Summary
Живая грамотрицательных и грамположительных бактерий, может быть иммобилизованным на желатин покрытием слюда и отображается в жидкости с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ).
Abstract
АСМ с высоким разрешением (нм масштабе) изображения инструментом, который механически зондов поверхность. Она имеет способность изображения клеток и биомолекул, в жидкой среде, без необходимости обращаться к химически образца. Для достижения этой цели, образец должен достаточно придерживаться монтажной поверхности, чтобы предотвратить удаление силами со стороны кантилевера сканирования АСМ. Во многих случаях успешное изображения зависит от иммобилизации образца к монтажной поверхности. Оптимально, иммобилизация должна быть минимально инвазивной к образцу, что обменные процессы и функциональные атрибуты не нарушена. Покрывая свежесколотой слюды поверхности свиньи (свинья) желатина, отрицательно заряженные бактерии могут быть иммобилизованных на поверхности и отображается в жидкости с помощью АСМ. Иммобилизация клеток бактерий на желатин покрытием слюда, скорее всего, из-за электростатического взаимодействия между отрицательно заряженными бактериями и положительно заряженные желатин. Ряд факторов может повлиять на бактериальную иммобилизации, в том числе химических составляющих жидкость, в которой бактерии приостановлено, времени инкубации бактерий на желатин покрытые слюдой, поверхностные характеристики бактериального штамма и среды, в которой бактерии образ. В целом, использование желатина покрытые слюдой оказывается вообще применимо для клеток изображений микроорганизмов.
Protocol
1. Слюда подготовки:
- Вырезать слюды (наук Электронная микроскопия) с ножницами, чтобы размер необходимых, чтобы соответствовать микроскоп AFM (около 22 × 30 мм).
- Клив слюды с обеих сторон, как правило, с помощью липкой ленты для удаления наружного слоя, пока только гладкой непрерывной слои остаются.
2. Подготовка раствора желатина:
- Добавить 100 мл дистиллированной воды в лабораторию бутылку.
- Тепло бутылку в микроволновой печи, пока вода не закипит. (Если микроволновая печь не доступен, воду можно нагревать в химическом стакане на горячей плите.)
- Взвесьте из 0,5 г желатина (Sigma G-6144, G-2625 или G-2500) и добавить в горячей дистиллированной воде.
- Аккуратно водоворот бутылка пока желатин полностью не растворится.
- Охладите раствор желатина до 60-70 ° С.
- Налейте примерно 15 мл в небольшой стакан (20 мл), в которую сократить расщепляется слюды может быть ближнего.
3. Слюда покрытия:
- Погрузите слюды квадратов на нагревали раствор желатина и снимать быстро, что слюда покрытием (рис. 1а).
- После нанесения покрытия, поддержка слюды сразу же, на краю, на бумажное полотенце, чтобы сухой в атмосферном воздухе (рис. 1б). Желатин покрытые слюдой могут быть использованы, по крайней мере 2 недели. Избыток раствора желатина можно хранить в холодильнике и использовать в течение примерно месяца просто нагревательных маточного раствора в пределах от 60-70 ° C. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы желатин не кипяченой во нагревательных.
4. Монтаж бактерий на желатин покрытые слюдой:
- Гранул 1 мл бактериальной культуры (0,5 - 1,0 ОП при 600 нм) при 800 до 4500 RCF. В зависимости от бактерий, использовать минимальное RCF, что будет гранул клеток в ~ 5 минут.
- Вымойте гранул в том же объеме с фильтром деионизированной водой или буфером.
- Сбор клетки снова с помощью центрифугирования.
- Ресуспендируют гранулы быстро в 500 мкл NanoPure деионизированной водой или буфером. (Бактериальной суспензии должны быть визуально мутными, чтобы иметь адекватные концентрации клеток для АСМ-изображений.)
- Применение клеточной суспензии (10-20 мкл) в желатин покрытием слюда и выкладывают на поверхность с помощью пипетки (рис. 1в). Следует проявлять осторожность, чтобы не физически коснуться желатин поверхность с кончика пипетки при применении или распространение бактериальной решение.
- Разрешить поверхности, чтобы отдохнуть в течение 10 минут и смыть струей воды или буфера (рис. 1 кд). На протяжении процедуры, принять меры к тому, что образец не может высохнуть.
5. Представитель Результаты:
На рисунке 2 показан пример изображения бактериальной клетки, которые были установлены на желатин покрытием слюда и изображено АСМ. В наших лабораториях образцы, как правило, отображаемого использованием PicoPlus атомно-силового микроскопа (Agilent Technologies, Храм, AZ) оснащен 100 голов сканирования мкм. Прибор работает при 128-512 пикселов на линии сканирования при сканировании скорость 0,5-1,0 строк / сек Консолей, которые обычно используются в Veeco нитрида кремния зондов (MLCT-AUHW, Veeco в Санта-Барбаре, Калифорния) с номинальным константы весной в диапазоне от 0,01 до 0,1 нН / нм.
Рисунок 1. Желатин при температуре 60-70 ° С находится в 20 мл стакан. Использование пинцета свежесколотой слюды квадратов полностью погружены в желатин () изъяты и помещены в вертикальном положении на бумажное полотенце, прислонившись к стойке микро центрифуги (б). Капли бактериального образец помещается на слюде и распространяются с наконечником пипетки в обоих направлениях х и у (с). После учета образец для инкубации на поверхности слюды, по крайней мере, 10 минут, смойте образца в потоке дистиллированной воды. Если иммобилизация работали, вы сможете увидеть непрозрачные пятна на слюду, как показано на правой панели (г). Если иммобилизация не работали, вы получите ясный кусок слюды, как в левой панели. Непрозрачная точка на весы слюды, чтобы концентрация бактерий в капле которые вы размещаете на желатин лечение слюды.
Рисунок 2. АСМ изображения E. палочки. В панель (а), клетки расположены на желатин покрытием слюда и отображается в 0,005 М PBS. Для сравнения, образ бактериальных клетках установлены на желатин покрытием слюда и отображается в воздухе показано на графике (б). Хотя перегородками отчетливо видны на изображении, собранных в жидкости, более высокое разрешение, о чем свидетельствует наличие пили (вставка панели (б)), могут быть получены в воздухе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Различные факторы могут повлиять на микробную клетку монтажа и обработки изображений с помощью АСМ. Желатин, который используется для покрытия слюды очень важно. Коммерческая желатин изолирован от числа позвоночных, включая рыб, коров и свиней. Оба происхождения и способа обработки определить, подходит ли желатин для бактериальных иммобилизации. Многочисленные источники и виды желатина были оценены на предмет их эффективности в иммобилизации бактерий [1]. Два наиболее эффективным желатин оказались Sigma G-6144 и G-2625. Производные от свиней (свиньи), эти желатин считается низким и средним Блум Блум, соответственно. Важно, чтобы проверить на совместимость между желатин обработанные подложки и конкретного штамма бактерий, которые предстоит изучить. Важно отметить, что желатин производным от крупного рогатого скота (крупный рогатый скот) не была эффективной в иммобилизации любой из протестированных бактерий. Простой тест для сотовых иммобилизации включает позволяет образец для просушки на слюду, после промывки водой или буфер (после шага 4.6). Если бактерии иммобилизованные, облачно области будет наблюдаться (рис. 1г). Если поверхность не облачно, поток воды для ополаскивания снял бактерий. При выполнении этого теста, пользователь должен быть осторожным эффекты добавки, такие как соли, что также может привести к облачной вид.
Желатин покрытием слюда иммобилизации методика успешно применяется для грамотрицательных и грамположительных бактерий (1), бактериальные сферопластов (2), вирусные частицы (3) и диатомовых оболочек (4). Иммобилизация с желатином имеет то преимущество, диспергирования клеток на подложке, что позволяет для изображений отдельных бактерии должны быть приняты. Кроме того, метод гарантирует, что достаточное количество клеток имеются в каждой области, что сокращает время, затрачиваемое на поиск клеток. Техника была также использована для сбора силу измерений на поверхности клеток, так E. палочки (5) и синегнойной палочки (6). Характеристики различных штаммов бактерий могут повлиять иммобилизации. Например, в то время как дикого типа Е. палочка (DH5α) стабильно иммобилизованных в жидкости, используя подложки покрыта желатином G-6144, штамм дефицит внешней липопротеинов мембраны, NlpI не обездвижить хорошо, а вместо этого требуется высокая Блум желатин (Sigma G-2500).
Содержание бактериальных решение может также повлиять на ячейку иммобилизации. Рост средств массовой информации, определенные буферы и соли может помешать бактериальной связи (они конкурируют с бактериями для желатина поверхности) и должны быть проверены. В конечном счете, успешное изображений бактерий в жидкости с помощью АСМ зависит от оптимизации иммобилизации (для числа клеток), выбора оптимального жидкость для применения бактерий к поверхности слюды и изображений в жидкой среде, совместима с вашей разработан эксперимент. Например, разбавленным буфером успешно используются там, где Е. палочки иммобилизованных на желатин покрытием слюды в 0,01 М фосфатным буферным раствором (PBS), промывают и тот же буфер, чтобы удалить слабо связанных клеток, а затем отображается в 0,005 PBS (рис. 2). Для ячеек, которые осмотически чувствительный, сахароза, до 0,25 М, успешно используется для монтажа и обработки изображений бактерий [2-6]. Режим изображений является еще одним фактором, который следует учитывать при попытке изображение слабо связанных бактерий в жидкости. Контакт режим визуализации может сместить слабосвязанных бактерий. Бесконтактного режима получения изображения, нажатие режим и MAC режим, уменьшить боковые силы со стороны зонда и, следовательно, может быть предпочтительнее.
Кроме того, использование консолей с низкой постоянной весны и минимизации силы в контактном режиме может также помочь изображение слабосвязанных бактерий.
Изображениями живой бактериальной образцов в жидком предлагает возможность получить представитель изображения поверхности клеток без ущерба для последствий высыхания. Точная меры характеристики поверхности, высота и жесткость живой клетки могут быть собраны. Подобным же образом, специфические молекулы зонда прикреплен к консольной может быть использован для идентификации взаимодействий, схема проезда, и измерять силы связи для конкретных целей на поверхности клеток [7]. Иммобилизация бактерий в жидкой среде облегчает динамическое изучении живых бактериальных клеток. Это может включать изучение бактериального роста и деления, эффект от добавления молекулярной видов изображений среды, и изменение физических свойств среды, таких как температура или давление. В целом, имея возможность изучить бактерии в жидкостях, с высоким разрешением, топлива воображение будущих возможностей исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование проводится при финансовой поддержке Управления биологических и экологических исследований, Министерство энергетики США и при поддержке гранта финансирование из Содружества совета исследованиям в области здравоохранения штата Вирджиния. Oak Ridge National Laboratory управляет УТ-Battelle, LLC для Министерства энергетики США по контракту № DE-AC05-00OR22725.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
