Summary
Live gramnegativa och grampositiva bakterier kan immobiliseras på gelatin-belagda glimmer och avbildas i flytande med hjälp av atomkraftsmikroskopi (AFM).
Abstract
AFM är en hög upplösning (nm skala) imaging verktyg som mekaniskt sonder en yta. Det har förmågan att bilden celler och biomolekyler, i en vätska miljö, utan att kemiskt behandla provet. För att uppnå detta mål måste provet hålla tillräckligt för att monteringsytan för att förhindra att tas bort av krafter som skanning AFM fribärande spets. I många fall beror lyckad avbildning av fixering av provet till monteringsytan. Optimalt ska immobilisering vara minimalt invasiva till provet så att metaboliska processer och funktionella egenskaper inte äventyras. Genom beläggning nyligen klyvs glimmer ytor med svin (gris) gelatin, kan negativt laddade bakterier inte kunna rubbas på ytan och avbildade i flytande genom AFM. Fixering av bakterieceller på gelatin belagda glimmer beror sannolikt på grund av elektrostatisk växelverkan mellan negativt laddade bakterier och de positivt laddade gelatin. Flera faktorer kan påverka bakteriell immobilisering, inklusive kemiska beståndsdelar av vätskan där bakterier är tillfälligt, inkubationstiden för bakterier på gelatin belagda glimmer, ytegenskaper av bakteriestam och mediet där bakterier är avbildade. Totalt sett är användningen av gelatin-belagda glimmer befunnits vara allmänt tillämpliga för celler avbildning mikrobiell.
Protocol
1. Mica förberedelser:
- Skär av glimmer (elektronmikroskopi Sciences) med en sax till den storlek som krävs för att montera AFM-mikroskop (ca 22 × 30 mm).
- Klyva glimmer på båda sidor, i allmänhet med tejp för att ta bort det yttersta lagret, tills bara släta obrutna lager kvar.
2. Beredning av gelatin lösning:
- Tillsätt 100 ml destillerat vatten till ett laboratorium flaska.
- Värm flaskan i en mikrovågsugn tills vattnet börjar koka. (Om en mikrovågsugn inte är tillgänglig, kan vattnet värmas upp i en bägare på en värmeplatta.)
- Väg upp 0,5 gram av gelatin (Sigma G-6144, G-2625 eller G-2500) och lägga till i hett destillerat vatten.
- Snurra flaskan tills gelatinet är helt upplöst.
- Kyl gelatin lösningen till 60-70 ° C.
- Häll ca 15 ml i en liten bägare (20 ml) i vilken klippa kluvna glimmer kan doppas.
3. Mica beläggning:
- Sänk ner glimmer torg i varm gelatin lösningen och dra snabbt så att glimmer är belagda (bild 1a).
- Efter beläggning, stödja glimmer omedelbart, på kanten, på ett hushållspapper för att torka i luften (bild 1b). Gelatinet belagt glimmer kan användas i minst 2 veckor. Överskottet gelatin lösning kan förvaras i kylskåp och användas för ungefär en månad genom att helt enkelt återuppvärmning stamlösning till mellan 60-70 ° C. Försiktighet måste vidtas för att säkerställa att gelatin inte kokas under värmningen.
4. Montering bakterier på gelatin belagt glimmer:
- Pellets 1 ml av en bakteriekultur (0,5 - 1,0 OD vid 600 nm) vid 800 till 4.500 RCF. Beroende på bakterier, använda minsta RCF som pellets cellerna i ~ 5 minuter.
- Tvätta pelleten i samma mängd filtrerat avjoniserat vatten eller buffert.
- Samla cellerna igen genom centrifugering.
- Återsuspendera pelleten snabbt i 500 ìl nanopure avjoniserat vatten eller buffert. (Bakteriesuspensionen bör vara tydligt grumligt för att få en tillräcklig koncentration av celler för AFM avbildning.)
- Applicera cellsuspension (10-20 mikroliter) till gelatin-belagda glimmer och sprids på ytan med hjälp av en pipett spets (Fig. 1c). Försiktighet bör vidtas för att inte fysiskt röra gelatin yta med pipettspetsen samtidigt som eller sprida den bakteriella lösningen.
- Låt ytan för att vila i 10 minuter och skölj med en ström av vatten eller buffert (Fig. 1 cd). Under hela förfarandet, noga med att säkerställa att provet inte får torka.
5. Representativa resultat:
Figur 2 visar exempel bilder av bakteriella celler som har monterats på gelatin-belagda glimmer och avbildat av AFM. I våra laboratorier, prover brukar avbildas med en PicoPlus atomkraftsmikroskop (Agilent Technologies, Temple, AZ) utrustad med en 100 ìm skanning huvudet. Instrumentet drivs med 128-512 pixlar per linje skanna med en skanningshastighet på 0,5-1,0 linjer / s. Den utliggare som vanligtvis används är Veeco kiselnitrid sonder (MLCT-AUHW, Veeco, Santa Barbara, CA) med nominell fjäder konstanter som sträcker sig från 0,01 till 0,1 nN / nm.
Figur 1. Gelatin vid en temperatur på 60-70 ° C placeras i en 20 ml bägare. Med hjälp av en pincett nyligen klyvs glimmer torg är helt nedsänkta i gelatin (a) tillbaka och placeras upprätt på en pappershandduk lutad mot en mikro centrifug rack (B). En droppe av bakteriell provet placeras på glimmer och sprid med en pipettspetsen i både X-och Y-led (c). Efter att låta provet att ruva på glimmer ytan i minst 10 minuter, skölj provet i en ström av destillerat vatten. Om immobilisering arbetade kommer du att kunna se en ogenomskinlig fläck på glimmer som visas i den högra panelen av (D). Om immobilisering inte fungerar kommer du att få en tydlig del av glimmer som i den vänstra panelen. Den ogenomskinliga plats på glimmer skalor för att koncentrationen av bakterier i droppen som du placerar på de behandlade gelatin glimmer.
Figur 2. AFM-bilder av E. coli. I panel (en) är de celler monterade på gelatin-belagda glimmer och avbildade i 0,005 M PBS. Som jämförelse är en bild av bakterieceller monterade på gelatin-belagda glimmer och avbildade i luft visas i panelen (B). Även septa syns tydligt i bilden samlas i flytande form, högre upplösning, vilket indikeras av närvaron av pili (infälld panel (b)), kan erhållas i luft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika faktorer kan påverka mikrobiell cell montering och avbildning av AFM. Det gelatin som används för beläggning av glimmer är viktigt. Kommersiella gelatin är isolerad från ett antal ryggradsdjur inklusive fisk, kor och grisar. Både ursprung och bearbetningsmetod bestämma gelatin lämplighet för bakteriell immobilisering. Många källor och typer av gelatin utvärderades för deras effektivitet i immobilisera bakterier [1]. De två mest effektiva gelatin som befanns vara Sigma G-6144 och G-2625. Härstammar från grisar (svin), dessa gelatin som anses vara låg Bloom och medelstora Bloom, respektive. Det är viktigt att testa kompatibiliteten mellan gelatin-behandlade substrat och särskild stam av bakterier som ska studeras. Viktigt gelatin från nötkreatur (nötkreatur) inte har varit effektivt i immobilizing någon av de testade bakterier. Ett enkelt test för cell fixering innebär gör provet för att torka på glimmer, efter sköljning i vatten eller buffert (efter steg 4,6). Om bakterier är immobiliserade, kommer en molnig område följas (Fig. 1d). Om ytan inte är grumlig, har strömmen av sköljvattnet bort bakterier. När du utför detta test bör användaren vara försiktig av effekterna av tillsatser, såsom salter, som också kan leda till ett grumligt utseende.
Gelatinet belagda glimmer immobilisering teknik har framgångsrikt använts av gramnegativa och grampositiva bakterier (1), bakteriell spheroplasts (2), viruspartiklar (3) och skal kiselalger (4). Immobilisering med gelatin har fördelen av spridning celler på underlaget, vilket möjliggör bilder av en enskild bakterie som skall vidtas. Också den metod som säkerställer att ett gott antal celler är tillgängliga i varje område, vilket minskar tiden söker efter celler. Tekniken har också använts för insamling av kraft mätningar på cellytan av både E. coli (5) och Pseudomonas aeruginosa (6). Egenskaper hos olika bakteriestammar kan påverka immobilisering. Till exempel, medan vildtyp av E. coli (DH5α) stabilt är orörlig i flytande med hjälp av substrat belagda med gelatin G-6144, en stam brister i det yttre membranet lipoprotein gjorde NlpI immobilisera inte bra och istället krävs en hög Bloom gelatin (Sigma G-2500).
Innehållet i den bakteriella lösningen kan också påverka celler immobilisering. Tillväxt media, vissa buffertar och salter kan påverka bakteriell bindande (de konkurrerar med de bakterier för gelatin yta) och kommer att testas. Ytterst beror lyckad avbildning av bakterier i vätska genom AFM på att optimera immobilisering (för cell nummer), val av optimal vätska för tillämpning av bakterier till glimmer ytan och bildbehandling i ett flytande medium kompatibla med din utformade experimentet. Till exempel har en utspädd buffert framgångsrikt använts där E. coli var immobiliserade på gelatin-belagda glimmer i 0.01M fosfatbuffrad saltlösning (PBS), sköljas med samma buffert för att ta bort löst bundet celler, och därefter avbildas i 0.005M PBS (Fig. 2). För celler som är osmotiskt känsliga, sackaros, upp till 0,25 miljoner, har med framgång använts för att montera och bakterier bildhantering [2-6]. Den avbildning läget är en annan faktor som bör beaktas när man försöker bild svagt bunden bakterier i vätskor. Kontakta mode scanning kan tränga löst bundna bakterier. Den beröringsfria imaging lägen, Tapping Mode och MAC-läge, minska de laterala krafter som sondspetsen och kan därför vara att föredra.
Alternativt kan med hjälp av utliggare med låg fjäder konstanter och minimera kraft i kontakt läget också bidra till att bilden löst bundna bakterier.
Imaging bor bakteriell prover i flytande erbjuder möjlighet att få representativa bilder av cellens yta utan att kompromissa effekterna av uttorkning. Precisa mått ytegenskaper, höjd och stelhet i en levande cell kan samlas in. På samma sätt kan specifika sond molekyler bifogas fribärande användas för att identifiera interaktioner, plats på kartan och mäta bindande styrkor för att specifika mål på cellytan [7]. Fixering av bakterier i ett flytande miljö underlättar dynamiska studier av levande bakterieceller. Detta kan inkludera studier av bakteriell tillväxt och delning, effekten av att lägga molekylstorleken till bildbehandling medium och ändra fysikaliska egenskaper i miljön som temperatur eller tryck. Sammantaget har möjlighet att studera bakterier i vätskor, med hög upplösning, bränslen fantasin med framtida forskningsmöjligheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna forskning är sponsrad av byrån för bio-och miljöforskning, US Department of Energy och genom bidrag från Virginia Commonwealth Health Research Board. Oak Ridge National Laboratory förvaltas av UT-Battelle, LLC, för US Department of Energy i Kontrakt nr DE-AC05-00OR22725.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G6144, G2625 or G2500 | |
| PicoPlus Atomic Force Microscope | Agilent Technologies | ||
| AFM cantilevers | Veeco Instruments, Inc. | MLCT-AUHW |
References
- Bernal, R., Pullarkat, P. A. Mechanical properties of axons. Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev Biol. 102, 379-389 (1984).
- Chetta, J., Kye, C. Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons. Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).
- Dennerll, T. J., Lamoureux, P. The cytomechanics of axonal elongation and retraction. J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).
- Fu, S. Y., Gordon, T. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).
- Gray, C., Hukkanen, M. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neuroscience. 50, 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Tension as a regulator and integrator of axonal growth. Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).
- Iwata, A., Browne, K. D. Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions. Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).
- Lamoureux, P., Heidemann, S. R. Growth and elongation within and along the axon. Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).
- Lamoureux, P., Zheng, J. A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces. J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).
- Lindqvist, N., Liu, Q. Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).
- Loverde, J. R., Ozoka, V. C. Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons. J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).
- Lu, Y. B., Franze, K. Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).
- O'Toole, M., Lamoureux, P. A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth. Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Pfister, B. J., Gordon, T. Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges. Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Extreme stretch growth of integrated axons. J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).
- Pfister, B. J., Iwata, A. Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons. J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).
- Siechen, S., Yang, S. Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).
- Smith, D. H. Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).
- Smith, D. H., Wolf, J. A. A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension. Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).
- Weiss, P. Nerve patterns: The mechanics of nerve growth. Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).
- Zheng, J., Lamoureux, P. Tensile regulation of axonal elongation and initiation. J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).
