Summary
Viven las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas pueden ser inmovilizadas en gelatina mica recubierta y la imagen en el líquido utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM).
Abstract
AFM es una de alta resolución (escala nm) herramienta de imagen que las sondas de una superficie mecánicamente. Tiene la capacidad de las células de la imagen y las biomoléculas, en un medio líquido, sin la necesidad de tratar químicamente la muestra. Con el fin de lograr este objetivo, la muestra suficientemente que se adhieren a la superficie de montaje para evitar la extracción de las fuerzas ejercidas por su punta de exploración AFM. En muchos casos, las imágenes éxito depende de la inmovilización de la muestra a la superficie de montaje. De manera óptima, la inmovilización debe ser mínimamente invasiva para la muestra de tal manera que los procesos metabólicos y los atributos funcionales que no están comprometidos. Por el recubrimiento de superficies mica recién abierto, con porcino (cerdo) de gelatina, las bacterias cargadas negativamente pueden ser inmovilizadas en la superficie y la imagen en un líquido por AFM. La inmovilización de las células bacterianas en gelatina mica recubierta es más probable debido a la interacción electrostática entre las bacterias cargadas negativamente y la gelatina con carga positiva. Hay varios factores que pueden interferir con la inmovilización de bacterias, incluyendo los componentes químicos del líquido en el que las bacterias de suspensión, el tiempo de incubación de la bacteria en las características de gelatina mica recubierta de superficie, de la cepa bacteriana y el medio en el que las bacterias son expuestas. En general, el uso de la mica recubierta de gelatina resulta ser de aplicación general para las células microbianas de imágenes.
Protocol
1. Mica de preparación:
- Cortar la mica (Microscopía Electrónica de Ciencias) con unas tijeras al tamaño necesario para ajustarse al microscopio AFM (aprox. 22 x 30 mm).
- Cleave la mica de ambas partes, generalmente por medio de cinta para quitar la capa externa, hasta que sólo quedan las capas continua suave.
2. Preparación de la solución de gelatina:
- Añadir 100 ml de agua destilada a una botella de laboratorio.
- Calentar el biberón en el microondas hasta que el agua comience a hervir. (Si el microondas no está disponible, el agua se puede calentar en un vaso sobre un plato caliente.)
- Pesar 0,5 gramos de la gelatina (Sigma G-6144, G 2625-G o 2500) y añadir el agua destilada caliente.
- Haga girar suavemente la botella hasta que la gelatina se disuelva por completo.
- Enfriar la solución de gelatina a 60-70 º C.
- Vierta aproximadamente 15 ml en un vaso pequeño (20 ml) en el que se puede cortar la mica escindida de cruce.
3. Mica de recubrimiento:
- Sumerja las plazas mica en la solución de gelatina caliente y retirar rápidamente de tal manera que la mica está cubierta (Fig. 1a).
- Después del recubrimiento, el apoyo a la mica de inmediato, en la orilla, sobre una toalla de papel para secarse en el aire ambiente (fig. 1b). La mica recubierta de gelatina se puede utilizar por lo menos 2 semanas. El exceso de solución de gelatina se puede mantener refrigerada y usada por aproximadamente un mes, simplemente calentar la solución de reserva de entre 60-70 º C. Se debe tener cuidado para asegurar que la gelatina no se hierve durante el recalentamiento.
4. Montaje de las bacterias en la mica recubierta de gelatina:
- Pellet 1 ml de un cultivo bacteriano (0,5 a 1,0 DO a 600 nm) de 800 a 4500 fcr. Dependiendo de la bacteria, el uso de la RCF mínimo que se sedimenten las células de ~ 5 minutos.
- Lavar el sedimento en el mismo volumen de agua filtrada desionizada o tampón.
- Recoger las células de nuevo por centrifugación.
- Resuspender el precipitado con prontitud en 500 L de agua desionizada o tampón Nanopure. (La suspensión bacteriana deberá presentar una apariencia turbia con el fin de tener una concentración adecuada de las células de AFM de imágenes.)
- Solicitar la suspensión de células (10-20 l) de la mica recubiertos de gelatina y se extendió sobre la superficie con una punta de la pipeta (Fig. 1c). Se debe tener cuidado de no contacto físico con la superficie de la gelatina con la punta de la pipeta, mientras que la aplicación o la difusión de la solución bacteriana.
- Permita que la superficie en reposo durante 10 minutos y enjuagar con un chorro de agua o tampón (Fig. 1 cd). A lo largo del procedimiento, tener cuidado de asegurarse que la muestra no se deja secar.
5. Los resultados representativos:
La figura 2 muestra imágenes de ejemplo de las células bacterianas que se han montado en gelatina mica recubierta y fotografiada por la AFM. En nuestros laboratorios, las muestras suelen ser fotografiado usando un microscopio de fuerza atómica PicoPlus (Agilent Technologies, Temple, AZ) equipado con un cabezal de escaneado 100 micras. El instrumento es operado a 128-512 píxeles por línea de exploración a una velocidad de escaneo de líneas de 0,5-1,0 / s. Los voladizos que se suelen utilizar son Veeco sondas de nitruro de silicio (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) con las constantes de la primavera nominales que van desde 0,01 hasta 0,1 nN / nm.
Figura 1. Gelatina a una temperatura de 60-70 º C se coloca en un vaso de precipitados de 20 ml. Con un par de pinzas recién cortado plazas mica están totalmente inmersos en la gelatina (a) ha retirado y colocado en posición vertical sobre una toalla de papel apoyado en un bastidor de microcentrífuga (b). Una gota de la muestra bacteriana se coloca en la mica y se extendió con una punta de pipeta, tanto en el X e Y (c). Después de permitir que la muestra se incuba en la superficie de la mica por lo menos durante 10 minutos, enjuague la muestra en una corriente de agua destilada. Si la inmovilización trabajado usted podrá ver una mancha opaca en la mica, como se muestra en el panel de la derecha de (d). Si la inmovilización no funcionó obtendrá un pedazo de mica clara como en el panel de la izquierda. La mancha opaca en las escalas de mica a la concentración de la bacteria en la gota que se coloca en la mica de gelatina tratada.
Figura 2. AFM imágenes de E. coli. En el panel (a), las células se montan en gelatina mica recubierta y la imagen en 0.005 M de PBS. Por comparación, una imagen de las células bacterianas montados en gelatina-mica recubierta y la imagen en el aire se muestra en el panel (b). A pesar de los tabiques son claramente visibles en la imagen recogida en el líquido, mayor resolución, como lo indica la presencia de pili (panel de inserción (b)), se puede obtener en el aire.
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Discussion
Hay varios factores que pueden afectar a las células microbianas y de montaje de imágenes por AFM. La gelatina que se utiliza para el recubrimiento de la mica es importante. Comerciales de gelatina está aislado de una serie de vertebrados, incluyendo peces, vacas y cerdos. El origen y el método de procesamiento de determinar la idoneidad de la gelatina para la inmovilización de bacterias. Numerosas fuentes y tipos de gelatina fueron evaluados para determinar su eficacia en las bacterias inmovilizar [1]. Los dos gelatinas más eficaces resultaron ser Sigma G-6144 y G-2625. Derivados del cerdo (porcino), estas gelatinas se consideran de bajo Bloom y Bloom medio, respectivamente. Es importante probar la compatibilidad entre el sustrato de gelatina tratos y la cepa de la bacteria a estudiar. Es importante destacar que la gelatina de origen bovino (vacuno) no ha sido eficaz en la inmovilización de cualquiera de las bacterias ensayadas. Una simple prueba para la inmovilización celular consiste en permitir que la muestra se seque en la mica, después de lavar con agua o tampón (después del paso 4.6). Si las bacterias se inmovilizan, un área nublada se observó (Fig. 1D). Si la superficie no está nublado, la corriente de agua de enjuague ha eliminado la bacteria. Al realizar esta prueba, el usuario debe tener cuidado con los efectos de los aditivos, tales como sales, que también puede conducir a un aspecto turbio.
La técnica de mica recubiertas de gelatina inmovilización ha aplicado con éxito a las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas (1), esferoplastos bacterianos (2), las partículas de virus (3) y conchas de diatomeas (4). Inmovilización con gelatina tiene la ventaja de las células de la dispersión en el sustrato, lo que permite obtener unas imágenes de una bacteria que deban tomarse. Asimismo, el método asegura que un amplio número de células se encuentran disponibles en cada campo, lo que reduce el tiempo de búsqueda de las células. La técnica también se ha utilizado para la recolección de las medidas de fuerza en la superficie celular de los E. coli (5) y Pseudomonas aeruginosa (6). Características de las diferentes cepas de bacterias puede afectar a la inmovilización. Por ejemplo, mientras que el tipo silvestre de E. coli (DH5a) son inmovilizados en forma estable líquido utilizando sustratos recubiertos con gelatina G-6144, una cepa deficiente en las lipoproteínas de la membrana externa, NlpI no inmovilizar bien y en su lugar requiere una gran gelatina Bloom (Sigma G-2500).
Contenido de la solución bacteriana también puede afectar a la inmovilización celular. Medios de cultivo, tampones cierto, y las sales pueden interferir con la unión de la bacteria (que compiten con las bacterias de la superficie de la gelatina) y tendrá que ser probada. En última instancia, el éxito de imagen de las bacterias en el líquido por AFM depende de la optimización de la inmovilización (por el número de células), seleccionando el líquido óptimo para la aplicación de las bacterias a la superficie de mica y de imagen en un medio líquido compatible con su experimento diseñado. Por ejemplo, un buffer diluida ha sido utilizado con éxito en el E. coli fue inmovilizado en gelatina mica recubierta de fosfato 0,01 M (PBS), se lavaron con el mismo tampón para eliminar las células débilmente unidos, y posteriormente reflejado en PBS 0,005 M (Fig. 2). Para las células que son sensibles osmóticamente, sacarosa, hasta 0,25 M, se ha utilizado con éxito para el montaje de imágenes y las bacterias [2-6]. El modo de imagen es otro factor que debe considerarse cuando se trata de bacterias imagen débilmente en los líquidos. Imágenes de modo de contacto pueden desplazar las bacterias débilmente unidos. Los modos de imagen sin contacto, el modo de tocar y el modo de MAC, reducir la fuerza lateral ejercida por la punta de la sonda y por lo tanto, puede ser preferible.
Por otra parte, con voladizos con constantes de los resortes de baja y la minimización de la fuerza en el modo de contacto también puede ayudar a las bacterias la imagen débilmente unidos.
Imágenes de muestras de bacterias que viven en estado líquido ofrece la oportunidad de obtener imágenes representativas de la superficie celular, sin comprometer los efectos del secado. Medidas precisas de las características de la superficie, la altura y la rigidez de una célula viva puede ser recogida. De la misma manera, las moléculas específicas sonda conectada a la voladizo puede ser utilizado para identificar las interacciones, mapa de localización, y medir las fuerzas de la unión a los objetivos específicos en la superficie celular [7]. La inmovilización de las bacterias en un medio líquido facilita los estudios dinámicos de la vida las células bacterianas. Esto podría incluir estudios de crecimiento bacteriano y la división, el efecto de la adición de especies moleculares en el medio de imágenes, y cambiar las propiedades físicas del medio ambiente como la temperatura o presión. En general, tener la opción de estudiar las bacterias en líquidos, en alta resolución, alimenta la imaginación con las posibilidades de investigación futura.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Esta investigación está patrocinada por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental, Departamento de Energía de EE.UU. y por subvenciones de la Junta de Virginia Commonwealth Investigación en Salud. Oak Ridge National Laboratory es administrado por UT-Battelle, LLC, para el Departamento de Energía de EE.UU. bajo el Contrato No. DE-AC05-00OR22725.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
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