Summary
성인의 사용에 제한 요인
Abstract
과일 파리 Drosophila melanogaster는 신경 과학 연구에 귀중한 기여를했다 때문에 강력한 유전자 1 neurodegenerative 질병에 대한 모델로 널리 사용되고 있습니다. 특히 플라이 눈이 Drosophila 신경계의 가장 접근 및 생명 소모품 부분이되고, neurodegeneration 연구에 대한 선택의 기관이되었습니다. 그러나 그대로 눈의 주요 주의해야 할 점은 neurodegeneration의 이해 파라마운트 아르 등 autophagy 역학이 같은 세포 이미징 이벤트에 때문에 안료의 강렬한 autofluorescence의 어려움이다.
우리는 최근 Dentatorubro - Pallidoluysian 위축의 비행 모델 (DRPLA) 3, 4 autophagic 장애에 대한 우리의 이해에 필수적인되었습니다 단일 ommatidia 3의 해부와 문화를 사용했습니다.
우리는 지금 크게 neurodegeneration에 대한 비행 모델의 가능성을 확장시킬 수 있습니다 electrophysiological 연구 5에서 조정이 기술의 종합적인 설명 (그림 1),보고합니다. 이 방법은 이미지 subcellular 이벤트를 살하고 (그림 2) photoreceptor 세포에 효과적인 약물 관리를 모니터에 적용할 수 있습니다. 모자이크 기법 6-8와 함께 사용한 경우, 유전적으로 다른 세포의 반응은 (그림 2) 병렬로 assayed 수 있습니다.
Protocol
1. Drosophila의 망막의 해부
- 인산염과 함께 한 잘의 3 자 유리 슬라이드를 작성하면 (PBS 1X) 호수 버퍼, 그리고 CO 2에 의해 파리를 마취. 남성과 여성 모두가이 실험을 위해 사용될 수 있습니다.
- 파리 anesthetized되면 집게를 사용하여 하나의 플라이를 선택하고 PBS의 작은 접시에 놓으십시오.
- 해부 현미경, 집게와 코을 공략하고 포셉의 두 번째 세트를 사용하여 목을 severing하여 시체에서 머리를 분리합니다.
- 왼쪽 / 오른쪽 정중선 두뇌를 공개 microscissors와 파리 머리를 따라 반으로, 코에서 파리 머리를 개최.
- 망막을 선택하고, 슈나이더 매체로 채워진 3 - 그럼 유리 슬라이드의 잘 두 번째로 전송하는 컷 피펫 팁을 사용합니다.
- 첫째, 벗겨 다음 머리 표피의 대부분 및 집게로 머리를 제거합니다. 라미나와 각막 사이에 끼워 넣으면 망막 보관하십시오.
- 다음, 유리 슬라이드의 직접 위치 신선한 샤이더 매체의 드롭 (50 μl)로 망막을 전송.
2. ommatidia의 해부
- 해부의 최종 목적 (즉시 이미지 또는 문화 여부) 및 형광 현미경 (직접 또는 거꾸로)의 광학에 따라이 단계는 현미경 슬라이드 또는 24 잘 플레이트에서 두 자리를 취할 수 있습니다. 이 부검의 최종 목적은 ommatidia은 유리 슬라이드에 직접 해부하는 것입니다.
- 중 포셉와 망막의 가장 지느러미 또는 복부 끝부분을 파악. microscissors를 사용하여 안구의 중간에있는 ommatidia를 노출하는 등의 / 복부 정중선을 따라 절반 망막를 잘라.
- 각막가 다운 향하게하고 라미나가 직면한 것을 같은 망막을 파악하기 위해 계속합니다. 훌륭한 텅스텐 바늘을 사용 라미나 및 각막에서 ommatidia를 분리합니다.
- 싱글 ommatidia 및 ommatidia 그룹은 잘 또는 슬라이드의 하단에 수집합니다. 계속하기 전에 수집 미칠 수있는 큰 파편을 제거합니다.
3. 치료, 얼룩 및 이미징
- autophagy 분석, 1:1000 슈나이더 드롭 Lysotracker (처음엔 희석 슈나이더의 1시 10분하고는 슬라이드에있는 드롭 0.5 μl 추가), 혼합 희석하고 10 초간 기다립니다.
- ommatidia의 뒤에두고 신중, 슬라이드에서 여분 액체를 제거합니다. 이것은 훌륭한 젤 로딩 팁과 함께 최선을 이루어집니다.
- ommatidia을 충당하기 위해 Vectashield의 드롭 추가 nailpolish와 coverslip과 인감을 적용합니다.
4. 대표 결과 :
프로토콜의 좋은 실행 라미나 조각하여 함께 보관하지만 훌륭하게 각막 측면에 구분된 단일 ommatidia와 ommatidia 작은 그룹의 전화 번호를 남겨주해야합니다. autophagosomes, lysosomes 및 autophagolysosomes (그림 3) 표시, GFP 및 Lysotracker : 이들은 Atg8을 시각화하기 위해이 예제에서와 같이 몇 군데 있습니다. 방법은 라이브 영상에 사용될 수 있습니다, 그러나이 경우에는 그것은 슈나이더의 매체 autofluorescence이 어려운 낮은 강도 형광 신호를 구별할 수있게 할 것이라고 언급되어야하는 것입니다. 추가 문제는 photoreceptors에 연결된 상태 안료 과립 특히 적색 채널에서 강렬한 형광진다는 것입니다. 브라이트 사진은 정품 organelles에서 그들을 구분해야 할 수 있습니다.
그림 1. 절개 절차의 플로우 차트는 파리 망막에서 단일 ommatidia 또는 ommatidia 작은 그룹을 얻을 수 있습니다.
그림 2. 여기 간단한 프로토콜의 가능한 변화가 비행 유전자를 포함, 최대 24 시간 절개의 약물 관리 하류에 대한 해부와 얼룩이나 culturing의 상류 고령화 것을 설명합니다.
그림 3 아에서 해부를 한 ommatidium에 autophagosomes과 lysosomes의 공촛점 스캔, GMR - Gal4, UAS - Atro75QN, UAS - GFP :. : Atg8 / + 비행, 29에서 polyglutamine Atrophin 돌연변이 및 이상 12일을 표현 ° C. 브라이트 패널 (오른쪽 위)은 ommatidium의 거의 그대로 구조를 표시하고 프레임 스캔 영역을 나타냅니다. 두 organelles의 융합으로 인한 붉은 자국의 Lysosomes, 녹색 autophagosomes, 자동 lysosomes는 노란색 나타납니다. 화살촉은 autophagosomes과 lysosomes 사이를 둘 다 지속적인 퓨전 이벤트를 나타냅니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기에 제시 단일 ommatidium의 해부은 Drosophila의 눈 모델 neurodegeneration와 같은 프로세스에 대한 깊이 세포 생물 학적 정보의 수집이 가능합니다. photoreceptor의 뉴런은 다른 뉴런보다 쉽게 접근할 수 있으며, 그 세포질은 생체내에 neurodegeneration를 정할 많은 모델 proficiently 사용되는 매우 동일한 세포에서, 특히 대형 및 소포의 역학 연구를 따라서 적합합니다. 해부의 중요한 측면은 주로 공기 또는 최대 건조에 노출 절대해야 떼어낸 조직에 수행할 수있는 능력입니다. 이 기본 기술의 확장에 대한 가능성은 파리에서 가능한 놀라운 유전 수정을 결합 기본의 연결을 문화에 조작 모든 종류의 가능한 수 있도록, 그것뿐만 아니라 neurodegeneration의 눈 모델에서 얻은 정보를 혁명 수도 있습니다 (그림 2) 아르 .
neurodegeneration 연구 9 매우 유용한 모자이크 기법와 함께 그것은 매우 동일한 비행에서 WT 컨트롤의 면전에서, 돌연변이 ommatidia의 특정 하위 집합에있는 세포 생물 학적 변경의 신분을 허용할 수 있습니다.
해부하면 ommatidia가 문화에 보관, rapamycin 10 parquat 11와 같은 약물에 reponses은 더 나은 제어 및 생활 파리에 실시 때보다 계량 수 있습니다. 시스템의 주요 한계는 우리가 24 시간 이상의 많은을 확대할 수 있도록되지 않은 문화의 해부 ommatidia의 생존 시간에 의해 형성됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 토론을위한 버나드 Charroux 감사합니다. 이 작품은 KCL 의생명 학교에서 후원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portable CO2 Dispenser | Flystuff | 59-150 | Refills also available |
| DUMONT Tweezer No 5 | Agar Scientific | T5034 | |
| 3-Well Glass Slide | EMS | 71561-01 | |
| Micro scissors | VWR international | HAMMHSB516-09 | |
| Schneider’s Medium | VWR international | 733-1663 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| Superfrost Slides | VWR international | 631-0108 | |
| Vectashield with Dapi | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | VWR international | 631-1336 |
References
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Nisoli, I. Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy. Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).
- Charroux, B., Fanto, M. The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration. Autophagy. 6, 667-669 (2010).
- Hardie, R. C. Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors. J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).
- Napoletano, F. Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat. The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).
- Ravikumar, B. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nature. 36, 585-595 (2004).
- Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).
