Summary
Live-Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën kunnen worden geïmmobiliseerd op gelatine gecoate mica en beeld gebracht in een vloeistof met behulp van Atomic Force Microscopy (AFM).
Abstract
AFM is een hoge resolutie (nm schaal) imaging tool die mechanisch sondes een oppervlak. Het heeft de mogelijkheid om beeld cellen en biomoleculen, in een vloeibare omgeving, zonder de noodzaak om chemisch te behandelen van het monster. Om dit doel te bereiken, moet het monster voldoende houden aan de montage-oppervlak om de verwijdering te voorkomen door krachten uitgeoefend door de AFM te scannen cantilever tip. In veel gevallen succesvol beeldvorming hangt af van immobilisatie van het monster op de montage-oppervlak. Optimaal dienen immobilisatie worden minimaal invasieve aan het monster zodanig dat metabolische processen en functionele kenmerken niet in het gedrang komen. Door het bekleden van vers geknipt mica oppervlakken met varkens (varkens) gelatine, kan negatief geladen bacteriën worden geïmmobiliseerd op het oppervlak en afgebeeld in vloeibare door de AFM. Immobilisatie van bacteriële cellen op gelatine gecoate mica is het meest waarschijnlijk te wijten aan elektrostatische interactie tussen de negatief geladen bacteriën en de positief geladen gelatine. Verschillende factoren kunnen interfereren met bacteriële immobilisatie, inclusief de chemische bestanddelen van de vloeistof waarin de bacteriën zijn opgehangen, de incubatietijd van de bacterie op de gelatine gecoate mica, oppervlakte-eigenschappen van de bacteriële stam en het medium waarin de bacteriën worden afgebeeld. Over het algemeen is het gebruik van gelatine-gecoate mica vinden over het algemeen van toepassing voor de beeldvorming microbiële cellen.
Protocol
1. Mica voorbereiding:
- Snijd de mica (Electron Microscopy Wetenschappen) met een schaar aan de afmetingen die nodig zijn om de AFM microscoop (ca. 22 x 30 mm) passen.
- Klieven van de mica aan beide zijden, over het algemeen met behulp van tape om de buitenste laag te verwijderen, totdat alleen glad ononderbroken lagen blijven.
2. Voorbereiding van de gelatine-oplossing:
- Voeg 100 ml gedestilleerd water tot een laboratorium fles.
- Verwarm de fles in een magnetron totdat het water begint te koken. (Als een magnetron niet beschikbaar is, kan het water worden verwarmd in een bekerglas op een hete plaat.)
- Weeg 0,5 g van de gelatine (Sigma G-6144, G-2625 of G-2500) en toevoegen aan het warm gedestilleerd water.
- Zwenk de fles tot de gelatine volledig is opgelost.
- Koel de gelatine oplossing voor 60-70 ° C.
- Giet ongeveer 15 mL in een klein bekerglas (20 ml), waarin de snede gesplitst mica kan worden gedompeld.
3. Mica coating:
- Dompel de mica pleinen in de verwarmde gelatine-oplossing en trekt al snel zodanig dat de mica bedekt is (figuur 1a).
- Na het coaten, onmiddellijk ondersteunen de mica, aan de rand, op een papieren handdoek om te drogen in de lucht (afb. 1b). De gelatine gecoate mica gebruikt kan worden voor minimaal 2 weken. De overtollige gelatine oplossing kan de koelkast worden bewaard en gebruikt worden voor ongeveer een maand door simpelweg verwarmen de voorraad oplossing om tussen de 60-70 ° C. Zorg moeten worden genomen om ervoor te zorgen dat de gelatine niet gekookt is tijdens het opwarmen.
4. Montage bacteriën op gelatine gecoate mica:
- Pellet 1 mL van een bacteriecultuur (0,5 tot 1,0 OD bij 600 nm) bij 800 tot 4.500 RCF. Afhankelijk van de bacteriën, gebruik dan de minimum RCF die pellet van de cellen in ~ 5 minuten.
- Was de pellet in dezelfde hoeveelheid gefilterd gedeïoniseerd water of buffer.
- Opnieuw het verzamelen van de cellen door centrifugeren.
- Prompt Resuspendeer de pellet in 500 ui van nanopure gedeïoniseerd water of buffer. (De bacteriële suspensie moet zichtbaar worden troebel in om een voldoende concentratie van cellen voor AFM beeldvorming hebben.)
- Breng de celsuspensie (10-20 pi) om de gelatine-gecoate mica en verspreid over het oppervlak met behulp van een pipet tip (afb. 1c). Zorg moet worden genomen om niet fysiek de gelatine oppervlak contact met de pipetpunt tijdens het aanbrengen of verspreiden van de bacteriële oplossing.
- Laat het oppervlak rusten voor 10 minuten en met een stroom van water of buffer (Fig 1 cd) spoelen. Tijdens de gehele procedure, zorg om ervoor te zorgen dat het monster niet is toegestaan om te drogen.
5. Representatieve resultaten:
Figuur 2 toont bijvoorbeeld beelden van bacteriële cellen die zijn gemonteerd op gelatine gecoate mica en afgebeeld door de AFM. In onze laboratoria, worden monsters meestal afgebeeld met behulp van een PicoPlus atomic force microscoop (Agilent Technologies, Temple, AZ), uitgerust met een 100 micrometer scannen hoofd. Het instrument wordt gebruikt op 128-512 pixels per lijn te scannen met een scansnelheid van 0,5-1,0 lijnen / s. De uitkragingen die meestal worden gebruikt zijn Veeco siliciumnitride sondes (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) met een nominale veerconstanten variërend 0,01 tot 0,1 nN / nm.
Figuur 1. Gelatine bij een temperatuur van 60-70 ° C is geplaatst in een 20 ml beker. Met behulp van een pincet vers geknipte mica pleinen zijn volledig ondergedompeld in de gelatine (a) genomen en die rechtop op een papieren handdoek leunend tegen een micro-centrifuge rack (b). Een druppel van bacteriële monster wordt geplaatst op de mica en verspreid dit met een pipet tip in zowel de X-en Y-richting (c). Na aftrek van het monster tot op het mica oppervlak incubeer gedurende minstens 10 minuten, spoel het monster in een stroom van gedistilleerd water. Als de immobilisatie gewerkt zul je in staat zijn om een ondoorzichtige stip te zien op de mica zoals getoond in het rechterpaneel van (d). Als de immobilisatie niet werkt krijgt u een helder stuk mica zoals in het linker paneel. De ondoorzichtige plek op de mica schalen om de concentratie van de bacteriën in de druppel die u op de gelatine behandeld mica.
Figuur 2. AFM beelden van E. coli. In paneel (a), worden de cellen gemonteerd op gelatine gecoate mica en afgebeeld in 0,005 M PBS. Ter vergelijking, is een beeld van de bacteriële cellen gemonteerd op gelatine gecoate mica en afgebeeld in de lucht die in paneel (b). Hoewel septa zijn duidelijk zichtbaar in beeld verzameld in vloeistof, hogere resolutie, zoals aangegeven door de aanwezigheid van pili (inzet paneel (b)), kunnen worden verkregen in de lucht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende factoren kunnen van invloed zijn microbiële cel montage en beeldvorming door de AFM. De gelatine die wordt gebruikt voor het coaten van het mica is belangrijk. Commerciële gelatine is geïsoleerd uit een aantal van de gewervelde dieren waaronder vissen, koeien en varkens. Zowel de oorsprong en de verwerkingsmethode bepalen de gelatine de geschiktheid voor bacteriële immobilisatie. Tal van bronnen en vormen van gelatine werden geëvalueerd op hun effectiviteit in immobiliseren bacteriën [1]. De twee meest effectieve gelatines bleken te zijn Sigma G-6144 en G-2.625. Afgeleid van varkens (varkens), worden deze beschouwd als laag gelatine Bloom en middelgrote Bloom bedragen. Het is belangrijk om te testen op compatibiliteit tussen de gelatine-behandelde substraat en de specifieke stam van bacteriën te bestuderen. Belangrijk is dat gelatine afkomstig van runderen (runderen) is niet effectief in het immobiliseren geen van de geteste bacteriën. Een eenvoudige test voor mobiele immobilisatie bestaat waardoor het monster te drogen op de mica, na het spoelen met water of een buffer (na stap 4.6). Als de bacteriën worden geïmmobiliseerd, zal een bewolkte gebied worden waargenomen (afb. 1d). Als het oppervlak niet bewolkt is, is de stroom van het spoelwater verwijderd van de bacteriën. Bij de uitvoering van deze test dient de gebruiker voorzichtig te zijn van de effecten van additieven, zoals zouten, die ook kan leiden tot een troebel uiterlijk.
De gelatine-gecoate mica immobilisatie techniek met succes is toegepast op de Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën (1), bacteriële spheroplasts (2), virusdeeltjes (3) en diatomeeën schelpen (4). Immobilisatie met gelatine heeft het voordeel van het verspreiden cellen op de ondergrond, die het mogelijk maakt om beelden van een individuele bacterie te worden genomen. Ook de methode zorgt ervoor dat een ruim aantal cellen zijn verkrijgbaar in elk veld, wat de tijd besteedt aan het zoeken voor cellen vermindert. De techniek is ook gebruikt voor het verzamelen van kracht metingen op het celoppervlak van zowel E. coli (5) en Pseudomonas aeruginosa (6). Kenmerken van verschillende bacteriestammen kunnen beïnvloeden immobilisatie. Bijvoorbeeld, terwijl de wild-type van E. coli (DH5a) zijn stabiel geïmmobiliseerd in een vloeistof met behulp van substraten bekleed met gelatine G-6144, een stam die deficiënt is in de buitenste membraan lipoprotein, heeft NlpI niet goed te immobiliseren en in plaats daarvan vereist een hoge Bloom gelatine (Sigma G-2500).
Inhoud van de bacteriële oplossing kan ook van invloed zijn cel immobilisatie. Groeimedia, bepaalde buffers, en zouten kunnen interfereren met bacteriële binding (ze concurreren met de bacteriën van de gelatine oppervlak) en zal moeten worden getest. Uiteindelijk, succesvolle beeldvorming van bacteriën in vloeistof door AFM hangt af van het optimaliseren van de immobilisatie (voor het aantal cellen), het selecteren van de optimale vloeistof voor de toepassing van de bacteriën op de mica oppervlak en beeldvorming in een vloeibaar medium compatibel is met uw ontworpen experiment. Zo heeft een verdunde buffer met succes gebruikt waar E. coli werd geïmmobiliseerd op gelatine gecoate mica in 0,01 M fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), gespoeld met dezelfde buffer te losjes gebonden cellen te verwijderen, en vervolgens afgebeeld in 0.005M PBS (afb. 2). Voor cellen die zich osmotisch gevoelig, sucrose, tot 0,25 M, is met succes gebruikt voor de montage en imaging bacteriën [2-6]. De imaging-modus is een andere factor die moet worden overwogen wanneer het proberen om de afbeelding te zwak gebonden bacteriën in vloeistoffen. Contact mode beeldvorming kan verdringen losjes gebonden bacteriën. De contactloze imaging modes, tapping mode en MAC-modus, vermindering van de laterale krachten uitgeoefend door de sonde en daarom kan de voorkeur.
Als alternatief kan met behulp van cantilevers met lage veerconstanten en het minimaliseren van kracht in contact mode ook helpen om de afbeelding te losjes gebonden bacteriën.
Imaging wonen bacteriële monsters in vloeibare biedt de mogelijkheid om representatief beeld van het celoppervlak te krijgen zonder afbreuk te doen aan de gevolgen van het drogen. Nauwkeurige metingen van oppervlakte-eigenschappen, hoogte en stijfheid van een levende cel kunnen worden verzameld. Op dezelfde manier, specifieke probe-moleculen aan de cantilever kan worden gebruikt om interacties, kaart locatie, te identificeren en bindende krachten te meten op specifieke doelen op het celoppervlak [7]. Immobilisatie van bacteriën in een vloeistof omgeving vergemakkelijkt dynamische studies van levende bacteriële cellen. Dit kan onder meer studies van bacteriële groei en deling, het effect van de toevoeging van moleculaire species aan de beeldvorming medium, en het veranderen van fysische eigenschappen van de omgeving, zoals temperatuur of druk. Het algemeen, met de optie om bacteriën te bestuderen in vloeistoffen, met een hoge resolutie, brandstoffen de verbeelding met de toekomstige mogelijkheden voor onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit onderzoek wordt gesponsord door het Bureau van biologische en milieu-onderzoek, het Amerikaanse ministerie van Energie en door subsidies van de Virginia Commonwealth's Health Research Board. Oak Ridge National Laboratory wordt beheerd door UT-Battelle, LLC, voor het Amerikaanse ministerie van Energie onder contract nummer DE-AC05-00OR22725.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
