原子力显微镜成像的细菌固定化

Summary

现场革兰氏阴性和革兰氏阳性菌，可固定在明胶包覆云母和利用原子力显微镜（AFM）在液体中成像。

Abstract

AFM是一个高分辨率（纳米尺度）的成像工具，机械探头表面。它具有图像细胞和生物分子的能力，在液体环境中，无需化学处理的样品。为了实现这一目标，必须充分坚持样品安装表面，以防止去除扫描原子力显微镜悬臂的针尖施加的力量。在许多情况下，成功的成像取决于样品固定在安装表面。理想情况下，固定应微创样品等的代谢过程和功能属性不受损害。猪（猪）明胶涂层新鲜剥离的云母表面带负电荷的细菌可以固定在表面上，并在液体中原子力显微镜成像。明胶包覆云母上的细菌细胞固定化是最有可能是由于带负电荷的细菌和带正电荷的明胶之间的静电相互作用。有几个因素可以干扰细菌固定化，包括在其中的细菌悬浮液，明胶包覆云母，菌株和成像在其中的细菌培养基的表面特性的细菌培养时间化学成分。总体而言，使用明胶包覆云母成像微生物细胞被普遍适用。

Protocol

1。云母的准备：

1. 削减云母的大小要适合AFM显微镜（约22 × 30毫米）的剪刀（电子显微镜学）。
2. 顺劈斩双方云母，一般用胶带去除的外层，直到顺利不间断层保持。

2。明胶溶液的制备：

1. 实验室瓶100毫升的蒸馏水。
2. 一瓶在微波加热，直到水开始沸腾。 （如果不可用微波炉，水可以在一个热点板块的烧杯加热。）
3. 称取0.5克，明胶（Sigma公司的G - 6144 G - 2625或G - 2500），加入热蒸馏水。
4. 轻轻摇动瓶子直到明胶完全溶解。
5. 明胶溶液冷却到60-70 ° C。
6. 削减云母可斜射到小烧杯中（20毫升）倒入约15毫升。

3。云母涂层：

1. 云母广场淹没到温暖的明胶溶液，并迅速撤出，云母涂层（图1a）。
2. 涂装后，立即支持云母，边缘，在纸巾上，周围空气中的干（图1b）。明胶包覆云母可用于至少2周。多余的明胶溶液可冷藏保存，使用约一个月只需再加热原液之间60-70 ° C。必须小心，以确保明胶期间未再加热煮沸。

4。安装明胶包覆云母的细菌：

1. 佩莱1毫升细菌培养在800至4​​500 RCF（0.5 - 1.0在600 nm的OD）。根据上的细菌，使用最低的区域合作框架，将沉淀的细胞〜5分钟。
2. 在相同体积的过滤去离子水或缓冲液洗涤沉淀。
3. 再通过离心收集细胞。
4. 及时nanopure去离子水或缓冲液500μL重悬沉淀。 （菌悬液应明显混浊才能有足够的浓度细胞的原子力显微镜成像。）
5. 应用细胞悬液（10-20μL）明胶包覆云母和表面上的传播，使用吸头（图1c）。应采取不接触枪头明胶的表面，而申请或传播细菌的解决方案。
6. 允许休息10分钟，并与流的水或缓冲液（图1 CD）冲洗表面。整个过程中，照顾，以确保该样本是不允许干的。

5。代表性的成果：

图2显示了已安装在明胶包云母和原子力显微镜成像的细菌细胞的例子图像。在我们的实验室，样品通常使用一个PicoPlus原子力显微镜（安捷伦科技，寺，AZ），配备一个100微米的扫描头成像。该仪器操作在0.5-1.0行/秒的扫描速度在128-512像素，每行扫描通常使用的悬臂Veeco的氮化硅探针与标称弹簧常数的范围从0.01至0.1 NN /纳米（MLCT AUHW，Veeco公司，圣巴巴拉分校，加利福尼亚州）。

图1，在温度60-70℃放置在20毫升的烧杯中明胶。使用镊子新鲜剥离的云母广场完全沉浸到明胶（一）撤销，而直立靠在一个微型离心机机架（二）一纸毛巾放在。细菌样品液滴放置在X和Y方向（C）吸管尖云母和蔓延。使样品在云母表面孵育至少10分钟后，冲洗样品在蒸馏水流。如果固定工作，你将能够看到一个不透明的点上的云母，在右侧面板（D）所示。如果固定没有工作，你会得到明确的云母片，在左侧面板。云母鳞片白斑液滴的细菌浓度，明胶处理的云母。

图2 E 的 AFM图像。 大肠杆菌 。面板（A），细胞安装在明胶包云母和0.005 M PBS成像。为了便于比较，明胶包覆云母和安装在空气中成像的细菌细胞的图像显示面板（B）。虽然隔的液体，更高的分辨率菌毛（插图面板（二））表示，在采集到的图像中清楚可见，可在空气中获得。

Discussion

许多因素可能会影响微生物细胞固定的原子力显微镜和成像。明胶，用于涂料，云母是重要的。商业明胶是孤立的，从脊椎动物，包括鱼，牛，猪的数量。的起源和处理方法，确定为细菌固定化明胶的适用性。许多来源和类型的明胶固定细菌的有效性进行评估[1]。两个最有效的明胶被发现SIGMA的G - 6144和G - 2625。从猪（猪），这些明胶被认为是低布鲁姆和中等布鲁姆分别。明胶处理过的基材和特定菌株的细菌进行研究之间的兼容性测试，这是非常重要的。更重要的是，派生明胶牛（牛）并没有被有效地固定的测试任何细菌。涉及细胞固定化的一个简单的测试，使样品与水或缓冲液（4.6步）后冲洗，干燥后的云母。如果细菌固定化，阴天面积将观察（图1D）。如果表面不混浊，冲洗水的流已经清除细菌。执行此测试时，用户应谨慎的添加剂，如盐，也可能导致一个阴天的外观效果。

明胶包覆云母固定技术已成功应用于革兰氏阴性和革兰氏阳性菌（1），（2）细菌原生质球，病毒粒子（3）和硅藻壳（4）。用明胶固定化细胞分散在基板上，要采取个别细菌的图像允许的优势。同样的方法，确保足够数量的细胞在各个领域，从而降低细胞搜索花费的时间。该技术也被用于收集测力都大肠杆菌细胞表面大肠杆菌 （5）和绿脓杆菌 （6）。不同的菌株的特点，可以影响固定。例如，而野生型大肠杆菌稳定固定在液体中使用涂有明胶的G - 6144，外膜脂蛋白缺乏应变基板，大肠杆菌 （DH5α），NlpI并没有固定好，而不是要求高布鲁姆明胶（Sigma公司的G - 2500） 。

细菌的解决方案的内容，也可以影响细胞固定化。生长介质，某些缓冲区，和盐，可能会干扰细菌具有约束力（竞争与明胶表面的细菌）和将要进行测试。最终，成功地在原子力显微镜液体成像细菌依赖于优化固定化细胞数量，选择最佳的云母表面，在液体介质中的成像与你设计的实验兼容应用细菌液体。例如，稀缓冲区已成功用于大肠杆菌大肠杆菌明胶包覆云母固定在0.01M磷酸盐缓冲液（PBS），漂洗，去除松散结合的细胞具有相同的缓冲区，并随后在0.005M PBS（图2）成像。对于细胞渗透敏感，蔗糖，高达0.25米，已成功地用于安装和成像细菌[2-6]。成像模式，试图在液体中的形象弱约束的细菌时，应考虑的另一个因素。接触模式成像技术可以取代松散结合的细菌。非接触式成像模式，轻敲模式和MAC模式，减少探头尖端施加的侧向力，因此可能是首选。

另外，使用低弹簧常数的悬臂和力量最大限度地减少在接触模式下，也可能有助于形象松散结合的细菌。

生活在液体中的细菌样本的成像提供了机会，没有干燥的损害效果的细胞表面的代表图像。可以收集一个活细胞的表面特征，高度，和刚性，更准确地计量。喜欢时尚，特异性探针分子附着在悬臂可用于识别相互作用，地图上的位置，细胞表面上的具体目标和措施结合力[7]。固定化细菌在液体环境，便利的生活细菌细胞的动态研究。这可能包括细菌的生长和分裂，成像介质，加入分子种类和不断变化的环境温度或压力等物理性质，化学性质的影响研究。总体而言，研究在液体中的细菌，在高解析度的选项，燃料的想象与未来研究的可能性。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gelatin	Sigma-Aldrich	G6144, G2625 or G2500
PicoPlus Atomic Force Microscope	Agilent Technologies
AFM cantilevers	Veeco Instruments, Inc.	MLCT-AUHW