Summary
住んでいるグラム陰性およびグラム陽性細菌は、ゼラチンコートしたマイカ上に固定し、原子間力顕微鏡（AFM）を用いて液体中に撮像することができます。
Abstract
AFMは、イメージングツールを機械的プローブ表面の高分解能（ナノスケール）です。それは化学的にサンプルを治療することなく、液体環境では、画像セルと生体分子への能力を持っています。この目標を達成するために、サンプルが十分にスキャンAFMのカンチレバーの先端によって加えられる力によって除去を防ぐために、取り付け面に付着する必要があります。多くの例では、成功した画像は、取付面へのサンプルの固定化に依存します。最適に、固定化は、代謝プロセスと機能的な属性が損なわれないように、サンプルへの低侵襲である必要があります。ブタ（豚）、ゼラチンでコーティングしたばかりの劈開マイカの表面によって、負に帯電した細菌が表面に固定化することができるとAFMによる液中に撮像。ゼラチン被覆マイカ上の細菌の細胞の固定化は、負に帯電した細菌と正に帯電したゼラチンの間の静電相互作用に起因する可能性が最も高いです。いくつかの要因は、細菌が中断されている液体の化学成分、ゼラチンコートされたマイカ上の細菌の培養時間、菌株や菌がイメージングされる媒体の表面特性を含む細菌の固定化、妨げになることがあります。全体的に、ゼラチンコートされたマイカの使用は、イメージングの微生物細胞のための一般的に適用可能であることが判明した。
Protocol
1。マイカの準備：
- AFM顕微鏡（約22 × 30 mm）を合わせて必要なサイズにハサミでマイカを（電子顕微鏡の科学）カット。
- 唯一の滑らかな連続した層が残るまで、外側の層を除去するためにテープを使用して、一般的に開裂し、両側のマイカ、。
2。ゼラチン溶液の調製：
- 実験室の瓶に100mlの蒸留水を追加。
- 水が沸騰し始めるまで電子レンジでボトルを加熱する。 （電子レンジが使用できない場合は、水をホットプレート上でビーカーで加熱することができます。）
- ゼラチン0.5グラム（シグマG - 6144、G - 2625またはG - 2500）を秤量し、熱い蒸留水に加える。
- ゆっくりとゼラチンになるまで渦巻き瓶が完全に溶解されています。
- 60から70℃にゼラチン溶液を冷却
- カット切断されたマイカを浸漬することが可能な小型のビーカー（20ml）に約15 mLを注ぐ。
3。マイカ塗装：
- 温めたゼラチン溶液に浸すマイカの正方形をしてマイカが（図1a）コーティングであることがすぐにそのような撤回。
- コーティング後は、（図1b）周囲の空気中で乾燥するためにペーパータオルで、エッジで、すぐにマイカをサポートしています。ゼラチン被覆マイカは、少なくとも2週間に使用することができます。過剰ゼラチン溶液は冷蔵保管し、単純に60から70℃の間にストック溶液を加熱によって約ヶ月間使用できます。ケアは、ゼラチンが再加熱時に沸騰されないように注意する必要があります。
4。ゼラチンコートされたマイカの取り付け細菌：
- 800〜4500 rcfで - 細菌培養物のペレットを1 mLの（600nmで1.0 OD 0.5）。細菌によっては、最小のRCFを使用しているペレットは〜5分で細胞なります。
- フィルタ処理された脱イオン水または緩衝液の同量でペレットを洗浄します。
- 遠心分離によって再び細胞を回収。
- nanopure脱イオン水または緩衝液の500μLで速やかにペレットを再懸濁する。 （細菌懸濁液が目に見えてAFMイメージングのための細胞の適切な濃度を得るために濁ってしてください。）
- ピペットチップ（図1c）を使用して表面にゼラチン被覆マイカと拡散して細胞懸濁液（10〜20μL）を適用します。ケアは、菌液を適用したり、拡散しながら物理的にピペットの先端をゼラチン表面に触れないように注意してください。
- 表面は10分間休ませ、水または緩衝液（図1 CD）のストリームでリンスすることができます。手順では、サンプルが乾燥して許可されていないことを保証するように注意してください。
5。代表的な結果：
図2は、ゼラチン被覆マイカ上でマウントされており、AFMによって画像化された細菌細胞の例の画像を示す。我々の研究室では、サンプルは一般的に100μmの走査ヘッドを装備したPicoPlus原子間力顕微鏡を（アジレントテクノロジー、寺院、アリゾナ州）を用いて撮像される。楽器は、0.5から1.0行/秒の走査速度でラインスキャン当たり128から512ピクセルで運営されています一般的に使用されるカンチレバーは、0.01〜0.1 NN / nmの範囲の公称ばね定数とVeeco社の窒化シリコンプローブ（MLCT - AUHW、Veeco社、サンタバーバラ、カリフォルニア州）です。
図1。60〜70 ° C、20 mlのビーカーに入れているの温度でゼラチン。ピンセットを使用すると、新鮮な劈開マイカの正方形は、完全にマイクロ遠心ラック（B）にもたれてペーパータオルの上に直立撤回し、配置された（）ゼラチン中に浸漬されています。細菌サンプルの液滴は、XとY方向（c）の両方のピペットチップマイカと拡散に配置されます。サンプルは、少なくとも10分間雲母表面にインキュベートさせた後、蒸留水の流れでサンプルをすすいでください。固定化がうまくいったら（d）の右パネルに示すように雲母に不透明な点を見ることができます。固定化が成功しなかった場合には、左側のパネルのように雲母の明確な部分を取得します。ゼラチン扱わマイカ上に置かれた液滴の細菌の濃度にマイカスケール上の不透明なスポット。
E.の図2。AFM像大腸菌 。パネル（）で、細胞をゼラチンコートしたマイカ上にマウントされ、0.005 M PBSで画像化。比較のために、ゼラチンコートされたマイカ上に実装し、空中で結像される細菌細胞の画像は、パネル（b）に示されています。セプタムは、液体中に収集された画像ではっきりと表示されますが、のような毛の存在（挿入図（b））で示される以上の解像度は、、空気中で得ることができます。
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Discussion
様々な要因がAFMによる微生物取付けセルおよびイメージングに影響を与える可能性があります。コーティングのために使用されるゼラチンは、雲母が重要です。商業用ゼラチンは、魚、牛、そして豚を含む脊椎動物の数から絶縁されています。起源と処理方法はどちらも細菌の固定化のためのゼラチンの適合性を決定する。多数の情報源とゼラチンのタイプは固定細菌で、その有効性を評価した[1]。二つの最も効果的なゼラチンは、Sigma G - 6144とG - 2625であることがわかった。豚（ブタ）に由来する、これらのゼラチンは、それぞれ、低ブルームと培地のブルームとみなされます。ゼラチン処理基板と研究する細菌の特定の菌株との互換性をテストすることが重要です。重要なのは、牛（ウシ）に由来するゼラチンは、テストされた細菌のいずれかを固定化するのに有効ではなかった。細胞の固定化のための簡単なテストでは、試料が水または緩衝液（ステップ4.6の後）で洗浄した後、雲母に乾燥させることが含まれます。細菌が固定化されている場合、曇りの領域が（図1D）が観察されます。表面が曇っていない場合は、すすぎ水の流れは、細菌を除去しています。このテストを実行するとき、ユーザーはまた、曇りの外観につながることができるような塩のような添加剤、、の効果を慎重にする必要があります。
ゼラチンコートされたマイカの固定化技術が正常にグラム陰性およびグラム陽性菌（1）、細菌のスフェロプラスト（2）、ウイルス粒子（3）と珪藻殻（4）に適用されています。ゼラチンと固定化が取られる個々の細菌の画像を可能にする基板上に細胞を分散できるという利点があります。また、方法は、細胞の検索にかかる時間が短縮さ、細胞の十分な数が各フィールドで利用できることを保証します。技術はまた、E.、両方の細胞表面上の力の測定値の収集に使用されています大腸菌 （5）および緑膿菌 （6）。異なる菌株の特徴は、固定化に影響を与える可能性があります。例えば、E.の野生型に対し大腸菌 （DH5α）を安定的にゼラチンG - 6144、外膜リポ蛋白質の欠損株でコーティング液を使用して基板に固定化され、NlpIはよく固定化し、代わりに高ブルームゼラチン（シグマG - 2500）は必要ありませんでした。
菌液の内容はまた、細胞の固定化に影響を与える可能性があります。増殖培地、特定のバッファ、およびそれらの塩は、細菌の結合を妨げる可能性があります（彼らはゼラチン表面の細菌との競合）してテストする必要があります。最終的には、AFMによる液中の細菌の成功イメージングは、あなたの計画実験と互換性のある液体培地で雲母表面とイメージングへの細菌を適用するための最適な液体を選択し、固定化を（細胞数）の最適化に依存します。ここで、E.例えば、希釈バッファが正常に使用されています大腸菌は、0.01Mリン酸ゼラチン被覆マイカ上に固定化された緩衝食塩水（PBS）、緩く結合した細胞を除去するために同じ緩衝液でリンスし、そしてその後0.005M PBS（図2）で画像化。浸透圧に敏感な、最高0.25 Mのショ糖、、[2-6]をマウントし、イメージングの細菌のために正常に使用されているかのセルの。撮影モードは、液体で画像弱く結合細菌しようとするときに考慮すべきもう一つの要因である。接触モードのイメージングには、緩く結合した細菌を置き換えることができます。非接触イメージングモード、タッピングモードとMACモードは、プローブの先端によって加えられる横方向の力を減らすため、好ましいことがある。
また、コンタクトモードでの低ばね定数と最小限の力でカンチレバーを使用しても画像緩く結合した細菌に役立つことがあります。
液体で細菌サンプルを生きているイメージングは、乾燥の犠牲に影響することなく細胞表面の代表的な画像を得る機会を提供しています。生きている細胞の表面特性、高さ、そして剛性の正確な対策を収集することができます。のようなファッションで、カンチレバーに接続された特定のプローブ分子が相互作用を識別するために使用できる、マップの位置、および細胞表面上の特定のターゲットに[7]を結合力を測定する。液体環境における細菌の固定化は、生きた細菌細胞の動的スタディを容易にします。これは、細菌の増殖と分裂、イメージング培地に分子種を追加し、温度や圧力などの環境の物理的特性を変更した場合の影響の研究が含まれている場合があります。全体的に、今後の研究の可能性を持つ高解像度で、液体中の細菌を研究するためのオプションを持って、燃料の想像力。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、生物環境研究局、米国エネルギー省のとバージニア州の連邦保健研究委員会からの助成金によって後援される。オークリッジ国立研究所は、契約番号DE - AC05 - 00OR22725下で米国エネルギー省のためにUT - Battelle氏、LLCによって管理されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
References
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