Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Единый Drosophila Омматидия Препарирование и обработка изображений

doi: 10.3791/2882 Published: August 19, 2011

Summary

Ограничивающим фактором в использовании взрослых

Abstract

Плодовой мушки дрозофилы сделал неоценимый вклад в неврологии исследования и широко используется в качестве образца для нейродегенеративных заболеваний из-за своей мощной генетике 1. Летать глаз, в частности, была органом выбор для нейродегенерации исследования, являясь самым доступным и жизни необязательной частью дрозофилы нервной системы. Однако основные предостережение интактных глаз трудности, из-за интенсивной флуоресценции от пигмента, в визуализации внутриклеточных событий, таких как аутофагии динамики 2, которые имеют огромное значение для понимания нейродегенерации.

Недавно мы использовали вскрытие и культура одного омматидии 3, что имеет огромное значение для нашего понимания autophagic нарушений в летают модель Dentatorubro-Pallidoluysian Атрофия (DRPLA) 3, 4.

Теперь отчет с подробным описанием этого метода (рис. 1), адаптированных с электрофизиологических исследований 5, который, скорее всего, значительного расширения возможности летать модели нейродегенерации. Этот метод может быть адаптирован к изображению живой субклеточных событий и следить за эффективным приемом препаратов на клетки фоторецепторов (рис. 2). При использовании в сочетании с мозаикой методов 6-8, ответы генетически различных клеток может быть проанализированы параллельно (рис. 2).

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Препарирование сетчатки дрозофил

  1. Заполните одну лунку 3-Ну стекло с фосфатным буферным раствором (PBS 1X), а затем анестезию пролетает CO 2. И мужчины и женщины могут быть использованы для этого эксперимента.
  2. Как только мухи под наркозом, забрать одну лету с помощью щипцов и поместите его в блюдце с PBS.
  3. Под рассекает сферу, щепотка хоботок щипцами, а затем отделить голову от тела разрыва шею, используя второй набор щипцов.
  4. Холдинг лететь головы от хоботок, разрезанные на половинки по левой / правой средней линии летать голову microscissors выявить мозга.
  5. Используйте кончик пипетки вырезать, чтобы забрать сетчатке, и трансфер второй скважины на 3-Ну стекло заполнено средой Шнайдер.
  6. Во-первых, удаляйте большинство из головы кутикулы, а затем удалить мозг щипцами. Держите сетчатки зажатой между пластинкой и роговицы.
  7. Далее, передача сетчатки на каплю (50 мкл) свежей среды Schnieder размещаются непосредственно на стекле.

2. Препарирование омматидии

  1. В зависимости от конечной целью вскрытия (как немедленной визуализации или культуры) и на оптику флуоресцентного микроскопа (прямой или инвертированный), этот шаг может иметь место либо на предметное стекло или в 24-луночного планшета. Для конечной целью этого вскрытия, омматидии будет расчлененный непосредственно на стекло.
  2. Возьмите любой самый спинной или нижним концом сетчатки щипцами. Использование microscissors, вырезать сетчатки пополам вдоль спины / вентральной срединной линии подвергать омматидиев в середине глаза.
  3. Продолжить понять сетчатки, что роговица вниз, а пластинка вверх. Использование тонкой иглой вольфрама, отделить омматидиев от пластинки и роговицы.
  4. Одноместный омматидиев и группы омматидиев будет собирать на дне колодца или слайд. Удалите все больше мусора, которые могут иметь собранные перед началом работы.

3. Лечение, окрашивания и обработки изображений

  1. Для анализа аутофагии, разбавленных 1:1000 Lysotracker в раскрывающемся Шнайдер (первый разбавленным 1:10 в Шнейдера, а затем добавить 0,5 мкл до падения на слайде), перемешайте и подождите 10 секунд.
  2. Удаление избыточной жидкости из слайдов, стараясь оставить омматидии позади. Это делается лучше всего с тонкой наконечником загрузке геля.
  3. Добавить каплю Vectashield для покрытия омматидиев, применять покровное и печать с nailpolish.

4. Представитель Результаты:

Хорошее исполнение протокола должны оставить число единичных омматидиев и малых групп омматидиев хранится вместе фрагментами пластинки, но красиво разделены на роговице стороны. Они могут быть отображены как в этом примере наглядно Atg8: GFP и Lysotracker, показывая autophagosomes, лизосомы и autophagolysosomes (рис. 3). Метод может быть использован для живого изображения, однако в этом случае следует отметить, что аутофлюоресценция среднего Шнайдера будет трудно отличить низкой интенсивности флуоресцентных сигналов. Дополнительного выпуска является то, что пигментные гранулы, которые остаются прикрепленными к фоторецепторов интенсивно люминесцентные, особенно в красном канале. Картина светлого может потребоваться, чтобы отличить их от подлинных органелл.

Рисунок 1
Рисунок 1. Блок-схема вскрытия процедура получения одного омматидия или небольшие группы омматидиев от летают сетчатки.

Рисунок 2
Рисунок 2. Возможные вариации простой протокол здесь описывать, которые включают летать генетики старения и вверх по течению от вскрытия и окрашивание или культивирование в течение 24 часов и введения препарата ниже по течению от вскрытия.

Рисунок 3
Рисунок 3 конфокальной проверки autophagosomes и лизосом в одном омматидия расчлененный от AW; GMR-Gal4, UAS-Atro75QN; UAS-GFP.:: Atg8 / + летают, выражая полиглутаминовых Atrophin мутанта и в возрасте 12 дней при температуре 29 ° C. Панель светлого (вверху справа) показывает почти нетронутыми структуры омматидия и кадров указывает сканируемой области. Красный знаки Лизосомы, зеленый autophagosomes, авто-лизосом, в результате чего в результате слияния двух органелл, появляются желтые. Стрелки указывают на двух текущих событий слияние autophagosomes и лизосомы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Одно рассечение омматидия представленные здесь коллекции позволяет более глубокой биологической ячейки информацию о процессах, как нейродегенеративные, когда моделируется в глазу дрозофилы. Фоторецепторных нейронов более доступной, чем в других нейронов и их цитоплазме особенно велик, и, таким образом подходящих для изучения динамики пузырька, в тот же клетки, используемые умело во многих моделях количественно нейродегенерации в естественных условиях. Важнейшим аспектом рассечение в основном способность выполнять его на нефиксированной ткани, которые никогда не должны подвергаться воздействию воздуха или пересыхают. Возможности для расширения этой базовой техники таковы (рис. 2), что он может, а революцию информацию, полученную от глаз модели нейродегенерации, что позволяет все виды манипуляций возможно в первичной культуре нейронов связаны с генетическими модификациями удивительные возможности в мух .

В сочетании с мозаичной техники, чрезвычайно полезны в нейродегенерации исследования 9 может позволить идентификации клеточных биологических изменений в определенное подмножество мутант омматидиев, в присутствии контроля веса с самого же летать.

Когда расчлененный омматидии хранятся в культуре, reponses к наркотикам, как рапамицин 10 или parquat 11 могут быть лучше контролируется и количественно, чем при введении живой мухи. Основным ограничением система состоит из времени жизни расчлененный омматидиев в области культуры, которые мы не смогли расширить далеко за 24 часов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Бернар Charroux для дискуссий. Эта работа финансировалась KCL биомедицинских школы.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Portable CO2 Dispenser Flystuff 59-150 Refills also available
DUMONT Tweezer No 5 Agar Scientific T5034
3-Well Glass Slide EMS 71561-01
Micro scissors VWR international HAMMHSB516-09
Schneider’s Medium VWR international 733-1663
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
Superfrost Slides VWR international 631-0108
Vectashield with Dapi Vector Laboratories H-1200
Coverslips VWR international 631-1336

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
  2. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  3. Nisoli, I. Neurodegeneration by polyglutamine Atrophin is not rescued by induction of autophagy. Cell Death Differ. 17, 1577-1587 (2010).
  4. Charroux, B., Fanto, M. The fine line between waste disposal and recycling: DRPLA fly models illustrate the importance of completing the autophagy cycle for rescuing neurodegeneration. Autophagy. 6, 667-669 (2010).
  5. Hardie, R. C. Voltage-sensitive potassium channels in Drosophila photoreceptors. J Neurosci. 11, 3079-3095 (1991).
  6. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24, 251-254 (2001).
  7. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
  8. Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Dev Biol. 351, 128-1234 (2011).
  9. Napoletano, F. Polyglutamine Atrophin provokes neurodegeneration in Drosophila by repressing fat. The EMBO journal. 30, 945-958 (2011).
  10. Ravikumar, B. Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nature. 36, 585-595 (2004).
  11. Zou, S., Meadows, S., Sharp, L., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genome-wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 13726-13731 (2000).
Единый<em> Drosophila</em> Омматидия Препарирование и обработка изображений
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Volpi, V., Mackay, D., Fanto, M. Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging. J. Vis. Exp. (54), e2882, doi:10.3791/2882 (2011).More

Volpi, V., Mackay, D., Fanto, M. Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging. J. Vis. Exp. (54), e2882, doi:10.3791/2882 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter