אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

Summary

הגורם המגביל בשימוש של המבוגר

Abstract

זבוב הפירות דרוזופילה melanogaster תרם תרומות יקר המוח במחקר כבר בשימוש נרחב כמודל מחלות ניווניות בגלל הגנטיקה שלה עוצמה ^1. העין לטוס בפרט כבר האיבר של בחירה עבור מחקר ניוון מוחיים, להיות חלק נגיש ביותר החיים dispensable של מערכת העצבים תסיסנית. עם זאת, אזהרה גדולה של העיניים שלם הוא הקושי, בגלל autofluorescence האינטנסיבי של הפיגמנט, באירועים הדמיה תאיים, כגון autophagy הדינמיקה ^2, אשר עליונה הבנה של ניוון מוחיים.

השתמשנו לאחרונה לנתיחה והתרבות של האומטידיה אחד ³ כי כבר חיוני להבנת תפקוד autophagic במודל זבוב של ניוון Dentatorubro-Pallidoluysian (DRPLA) ^{3, 4.}

כעת אנו מדווחים תיאור מקיף של טכניקה זו (איור 1), המותאמים ממחקרים אלקטרו ^5, אשר צפוי להרחיב באופן משמעותי את האפשרות של מודלים לטוס ניוון מוחיים. שיטה זו יכולה להתאים לדימוי חי אירועים subcellular כדי לפקח והתרופות אפקטיבי על התאים קולטי האור (איור 2). אם בשילוב עם טכניקות פסיפס ^6-8, התגובות של תאים שונים גנטית יכול להיות assayed במקביל (איור 2).

Protocol

1. Dissection של הרשתית תסיסנית

1. מילוי אחד טוב של שקופיות 3-ובכן זכוכית עם פוספט שנאגרו מלוחים (PBS 1X), ולאחר מכן להרדים זבובים על ידי ה-CO _2. שני זכרים ונקבות ניתן להשתמש לצורך הניסוי הזה.
2. לאחר הזבובים מורדמים, להרים זבוב אחד באמצעות מלקחיים ו זרוק אותו לתוך צלחת קטנה של PBS.
3. תחת בהיקף לנתח, לצבוט את חוטם עם מלקחיים, ולאחר מכן לנתק את הראש מהגוף על ידי ניתוק הצוואר באמצעות סט שני של מלקחיים.
4. החזקת הראש לטוס חוטם, בחצי לאורך קו האמצע שמאלה / ימינה ראש לטוס עם microscissors לחשוף את המוח.
5. השתמש קצה פיפטה לחתוך להרים את הרשתית, ולהעביר שנייה גם של 3-Slide ובכן זכוכית מלאים בינוני שניידר.
6. ראשית, לקלף ביותר לציפורן ראש ולאחר מכן להסיר את המוח עם מלקחיים. שמור את הרשתית דחוקה בין lamina לבין הקרנית.
7. לאחר מכן, להעביר את הרשתית על ירידה (50 μl) של המדיום Schnieder טרי ממוקם ישירות על שקופיות הזכוכית.

2. Dissection של האומטידיה

1. בהתאם למטרה הסופית של הניתוח (בין אם באופן מיידי או הדמיה תרבות) ועל אופטיקה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ישיר או הפוך), שלב זה יכול להתרחש גם על המיקרוסקופ שקופית או בצלחת 24 באר. למטרה הסופית של הניתוח הזה, האומטידיה יהיה גזור ישירות על גבי שקופיות הזכוכית.
2. אחוז או סוף הגב או הגחון ביותר של הרשתית עם מלקחיים. שימוש microscissors, לחתוך את הרשתית במחצית לאורך קו האמצע הגב / הגחון לחשוף את האומטידיה באמצע העין.
3. המשך לתפוס את הרשתית כזה הקרנית פונה למטה lamina הוא פונה כלפי מעלה. באמצעות מחט טונגסטן בסדר, לנתק את האומטידיה מ lamina לבין הקרנית.
4. האומטידיה יחיד וקבוצות האומטידיה תאסוף בתחתית הבאר או שקופיות. הסר את כל פסולת גדול שייתכן שנאספו לפני שתמשיך.

3. , טיפול מכתים הדמיה

1. כדי לנתח autophagy, לדלל 1:1000 Lysotracker בירידת שניידר (הראשון לדלל 1:10 ב שניידר ולאחר מכן להוסיף 0.5 μl עד טיפת בשקופית), לערבב ולהמתין 10 שניות.
2. הסר את נוזל עודף בשקופית, נזהר לצאת מאחורי האומטידיה. זה נעשה בצורה הטובה ביותר עם טיפ ג'ל עדין טוען.
3. הוסף ירידה של Vectashield כדי לכסות את האומטידיה, להחיל coverslip וסוגרים עם nailpolish.

4. נציג תוצאות:

ביצוע טוב של הפרוטוקול צריך להשאיר מספר האומטידיה יחיד של קבוצות קטנות של האומטידיה שמרו יחד על ידי שברי lamina אבל מופרדים יפה בצד הקרנית. אלה יכולים להיות צילמו כמו בדוגמה זו כדי להמחיש Atg8: GFP ו Lysotracker, מראה autophagosomes, lysosomes ו autophagolysosomes (איור 3). השיטה יכולה לשמש הדמיה לחיות, אולם במקרה זה יש לציין כי autofluorescence של המדיום של שניידר יקשה להבחין בין אותות בעוצמה נמוכה ניאון. סוגיה נוספת היא כי גרגרי פיגמנט שנותרו המחוברים photoreceptors הם פלורסנט מאוד, במיוחד במסלול האדום. תמונה brightfield עשויים להידרש להבדילם האברונים אמיתי.

באיור 1. תרשים זרימה של הליך לנתיחה כדי להשיג האומטידיה בודד או קבוצות קטנות של האומטידיה מן הרשתית לעוף.

איור 2. וריאציות אפשריות של פרוטוקול פשוט לתאר כאן שכוללות גנטיקה לטוס והזדקנות במעלה הזרם של דיסקציה ו מכתים או culturing במשך עד 24 שעות והתרופות במורד הזרם של הניתוח.

איור 3 לסרוק Confocal של autophagosomes ו lysosomes ב אומטידיום יחיד גזור מן aw;-GMR Gal4, כטב"מ-Atro75QN; כטב"מ-GFP:.: Atg8 / + לעוף, להביע polyglutamine Atrophin מוטנטי בגילאי 12 ימים ב 29 ° C. לוח brightfield (מימין למעלה) מציג את מבנה כמעט בשלמותה של אומטידיום ואת המסגרת מצביע על האזור שנסרק. האדום מסמן ליזוזומים, ירוק autophagosomes, Auto-lysosomes, וכתוצאה מכך על ידי איחוי של שני אברונים, מופיעים צהוב. ראשי חץ מציינים שני אירועים היתוך מתמשך בין autophagosomes ו lysosomes.

Discussion

דיסקציה אומטידיום יחיד המוצגת כאן מאפשרת איסוף מידע התא עמוק יותר על תהליכים ביולוגיים כמו ניוון מוחיים, כאשר הדגם בעין תסיסנית. הנוירונים הם photoreceptor נגיש יותר בקלות מאשר נוירונים אחרים והם הציטופלסמה הוא גדול במיוחד, מתאים ובכך ללמוד הדינמיקה שלפוחית, בתאי בדיוק השתמשו במיומנות במודלים רבים לכמת ניוון מוחיים in vivo. ההיבט הקריטי של הניתוח הוא בעיקר את היכולת לבצע זאת על רקמת מבולבל כי לא חייב להיות חשוף לאוויר או להתייבש. האפשרויות להרחבת טכניקה זו הבסיסיים הם כאלה (איור 2) כי הוא עשוי גם לחולל מהפכה את המידע המתקבל מודלים עין של ניוון מוחיים, המאפשר לכל מיני מניפולציות אפשריות תרבות העצבית העיקרי בשילוב של שינויים גנטיים מדהים אפשרי זבובים .

בשילוב עם טכניקות פסיפס, שימושי ביותר במחקרים ניוון מוחיים ⁹ זה עשוי לאפשר זיהוי של שינויים ביולוגיים תא משנה מסוים של מוטציה האומטידיה, בנוכחות של בקרות wt מן הזבוב אותו מאוד.

כאשר גזור האומטידיה נשמרים תרבות, reponses לתרופות כמו rapamycin ¹⁰ או parquat ¹¹ מאי לשלוט טוב יותר לכמת מאשר כאשר ניתנת זבובים חיים. המגבלה העיקרית של המערכת היא היוותה עד ההישרדות של האומטידיה גזור בתרבות, אשר לא היינו יכולים להרחיב הרבה מעבר 24 שעות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Portable CO2 Dispenser	Flystuff	59-150	Refills also available
DUMONT Tweezer No 5	Agar Scientific	T5034
3-Well Glass Slide	EMS	71561-01
Micro scissors	VWR international	HAMMHSB516-09
Schneider’s Medium	VWR international	733-1663
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L7528
Superfrost Slides	VWR international	631-0108
Vectashield with Dapi	Vector Laboratories	H-1200
Coverslips	VWR international	631-1336