapatılmasıy sütür internal karotis arter (ICA) kafa tabanına doğru yavaş yavaş ilerlemiştir. Serebral kan akımı değeri başlangıca göre bir yüzdesi (% 80) olarak eşzamanlı açılan lazer Doppler flowmetre tarafından teyit edilir. 2 yaka sütür eklenen filament etrafında sıkılır.
- Kapatılmasıy dikiş geçici serebral iskemi deneyleri için, 45 dakika sonra hafifçe geri çekilir. Bu zaman noktası, çeşitli deneysel amaçlar için değiştirilebilir.
- Arteriyotomi sitesinde dikiş filament çekilme sonra, ameliyat sonrası kanama önlemek için kapalı. Koizumi yöntemi, bu güvenli CCA etrafında yakalı sütür sıkma içerir. Longa tekniği, ECA üssünde arteriyotomi sitesi koterize, proksimal ICA yakalı dikişlerle sonra gevşedi ve karotis akışı geri kaldırılır.
- Insizyon kapatmak için, submandibular bezi ve SCM ameliyat alanın üzerine serilir. Yara kenarları sonra servikal doku yapıştırıcısı ve kafa derisi alanları ile yaklaştırılır. Alternatif olarak, emilebilen bir sütür veya metal zımba, hayvanın uzun süreli sağkalım amaçlanan, özellikle yara kapatmak için kullanılan olabilir.
- Kesi kapatılmasından sonra, hayvan hacmi ikmal olarak subkutan 1 ml ılık tuzlu su alır. Iyileşme döneminde hayvanın ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için uygun analjezik doz (0.05-0.1 mg / kg 'yani Buprenorfin) kullanılmalıdır. Animal cerrahi seti kaldırıldı ve yumuşak gıda ve su ücretsiz, kolay erişim, hipotermi önlemek için sıcak bir kurtarma alan / kafes yerleştirilir.
- gözlemlenebilir açıkları yok
- kontralateral forepaw (hafif fokal nörolojik defisit) genişletmek için başarısızlık
- infarkt için kontralateral bir yön çizerek (orta fokal nörolojik defisit)
- infarkt kontralateral bir yön düşen (ciddi fokal nörolojik defisit)
- spontan hareket olmadan bilinç depresif
- MCA reperfüzyon 24 saat sonra, hayatta kalan fare,% 4 isoflorane ile derin anestezi tartılır ve onaylanmış protokole göre kurban.
- Beyin dikkatle kaldırılır ve bir fare beyin matris dilimleyiciyi yerleştirilir ve 2 mm aralıklarla tüm serebrum koronal kesitli.
- Bölümleri TTC 37 fosfat tamponlu salin (PBS)% 2 ° C de 20 dakika boyunca dalmış. TTC boyama sonra, infracted alan kırmızı tuğla (canlı) doku (Şekil 1) bitişik bir beyaz (boyasız) doku olarak gösterilmiştir.
- Seri bölümleri, dijital kamera ve görüntü J programı ile ölçülür infarkt alanı kullanılarak fotoğraflandı.
- Infarkt alanı (beyaz, boyasız), ipsilateral hemisferde (lekeli, tuğla, beyaz ve kırmızı) alanında ve kontralateral hemisferde (kırmızı tuğla, vitray) alanında, her bölüm için ölçülür. Hacmi, tüm bölümlerde temsilcisi alanlarda toplayarak ve kesit kalınlığı ile çarpılarak hesaplanır. Ödemi düzelttikten sonra, enfarktüs hacmi 9 aşağıdaki gibi hesaplanır:
Düzeltilmiş İnfarkt Hacmi (CIV),% = [kontralateral hemisfere hacmi - (ipsilateral yarımkürede hacmi - infarkt hacmi)] / kontralateral yarımkürede hacmi x 100
3. MCA oklüzyonu cerrahisi:
Koizumi Kullanıcı 4 yöntem
Longa Kullanıcı 3 yöntem
Prosedürün geri kalanı büyük ölçüde yakınsak:
4. Post-Op nörolojik değerlendirme
3 aşağıdaki gibi, hayvan toplam bilinç kavuşur sonra nörolojik defisit basit bir ölçek (beş puanlık bir ölçek) tarafından değerlendirilmelidir.
5. Boyama ve beyin infarkt hacmi kantitatif ölçümü
6. Temsilcisi Sonuçlar
Geçici serebral iskemi kurmak için sol CCA ile MCA oklüzyon ve reperfüzyon sonra, hayvanlar kurban ve onların koronal kesitli beyinleri infarkt hacmi (Şekil 1) değerlendirmek için TTC ile boyandı.
Şekil 1 fareler TTC-lekeli seri koronal beyin bölümler (2 mm) MCA oklüzyonu tabi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MCAO model fare türlerinde serebral iskemi çoğaltır kurulmuş bir model. Bu model ilk sıçanlarda kullanılır ve bundan sonra farelere adapte oldu. Kraniektomi kaçınmak, kan-beyin bariyeri geçirgenliği ve intrakranial basınç cerrahi manipülasyonu etkisini ortadan kaldırmak için bu tekniğin bir avantaj. Ancak, ilgili gerilim farklılıkları 10, 6, oklüzyon vücut ısısı 12, anestezi 13 sütür ucu 11, süresi büyüklüğü ve diğer faktörler gibi pek çok değişken, bu model infarkt hacimleri tutarsızlık yol açabilir.
Söz emri özel teknik ayrıntılar vardır:
- Kaplama dikiş sonunda azalmış perforasyon riski ile MCA kapatılmasıy pürüzsüz ve yönetilebilir bir dikiş yaratacaktır.
- Komşu arterlerden vagus siniri böylece yanlışlıkla İncelikli bir yaka dikiş ayrı ve güvenli sınırlı değildir. Kapatılmasıy dikiş çıkarken arteriyotomi yoluyla retrograd kanamayı önlemek için iki yaka sütür kullanımı ve arter duvarında travmatik önlemek için hafifçe sıkın emin olun.
- Pterigopalatin arter bifurkasyon CCA sonra ICA uzaklaşmakta. ICA yerine pterigopalatin artere artan sütür ucu sapma önlemek için, fare, baş ve boyun düz bir yönde tutmak için cerrahi bir platform kurdu. Bu sapma, hem de Koizumi ve Longa tekniği ortak, bu yüzden her iki prosedürde dikkat edilmelidir.
- Lazer Doppler flowmetre bir yöntem çeşitli anatomik bölgelerde kan akışı gerçek zamanlı izleme ve MCA yoluyla verilen beyin alanında kan akışını ölçmek için deney uygulanır. Dikiş konumlandırma doğruluğu önemli ölçüde artar ve böylece tutarlı sonuçlar elde sağlar. Bu daha az hassas anatomik varyasyon girişim duyarlı eklenecek dikiş uzunluğu ölçme teknikleri üzerinde tanınmış bir avantajdır.
- CCA ve ICA aracılığıyla dikiş eklerken lazer Doppler flowmetre geçici bir artış, doğru yönde hareket ediyor sağlar ve MCA ostium yakındır.
- Oksipital arterin posterolateral yönde proksimal ECA (bazen ICA rağmen) en sık ortaya çıkar. Dikiş eklerken daha sonra karışıklığı önlemek için (bazı durumlarda bağlandı) tespit edilmelidir.
- Infarktüsü değişkenliği azaltmak için ameliyat sırasında fare vücut ısısını sabit tutmak ve ameliyat sonrası hipotermi önlemek için.
- MCAO ameliyat sonrası 72 saat kadar uygun infarkt hacmi analiz için boyama TTC kullanın. Infarkt boyutunu belirlemek için daha uzun süre hayatta kalma süresi noktaları cresyl menekşe boyama gibi diğer boyama yöntemleri kullanın.
| Koizumi Kullanıcı Yöntemi | Longa Kullanıcı Yöntemi | |
| Sütür ekleme Sitesi | Ortak ipsilateral karotis arter | Harici ipsilateral karotis arter |
| Sürekli arter kurban | Ortak Karotis ve Dış Karotid arterler | Harici Karotid arter |
| Ölümcül intraoperatif arteriyel rüptürü / kanama riski | Daha az endişe | Daha büyük bir endişe |
| Pterigopalatin artere dikiş saptırma imkanı | Evet | Evet |
| Usul zaman | Genellikle daha hızlı | Genellikle uzun |
| Lazer Doppler flowmetre: başlangıca Yüzde düşüşü | > =% 80 | > =% 80 |
| Lazer Doppler flowmetre: oklüzyon / reperfüzyon trend |
|
|
Tablo 1 iki yöntem farelerde intraluminal orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) karşılaştırılması
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, herhangi bir çıkar çatışmasından olduğunu beyan ederim.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Male C57BL/6 mice | Animal | Harlan Laboratories | 20-26 grs | |
| Dissection microscope | Microscope | Leica Microsystems | 6.3:1 zoom | |
| Fiber optic illuminator | Illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–-150 | |
| Isoflurane | Anesthesia | Baxter Internationl Inc. | 1001936060 | |
| SuperCut Iris scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14218 | |
| Vannas micro-scissor, straight | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Dumont fine tip forceps | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 503290 | |
| Vessel clip | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 14120 | |
| High Frequency Desiccator 900 | Surgical tool | World Precision Instruments, Inc. | 500397 | |
| 7-0 surgical Nylon monofilament suture | Suture | Ethicon Inc. | 1647G | Suture for occlusion |
| 7-0 surgical Silk suture | Suture | Ethicon Inc. | 7733G | Suture for ligation |
| Silicone RTV adhesive | Silicone rubber | World Precision Instruments, Inc. | 1571 | |
| Vetbond | Tissue adhesive | 3M | 70200746587 | |
| Puralube Vet Ointment | Eye ointment | Pharmaderm Animal Health | ||
| Buprenorphine hydrochlorode | Analgesics | Hospira Inc. | NDC 0409-2012-32 | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, Inc. | 501292 | ||
| PeriFlux System 5000 | TCD flowmetry | Perimed | ||
| BAT-12 | Rectal thermometer | World Precision Instruments, Inc. | BAT-12R | |
| T/PUMP, TP600 | Thermal blanket | Gaymar Industries | ||
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Reagent | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| Mice brain matrix slicer | Brain slicer | Zivic Instruments | BSMAS001-1 |
References
- Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).
- Lloyd-Jones, D. Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 119, e21-e181 (2009).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 84-91 (1989).
- Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse. Neurol Res. 19, 641-648 (1997).
- Fujii, M. Strain-related differences in susceptibility to transient forebrain ischemia in SV-129 and C57black/6 mice. Stroke; a journal of cerebral circulation. 28, 1805-1810 (1997).
- Bederson, J. B. Evaluation of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats. Stroke; a journal of cerebral circulation. 17, 1304-1308 (1986).
- Qi, X., Hosoi, T., Okuma, Y., Kaneko, M., Nomura, Y. Sodium 4-phenylbutyrate protects against cerebral ischemic injury. Mol Pharmacol. 66, 899-908 (2004).
- Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy. J Cereb Blood Flow Metab. 13, 683-692 (1993).
- Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56, 196-200 (2005).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke; a journal of cerebral circulation. 35, 1720-1725 (2004).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism? Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).
