Summary
Der limitierende Faktor in der Verwendung der Erwachsenen
Abstract
Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster hat unschätzbare Beiträge zur neurowissenschaftlichen Forschung gemacht und wurde weithin als Modell für neurodegenerative Erkrankungen wegen seiner leistungsfähigen Genetik 1 verwendet. Die Fliege Auge in allem hat das Organ der Wahl für Neurodegeneration Forschung, wobei der am besten zugänglichen und Leben entbehrlich Teil der Drosophila Nervensystem. Doch die große Einschränkung der intakten Augen ist die Schwierigkeit, wegen der intensiven Autofluoreszenz des Pigments, in der Bildgebung intrazelluläre Ereignisse wie Autophagie Dynamik 2, die ausschlaggebend für das Verständnis der Neurodegeneration sind.
Wir haben vor kurzem die Präparation und Kultur der einzelnen Ommatidien 3, die wichtig ist für unser Verständnis von autophagischen Dysfunktionen in einer Fliege Modell Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophie (DRPLA) 3, 4 verwendet.
Wir berichten nun über eine umfassende Beschreibung dieser Technik (Abb. 1), von elektrophysiologischen Studien 5, die voraussichtlich erheblich erweitern die Möglichkeit des Fly-Modelle für Neurodegeneration angepasst ist. Diese Methode lässt sich an Bild zu leben subzelluläre Ereignisse und wirksames Medikament Verwaltung auf Sehzellen Monitor (Abb. 2). Wenn in Kombination mit Mosaik-Techniken 8.6 verwendet, können die Reaktionen von genetisch unterschiedlichen Zellen parallel getestet werden (Abb. 2).
Protocol
1. Dissektion der Drosophila Netzhaut
- Füllen Sie eine Vertiefung einer 3-Well Objektträger mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS 1X) und dann zu betäuben fliegt von CO 2. Sowohl Männchen als auch Weibchen können für dieses Experiment verwendet werden.
- Sobald die Fliegen betäubt sind, nehmen Sie eine Fliege mit einer Pinzette und legen Sie es in das Schälchen PBS.
- Unter einem Binokular, kneifen den Rüssel mit einer Pinzette, und dann nehmen Sie den Kopf vom Körper durch Abtrennen der Hals mit einem zweiten Satz von Zangen.
- Halten Sie die Fliege Kopf aus dem Rüssel, geschnitten längs der linken / rechten Mittellinie the fly Kopf mit Mikroschere an das Gehirn offenbaren.
- Verwenden Sie einen Schnitt Pipettenspitze abholen der Netzhaut und die Übertragung auf eine zweite und der 3-Well Objektträger aus Glas mit Schneider Medium gefüllt ist.
- Zunächst abziehen meisten der Kopf Nagelhaut und entfernen Sie dann das Gehirn mit einer Pinzette. Halten Sie die Netzhaut zwischen der Lamina und der Hornhaut eingeklemmt.
- Anschließend Transfer der Netzhaut auf einen Tropfen (50 ul) von frischen Schnieder Medium direkt von der Glasplatte gelegt.
2. Dissection der Ommatidien
- Abhängig vom endgültigen Ziel der Dissektion (ob sofort ein Bildbearbeitungs-oder Kultur) und auf die Optik des Fluoreszenz-Mikroskops (direkt oder umgekehrt), kann dieser Schritt erfolgt entweder auf einen Objektträger oder in eine 24-Well-Platte. Für die endgültige Zweck dieser Sektion wird der Ommatidien direkt auf das Glas gleiten seziert werden.
- Fassen Sie entweder die dorsalen oder ventralen Ende der Netzhaut mit einer Pinzette. Mit Mikroschere, schneiden die Netzhaut in zwei Hälften entlang der dorsalen / ventralen Mittellinie der Ommatidien in der Mitte des Auges aussetzen.
- Weiter auf die Netzhaut, so dass die Hornhaut nach unten und in der Lamina nach oben zu erfassen. Mit einem feinen Wolfram-Nadel, nehmen Sie den Facettenaugen von der Lamina und der Hornhaut.
- Einzel Facettenaugen und Gruppen von Ommatidien wird auf dem Grund des Brunnens oder schieben zu sammeln. Entfernen Sie alle Fremdkörper, die größer, bevor Sie fortfahren gesammelt haben.
3. Die Behandlung, Färbung und Imaging
- Zur Analyse Autophagie, verdünnte 1:1000 LysoTracker in der Schneider & Drop (erste Verdünnung 1:10 in Schneider und fügen Sie dann 0,5 ul der Tropfen auf dem Objektträger), mischen und 10 Sekunden warten.
- Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit aus der Folie, wobei darauf geachtet, die Facettenaugen hinter sich zu lassen. Dies geschieht am besten mit einer feinen Spitze für Gel durchgeführt.
- Fügen Sie einen Tropfen Vectashield die Facettenaugen decken, Deckglas auflegen und Dichtung mit Nagellack.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Die gute Ausführung des Protokolls sollten verlassen eine Reihe von einzelnen Ommatidien und kleine Gruppen von Einzelaugen zusammen gehalten durch Fragmente von Lamina aber schön auf der Hornhaut Seite getrennt. Diese können wie in diesem Beispiel dargestellt werden, um ATG8 visualisieren: GFP und LysoTracker, zeigt Autophagosomen, Lysosomen und autophagolysosomes (Abb. 3). Die Methode für die Live-Bildgebung verwendet werden kann, aber in diesem Fall ist zu beachten, dass Autofluoreszenz der Schneider-Medium wird es schwierig machen, mit niedriger Intensität fluoreszierender Signale zu unterscheiden. Ein weiteres Problem ist, dass die Pigmentkörnchen, die die Photorezeptoren verbunden bleiben intensiv fluoreszierende, vor allem in den roten Kanal sind. Ein Hellfeld Bild erforderlich, um sie von echten Organellen unterscheiden.
Abbildung 1. Flussdiagramm der Dissektion Verfahren auf einzelne Ommatidien oder kleine Gruppen von Facettenaugen von der Fliege Netzhaut zu erhalten.
Abbildung 2. Mögliche Variationen des einfachen Protokolls hier zu beschreiben, dass einbeziehen fliegen Genetik und Altern vor der Dissektion und Färbung oder Kultivierung für bis zu 24 Stunden and Drug Administration nach dem Sezieren.
Abbildung 3 konfokale Scan Autophagosomen und Lysosomen in einem Ommatidium von aw seziert; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP:.: ATG8 / + fliegen, Ausdruck einer Polyglutamin Atrophin Mutante und im Alter von 12 Tagen bei 29 ° C. Die Hellfeld-Panel (oben rechts) zeigt die nahezu intakte Struktur des Ommatidium und der Rahmen zeigt das gescannte Gebiet. Rote Markierungen Lysosomen, grün die Autophagosomen, Auto-Lysosomen, was durch die Fusion der beiden Organellen, gelb erscheinen. Die Pfeilspitzen zeigen zwei laufende Fusion Ereignisse zwischen Autophagosomen und Lysosomen.
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Discussion
Die einzelnen Ommatidium Dissektion hier vorgestellten ermöglicht das Speichern von tiefer zellbiologische Informationen über Prozesse wie Neurodegeneration, wenn in der Drosophila Auge nachempfunden. Der Photorezeptor Neuronen sind leichter zugänglich als andere Neuronen und sie Zytoplasma ist besonders groß, und damit geeignet, um Vesikel Dynamik Studie, in der selben Zellen kompetent in vielen Modellen verwendet werden, um Neurodegeneration in vivo zu quantifizieren. Der kritische Aspekt der Dissektion ist vor allem die Fähigkeit, auf nicht fixierten Gewebe, das niemals ausgesetzt sind, müssen an der Luft oder vertrocknen werden durchzuführen. Die Möglichkeiten zur Erweiterung dieser grundlegenden Technik sind solche (Abb. 2), dass es ebenso revolutionieren die Informationen vom Auge Modellen der Neurodegeneration gewonnen, so dass alle Arten von Manipulationen möglich in einer primären neuronalen Kultur gekoppelt, um die erstaunlichen genetischen Veränderungen möglich fliegt .
In Kombination mit Mosaik-Techniken, sehr nützlich in Neurodegeneration Studien 9 ist es möglicherweise eine Identifizierung zulassen von zellbiologischen Veränderungen in eine bestimmte Untergruppe von mutierten Ommatidia, in Anwesenheit von wt-Steuerelemente aus der selben fliegen.
Wenn seziert Ommatidien in Kultur gehalten werden können reponses zu Drogen wie Rapamycin 10 oder parquat 11 besser kontrolliert und quantifiziert werden, als wenn sie lebende Fliegen verwaltet. Die wichtigste Einschränkung des Systems wird durch die Überlebenszeit der sezierten Ommatidien in der Kultur, die wir nicht in der Lage gewesen, um weit über 24 Stunden zu erweitern konstituiert.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Bernard Charroux für Diskussionen. Diese Arbeit wurde von der KCL Biomedical Schule finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Portable CO2 Dispenser | Flystuff | 59-150 | Refills also available |
| DUMONT Tweezer No 5 | Agar Scientific | T5034 | |
| 3-Well Glass Slide | EMS | 71561-01 | |
| Micro scissors | VWR international | HAMMHSB516-09 | |
| Schneider’s Medium | VWR international | 733-1663 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| Superfrost Slides | VWR international | 631-0108 | |
| Vectashield with Dapi | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Coverslips | VWR international | 631-1336 |
References
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