Summary
يمكن أن يجمد تعيش البكتيريا سالبة الجرام والجرام إيجابية على الجيلاتين المغلفة الميكا وتصويرها في السائل باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية (AFM).
Abstract
فؤاد هو قرار عالية (مقياس نانومتر) أداة التصوير التي تحقيقات ميكانيكيا السطح. فمن لديه القدرة على الخلايا والجزيئات الحيوية الصور ، في البيئة السائلة ، دون الحاجة إلى علاج كيميائي العينة. من أجل تحقيق هذا الهدف ، يجب أن تلتزم بما فيه الكفاية لعينة سطح متزايدة لمنع إزالة القوات التي بذلتها ناتئ المسح غيض فؤاد. في كثير من الحالات ، والتصوير الناجح يعتمد على تجميد العينة إلى السطح في تصاعد مستمر. على النحو الأمثل ، يجب أن يكون تجميد مينيملي لهذه العينة التي لا شبهة عمليات التمثيل الغذائي والصفات الوظيفية. بواسطة طلاء الأسطح الميكا المشقوق حديثا مع الخنازير (خنزير) الجيلاتين ، يمكن أن يجمد البكتيريا سالبة الشحنة على السطح والتقط في السائل بواسطة فؤاد. تجميد الخلايا البكتيرية على الجيلاتين المغلفة الميكا هو على الأرجح بسبب التفاعل الكهربائي بين البكتيريا سالبة الشحنة والجيلاتين موجبة الشحنة. ويمكن لعوامل عديدة تتداخل مع الشلل الجرثومية ، بما في ذلك المكونات الكيميائية للسائل الذي تعلق البكتيريا ، وفترة حضانة البكتيريا من الجيلاتين على خصائص السطح المطلي الميكا ، من سلالة بكتيرية والمتوسطة التي يتم تصويرها على البكتيريا. عموما ، تم العثور على استخدام الجيلاتين المغلفة الميكا لتكون قابلة للتطبيق عموما للخلايا الميكروبية التصوير.
Protocol
1. الميكا التحضير :
- قطع الميكا (علوم المجهر الإلكتروني) مع مقص لحجم اللازمة لاحتواء المجهر AFM (حوالي 22 × 30 ملم).
- يلتصق على الميكا على كلا الجانبين ، وذلك باستخدام الشريط عموما لإزالة الطبقة الخارجية ، وحتى طبقات فقط لا تزال متواصلة على نحو سلس.
2. إعداد حل الجيلاتين :
- إضافة 100 مل من الماء المقطر لزجاجة المختبر.
- حرارة الزجاجة في الميكروويف حتى يبدأ الماء في الغليان. (إذا لم يتوفر الميكروويف ، ويمكن تسخين الماء في الكأس على طبق ساخن.)
- خارج تزن 0.5 غرام من الجيلاتين (سيغما G - 6144 ، G - 2625 أو 2500 G) وإضافة إلى الماء المقطر الساخن.
- بلطف دوامة يذوب تماما الزجاجة حتى الجيلاتين.
- تبريد حل الجيلاتين الى 60-70 درجة مئوية.
- صب حوالي 15 ملم في كوب صغير (20 مل) إلى التي يمكن انخفض الميكا خفض المشقوق.
3. الميكا طلاء :
- يغرق الساحات الميكا في الحل وسحب الجيلاتين تحسنت بسرعة أن مثل هذه الميكا وهي مغلفة (الشكل 1A).
- بعد طلاء ، ودعم الميكا على الفور ، على حافة الهاوية ، على منشفة ورقية لتجف في الهواء المحيط (الشكل 1B). يمكن استخدام الجيلاتين الميكا المغلفة على الأقل 2 أسابيع. يمكن الاحتفاظ الزائد حل الجيلاتين مبردة وتستخدم لمدة شهر تقريبا قبل الحل ببساطة إعادة تسخين الأسهم إلى ما بين 60-70 درجة مئوية. يجب توخي الحذر لضمان أن الجيلاتين ليس المغلي خلال إعادة تسخين.
4. تركيب البكتيريا على الميكا المغلفة الجيلاتين :
- بيليه 1 مل من ثقافة البكتيرية (0،5-1،0 OD في 600 نانومتر) في 4500 من 800 إلى إطار التعاون الإقليمي. اعتمادا على البكتيريا ، واستخدام الحد الأدنى من التعاون الإقليمي التي من شأنها أن بيليه الخلايا في الدقائق ال 5 ~.
- غسل بيليه في نفس الحجم من الماء منزوع الأيونات تمت تصفيتها أو العازلة.
- جمع الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي.
- Resuspend على الفور بيليه في 500 ميليلتر من الماء منزوع الأيونات nanopure أو العازلة. (يجب أن يكون التعليق البكتيرية عكر واضح من أجل أن يكون هناك تركيز كاف من الخلايا للتصوير AFM).
- تطبيق نظام التعليق الخلية (10-20 ميكرولتر) إلى الميكا الجيلاتين المغلفة وانتشارها على السطح باستخدام تلميح ماصة (الشكل 1C). وينبغي الحرص على عدم لمس فعليا سطح الجيلاتين مع طرف ماصة أثناء تطبيق أو نشر الحل الجرثومية.
- السماح للسطح للراحة لمدة 10 دقيقة وشطف مع تيار من الماء أو العازلة (الشكل 1 CD). في جميع أنحاء الداخلي ، واتخاذ الحذر لضمان أن لا يسمح للعينة لتجف.
5. ممثل النتائج :
الشكل 2 يبين مثل الصور من الخلايا البكتيرية التي تم تركيبها على الجيلاتين المغلفة الميكا والتقط بواسطة فؤاد. في مختبراتنا ، يتم تصويرها عادة العينات باستخدام مجهر القوة الذرية PicoPlus (اجيلنت تكنولوجيز ، ومعبد ، من الألف إلى الياء) تجهيزه برأس المسح 100 ميكرون. ويتم تشغيل الأداة في 128-512 بكسل لكل خط مسح في سرعة تفحص خطوط 0،5-1،0 / ثانية. والكابولي التي تستخدم عادة في تحقيقات Veeco نيتريد السيليكون (MLCT - AUHW ، Veeco ، وسانتا باربرا ، كاليفورنيا) مع ثوابت الربيع الاسمية تتراوح ،01-0،1 NN / نانومتر.
الشكل 1. الجيلاتين في درجة حرارة 60-70 درجة مئوية. توضع في كوب C 20 مل. باستخدام زوج من ملاقط المشقوق طازجة ويغرقها في الساحات الميكا الجيلاتين (أ) سحب وضعت رأسي على منشفة ورقية يميل ضد الطرد المركزي الرف الصغير (ب). يتم وضع قطرة من العينة على الميكا البكتيرية وانتشارها مع طرف الماصة X في كل الاتجاهات وY (ج). بعد السماح لاحتضان العينة على سطح الميكا لا يقل عن 10 دقيقة ، شطف العينة في تيار من الماء المقطر. إذا كان الشلل عملت سوف تكون قادرا على رؤية بقعة معتمة على الميكا كما هو موضح في اللوحة اليمنى من (د). إذا كان الشلل لم تنجح سوف تحصل على قطعة من الميكا واضحة كما في اللوحة اليسرى. بقعة معتمة على جداول الميكا للتركيز البكتيريا في الحبرية التي تضع على الميكا الجيلاتين المعالجة.
الشكل 2. الصور AFM من E. القولونية. في لوحة (أ) ، هي التي شنت على الجيلاتين الخلايا المغلفة الميكا والمصورة في برنامج تلفزيوني 0،005 م. وعلى سبيل المقارنة ، يظهر صورة من الخلايا البكتيرية التي شنت على الجيلاتين المغلفة الميكا وتصويرها في الهواء في لوحة (ب). على الرغم من حواجز مرئية بشكل واضح في الصورة التي جمعت في السائل ، والمزيد من القرار ، كما يتبين من وجود الشعرة (لوحة أقحم (ب)) ، ويمكن الحصول عليها في الهواء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن لعوامل مختلفة تؤثر على الخلايا الميكروبية والتصوير المتزايدة التي كتبها فؤاد. والجيلاتين الذي يستخدم لطلاء الميكا هو المهم. معزول التجارية الجيلاتين من عدد من الفقاريات بما فيها الأسماك ، الأبقار ، والخنازير. كل من الأصل وطريقة المعالجة تحديد مدى صلاحيتها للاستيقاف الجيلاتين البكتيرية. قيمت مصادر عديدة وأنواع من الجيلاتين لفعاليتها في شل حركة البكتيريا [1]. تم العثور على gelatins هما الأكثر فعالية ليكون سيغما G - 6144 G و 2625. المشتقة من الخنازير (الخنازير) ، وتعتبر هذه gelatins أن بلوم المنخفضة والمتوسطة بلوم ، على التوالي. من المهم لاختبار التوافق بين الركيزة الجيلاتين المعاملة وسلالة معينة من البكتيريا التي يتعين دراستها. الأهم من ذلك ، الجيلاتين مشتقة من الماشية (الأبقار) لم تكن فعالة في شل حركة أي من البكتيريا التي تم اختبارها. اختبار بسيط لتجميد الخلايا يتضمن السماح للعينة لتجف على الميكا ، وبعد الشطف بالماء أو العازلة (بعد الخطوة 4.6). إذا ثبتوا على البكتيريا ، وسوف يكون لاحظ منطقة غائمة (شكل 1D). إذا كان السطح لا غائم ، أزال تيار من مياه الشطف البكتيريا. عند إجراء هذا الاختبار ، يجب على المستخدم أن يكون حذرا من آثار المواد المضافة ، مثل الأملاح ، ويمكن أن يؤدي أيضا إلى ظهور غائما.
وقد تم بنجاح وتجميد الميكا الجيلاتين المغلفة التقنية المطبقة على الجراثيم سلبية الغرام وإيجابية الغرام (1) ، spheroplasts البكتيرية (2) ، والجسيمات فيروس (3) وقذائف المشطورة (4). الشلل مع الجيلاتين في الاستفادة من الخلايا تفريق على الركيزة ، والذي يسمح للصور لبكتيريا الفردية التي ينبغي اتخاذها. أيضا الأسلوب يضمن أن عددا كافيا من الخلايا المتوفرة في كل مجال ، مما يقلل من الوقت الذي يقضيه في البحث عن الخلايا. كما تم استخدام هذا الاسلوب لجمع قياسات القوة على سطوح الخلايا من كلا E. القولونية (5) والزائفة الزنجارية (6). يمكن أن خصائص سلالات بكتيرية مختلفة تؤثر الشلل. على سبيل المثال ، في حين أن من النوع البري من E. لم يتم يجمد ستابلي القولونية (DH5α) في السائل باستخدام ركائز مغلفة مع الجيلاتين G - 6144 ، مما يشكل ضغطا نقص في البروتين الدهني الغشاء الخارجي ، لا يستوقف NlpI جيدا والمطلوب بدلا من ذلك ارتفاع بلوم الجيلاتين (سيغما G - 2500).
يمكن حل محتويات جرثومية تؤثر أيضا على تجميد الخلايا. قد سائط النمو ، ومخازن معينة ، وتتداخل مع أملاح ملزمة البكتيرية (أنها تتنافس مع البكتيريا عن سطح الجيلاتين) وسيتعين اختبارها. في نهاية المطاف ، والتصوير الناجح من البكتيريا في السائل بواسطة فؤاد يعتمد على الاستفادة المثلى من الشلل (على عدد الخلايا) ، واختيار السائل الأمثل لتطبيق هذه البكتيريا على سطح الميكا والتصوير في وسط السائل المتوافقة مع تجربتك المصممة. على سبيل المثال ، تم تمييع عازلة تستخدم بنجاح حيث E. وقد ثبتوا على القولونية الجيلاتين المغلفة الميكا في الفوسفات 0.01M عزلت المالحة (PBS) ، مشطوف مع عازلة نفسها ملزمة لإزالة الخلايا بشكل فضفاض ، وتصوير برنامج تلفزيوني في وقت لاحق في 0.005M (الشكل 2). لخلايا حساسة osmotically ، والسكروز ، وتصل إلى 0.25 م ، وقد استخدم بنجاح لتركيب والبكتيريا التصوير [2-6]. وضع التصوير هو عامل آخر ينبغي أخذها في الاعتبار عند محاولة البكتيريا صورة ملزمة ضعيفة في السوائل. يمكن الاتصال تصوير الوضع تهجير البكتيريا ملزمة فضفاضة. أوضاع التصوير noncontact ، ووضع طريقة التنصت على MAC ، والحد من القوات الوحشية التي تمارسها تلميح التحقيق ، وبالتالي قد يكون المفضل.
بدلا من ذلك ، قد تستخدم الكابولي مع ثوابت الربيع منخفضة وتقليل قوة الاتصال في وضع يساعد أيضا على البكتيريا صورة ملزمة فضفاضة.
التصوير عينات البكتيريا تعيش في السائل يتيح الفرصة للحصول على صور ممثل سطح الخلية دون المساس آثار التجفيف. ويمكن جمع مقاييس دقيقة للخصائص السطح ، والارتفاع ، والصلابة للخلية الحية. في مثل الأزياء ، ويمكن استخدام جزيئات محددة التحقيق التابعة لناتئ لتحديد التفاعلات ، خريطة الموقع ، وقياس القوات ملزمة لأهداف محددة على سطح الخلية [7]. الشلل من البكتيريا في بيئة سائلة تسهل المعيشة دراسات ديناميكية الخلايا البكتيرية. هذا قد تشمل دراسات للنمو البكتيري والانقسام ، وتأثير إضافة إلى الأنواع الجزيئية المتوسطة والتصوير ، وتغيير الخصائص الفيزيائية للبيئة مثل درجة الحرارة أو الضغط. عموما ، لديها الخيار لدراسة البكتيريا في السوائل ، وبدقة عالية ، والوقود الخيال مع إمكانيات البحث في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
ويرعى هذه البحوث من خلال مكتب البحوث البيولوجية والبيئية ، وزارة الطاقة الأميركية ، ومنح التمويل من فرجينيا كومنولث مجلس بحوث الصحة. ويدير مختبر أوك ريدج الوطني بواسطة UT - باتيل ، ذ م م ، وزارة الطاقة في الولايات المتحدة بموجب العقد رقم DE - AC05 - 00OR22725.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
