Summary
De beperkende factor in het gebruik van de volwassen
Abstract
De fruitvlieg Drosophila melanogaster heeft waardevolle bijdragen aan neurowetenschappelijk onderzoek en is op grote schaal gebruikt als een model voor neurodegeneratieve ziekten als gevolg van de krachtige genetica 1. De vlieg oog in het bijzonder is het orgaan van de keuze voor neurodegeneratie onderzoek, zijnde de meest toegankelijke en leven overbodig onderdeel van het Drosophila zenuwstelsel. Maar de belangrijkste waarschuwing van intacte ogen is de moeilijkheid, vanwege de intense autofluorescentie van het pigment, in beeldvorming intracellulaire evenementen, zoals autofagie dynamiek 2, die van cruciaal belang voor het begrijpen van neurodegeneratie.
We hebben recent gebruikte de dissectie en de cultuur van enkele ommatidia 3, dat is van essentieel belang geweest voor ons begrip van Autofagie disfuncties in een vlieg model van Dentatorubro-Pallidoluysian Atrofie (DRPLA) 3, 4.
We hebben nu rapport een uitgebreide beschrijving van deze techniek (figuur 1), aangepast van elektrofysiologische studies 5, die waarschijnlijk drastisch uit te breiden de mogelijkheid van vliegen modellen voor neurodegeneratie. Deze methode kan worden aangepast om de afbeelding te leven subcellulaire evenementen en effectieve toediening van het geneesmiddel te controleren op fotoreceptorcellen (afb. 2). Indien gebruikt in combinatie met mozaïek technieken 6-8, kunnen de reacties van genetisch verschillende cellen worden getest in parallel (afb. 2).
Protocol
1. Dissectie van de Drosophila netvlies
- Vul een een goed van een 3-Well glasplaatje met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS 1X) en vervolgens vliegt verdoven door CO 2. Zowel mannen als vrouwen kan worden gebruikt voor dit experiment.
- Zodra de vliegen worden verdoofd, pick-up een enkel vliegen met behulp van een tang en zet het in de kleine schotel van PBS.
- Onder een ontleding scope, neem de snuit met een tang, en dan maak de kop van het lichaam door de nek doorsnijden met behulp van een tweede set van de tang.
- Houd de vlieg hoofd van de proboscis, doormidden gesneden aan de links / rechts midline de vlieg hoofd met microscissors naar de hersenen zichtbaar te maken.
- Gebruik een afgezaagd pipettip op te halen het netvlies, en een tweede put van de 3-Well glasplaatje gevuld met Schneider medium transfer.
- Eerste schil weg het grootste deel van het hoofd cuticula en verwijder de hersenen met een tang. Houd het netvlies ingeklemd tussen de lamina en het hoornvlies.
- Vervolgens overdracht van de retina naar een druppel (50 ul) van verse Schnieder medium geplaatst direct van het glas dia.
2. Dissectie van de ommatidia
- Afhankelijk van de uiteindelijke doel van de dissectie (of onmiddellijke imaging of cultuur) en de optiek van de tl-microscoop (direct of omgekeerd), kan deze stap te geschieden op een microscoopglaasje of in een 24-well plaat. Voor het uiteindelijke doel van deze dissectie, zal de ommatidia direct worden ontleed op het glaasje.
- Pak een van de meest dorsale of ventrale einde van het netvlies met een tang. Met behulp van microscissors, snijd het netvlies in half langs de dorsale / ventrale mediaanlijn aan de ommatidia bloot in het midden van het oog.
- Nog steeds aan het netvlies, zodat het hoornvlies is naar beneden en de lamina is naar boven te begrijpen. Met behulp van een fijne wolfraam naald, maak de ommatidia uit de lamina en het hoornvlies.
- Single ommatidia en groepen van ommatidia zal verzamelen op de bodem van de put of dia. Verwijder alle grotere vuil dat hebben verzameld voordat u verder gaat.
3. Behandeling, vlekken en imaging
- Voor het analyseren van autofagie, verdunnen 1:1000 Lysotracker in de Schneider druppel (eerste verdunnen 1:10 in Schneider en vervolgens 0,5 ul toe te voegen aan de druppel op de dia), meng en wacht 10 seconden.
- Verwijder de overtollige vloeistof uit de slide, let daarbij goed op de ommatidia achter te laten. Dit gebeurt best met een fijne gel laad-tip.
- Voeg een druppel Vectashield aan de ommatidia te dekken, breng een dekglaasje aan en afdichting met nagellak.
4. Representatieve resultaten:
De goede uitvoering van het protocol moet laten een aantal alleenstaande ommatidia en van de kleine groepen van ommatidia bij elkaar gehouden door fragmenten van lamina maar mooi gescheiden op het hoornvlies kant. Deze kunnen worden afgebeeld zoals in dit voorbeeld om Atg8 visualiseren: GFP en Lysotracker, waarin autofagosomen, lysosomen en autophagolysosomes (afb. 3). De methode kan gebruikt worden voor live-imaging, maar in dit geval dient te worden opgemerkt dat de autofluorescentie van medium de Schneider zal het moeilijk maken om lage intensiteit fluorescerende signalen te onderscheiden. Een bijkomend probleem is dat de pigmentkorrels die gehecht blijven aan de fotoreceptoren zijn intens fluorescent, vooral in het rode kanaal. Een helderveld beeld kan nodig zijn om ze te onderscheiden van echte organellen.
Figuur 1. Stroomdiagram van de dissectie procedure om enkele ommatidia of kleine groepen van ommatidia te verkrijgen van de vlieg netvlies.
Figuur 2. Mogelijke variaties van het eenvoudige protocol hier te beschrijven die gepaard vliegen de genetica en de vergrijzing stroomopwaarts van de dissectie en vlekken of kweken tot 24 uur en Drug Administration stroomafwaarts van de dissectie.
Figuur 3 Confocale scan van autofagosomen en lysosomen in een enkele ommatidium ontleed van AW, GMR-Gal4, UAS-Atro75QN, UAS-GFP:.: Atg8 / + vliegen, uiten van een polyglutamine Atrophin mutant en de leeftijd van 12 dagen bij 29 ° C. De helderveld paneel (rechts boven) toont de bijna intact structuur van de ommatidium en het frame geeft het gescande gebied. Rode vlekken Lysosomen, groen de autofagosomen, auto-lysosomen, waardoor door de fusie van de twee organellen, verschijnen geel. De pijlpunten geven aan twee lopende fusie gebeurtenissen tussen autofagosomen en lysosomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De single ommatidium dissectie hier gepresenteerde maakt collectie van diepere celbiologische informatie over processen, zoals neurodegeneratie, toen gemodelleerd in het Drosophila oog. De fotoreceptor neuronen zijn gemakkelijker toegankelijk dan andere neuronen en ze cytoplasma is bijzonder groot, en dus geschikt om blaasje dynamiek studie, in de zeer bekwaam dezelfde cellen gebruikt in tal van modellen om neurodegeneratie in vivo te kwantificeren. De kritische aspect van de dissectie is vooral de mogelijkheid om het uit te voeren op niet vastgelegde weefsel dat nooit mag worden blootgesteld aan lucht of drogen. De mogelijkheden voor uitbreiding van deze basistechniek worden dergelijke (afb. 2), dat het net zo goed de informatie die is verkregen uit het oog van modellen van neurodegeneratie revolutie, waardoor allerlei manipulaties mogelijk in een primaire neuronale cultuur gekoppeld aan de verbazingwekkende genetische modificaties mogelijk in vliegt .
In combinatie met mozaïek technieken, uiterst nuttig in neurodegeneratie studies 9, kan hij de identificatie van de cel-biologische veranderingen in een specifieke subset van mutant ommatidia, in aanwezigheid van wt controles uit precies dezelfde vliegen.
Wanneer ontleed ommatidia worden gehouden in cultuur, kan REPONSES aan drugs zoals rapamycine 10 of 11 parquat beter worden gecontroleerd en gekwantificeerd dan wanneer het wordt toegediend aan het leven vliegt. De grootste beperking van het systeem wordt gevormd door de overlevingstijd van de ontleed ommatidia in cultuur, die we nog niet in staat geweest om veel verder dan 24 uur uit te breiden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken Bernard Charroux voor discussies. Dit werk werd gefinancierd door de KCL Biomedical School.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portable CO2 Dispenser | Flystuff | 59-150 | Refills also available |
| DUMONT Tweezer No 5 | Agar Scientific | T5034 | |
| 3-Well Glass Slide | EMS | 71561-01 | |
| Micro scissors | VWR international | HAMMHSB516-09 | |
| Schneider’s Medium | VWR international | 733-1663 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| Superfrost Slides | VWR international | 631-0108 | |
| Vectashield with Dapi | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | VWR international | 631-1336 |
References
- Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Nisoli, I. Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy. Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).
- Charroux, B., Fanto, M. The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration. Autophagy. 6, 667-669 (2010).
- Hardie, R. C. Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors. J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).
- Napoletano, F. Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat. The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).
- Ravikumar, B. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nature. 36, 585-595 (2004).
- Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).
