Summary
我们提供了一个从盐湖微生物席超高分子量DNA提取的改进协议。微生物细胞中分离DNA提取和纯化前的垫矩阵。这将增强的浓度，质量和大小的DNA。该协议可用于其他耐火材料样品。
Abstract
宏基因组数据的成功和准确的分析和解释是依赖于高品质，高相对分子质量（HMW）社会DNA的高效提取。然而，环境垫样品往往造成困难，取得大量高品质，高分子量DNA的浓度。盐湖微生物席含有高含量的胞外聚合物（EPS）和盐，可能会抑制提取的DNA的下游应用。直接和严厉的方法经常被用来从难治性样本中的DNA提取。这些方法通常是因为EPS垫，胶粘剂基质，在直接裂解结合的DNA 2,3。严厉的提取方法，DNA为4,5,6小尺寸变得支离破碎。
的DNA，从而变得不适合大插入载体克隆。为了规避这些限制，我们报告一个改进的方法提取高分子量DNA质量好，数量从盐湖微生物席。我们采用一种间接的方法，涉及从微生物细胞通过混合和差速离心背景垫矩阵分离。使用的机械和化学程序的组合，从提取的微生物细胞的DNA提取和纯化。我们的协议，产量约2微克每克垫样品高分子量DNA（35-50 KB）， 与 A 260/280 1.6的比例。此外，扩增16S rRNA基因7表明，该协议是能够最大限度地减少或消除污染物的任何抑制作用。我们的研究结果提供了一个功能的宏基因组研究的微生物席的HMW DNA提取适当的方法和可能适用于其他环境样品，从DNA的提取是具有挑战性的的。
Protocol
1。微生物细胞提取：
- 彻底混合，均质，用无菌磨杵的微生物席。放置约30克（湿重）到无菌容器华林搅拌器匀浆垫材料约100毫升1 M氯化钠（或样品在使用特定的浓度），添加，并混合1分钟，以中等速度的三倍在-20℃冷冻1分钟的间歇冷却。转移到250 mL离心瓶的水泥浆和1 M氯化钠填补其余的空量。 NaCl溶液中，并准备在灭菌去离子水过滤消毒。
- 进一步逐出晃动在室温下用30分钟vortexer（涡精灵R 2的）（150转）从基质中的微生物细胞。
- 在低速离心机（500X克）在4 ° C 15分钟轻轻地转移到一个烧瓶中，以最小的干扰沉积物上清。
- 使用颗粒泥沙，重复融合和步骤，此外，在步骤1.3结束每个泥沙沉淀新鲜氯化钠1.2和1.3四个额外的时间。从每个氯化钠提取上清液转移到一个新瓶中。
- 4节5号电池在200毫升分装在15分钟的高速（25000 XG）的提取和离心机结合上清° C。弃上清，重悬细胞沉淀在每10毫升2％的六偏磷酸钠，结合颗粒，并用2％的六偏磷酸钠容至200 ml。晃动在室温为30分钟（150转）洗细胞。在此步骤结束时，你应该只有一个细胞管进行下一步。
- 在4 ° C 15分钟高速离心（25000 XG）弃去上清液，重悬细胞沉淀的TE（50 mM的EDTA）200毫升，洗细胞晃动在室温为10分钟（150转）。
- 在高速离心15分钟，4（25000 XG）℃，弃上清，悬浮在15毫升TE（10毫米EDTA），并存储200μL分装在-80℃直到进行DNA提取所需要的。
2。 DNA提取和纯化：
- 添加200μL，5 M氯化钠，200μL10％SDS，100μL，14.3中号β-巯基乙醇200μL微生物细胞等份。轻轻混匀反相4-6倍。
- 主题的混合物3轮冻融液氮浸2分钟后在65 ° C为5分钟的水浴解冻。延长最终解冻10分钟。
- 加入200μL的5个M醋酸钾（pH值5.5）和10分钟的冰地点。 XG离心机在10,000 10分钟，4℃，将上清转移到一个新的管使用大口径的枪头。添加3μL核糖核酸酶A和孵育37 ° C为1小时。
- 加入等体积的氯仿，摇匀简单颠倒，在15000 XG离心机在室温下10分钟。
- 小心地转移到一个新的管使用大口径的枪头上清的顶层。避免吸取白色接口层位于顶层和底层之间。重复氯仿萃取过程。
- 加入同等体积的冰鲜（在-20 ° C）的异丙醇上清，在冰上孵育30分钟沉淀DNA。
- （20800 XG）最大速度离心10分钟，4 ° C至颗粒的DNA。
- 1毫升的冷冻（-20℃）70％的乙醇弃掉上清，洗DNA沉淀。
- 最大速度（20800 XG）10分钟，4 ° C离心，弃上清液，重复10分钟70％的乙醇清洗，空气干燥DNA沉淀。重复70％的乙醇洗。
- 悬浮在25μLTE（10毫米EDTA）的DNA，温在65 ° C为5分钟，合并成一管，如果有多个管已使用，而且化妆体积500μLTE。
- 加入500μl冰冷的（或在4 ° C）20％聚乙二醇（PEG）（1.2 M氯化钠编制）。轻轻地反转，在冰上孵育10分钟的最高速度为10分钟，离心4 ° C混合沉淀DNA。取出并弃去上清液，用1毫升冷冻70％的乙醇，空气干燥10分钟沉淀DNA，并在30-50μLTE或分子级的水悬浮。由气候变暖促进再悬浮的DNA在65 ° C时，5分钟和商店的DNA -80 ° C。
3。 DNA的纯度，浓度和大小测定：
- 确定一个260/280和A 二百三分之二百六十零比使用Nanodrop 1000分光光度计或任何其他适当的仪器通过测量DNA的质量。
- 确定DNA的浓度，根据制造商的指示使用QUANT - dsDNA抗体检测试剂盒。
- 确定使用脉冲场凝胶电泳的DNA大小。准备用1％琼脂糖凝胶和使用0.5X TBE厨师映射的XA系统的下列参数; 0.35小号的初始开关时间，最后的切换时间的7.67小号，和120 °角为6.0 V / cm时梯度线性ř功放的因素。 30分钟的凝胶染色1 × SYBR GREEN我。负载之间700-1000 ng总DNA凝胶。见图。 3简明的形式为一个完整的协议。
代表性的成果：
细胞提取：
顺序微生物细胞提取物（上清）表明，提取物的浊度，提取增加的数量减少。这表明，在下面的每一个连续的细胞提取的细胞数量的减少。这里要注意的是，每个额外的细胞提取步骤污染物引进提供了机会，细胞提取的数量应尽量减少，最终使细胞沉淀是代表整体的微生物群落。其他来源的污染控制，通过采取适当的实验室无菌技术。例如，解决方案是准备在灭菌去离子水和过滤消毒。容器用酒精消毒，灭菌，紫外光照射下，紫外线交联剂治疗。
DNA的浓度和质量的决心：
一个260/280的比例为1.6，该协议产生高分子量DNA（35-50）（图4）约2微克每克垫样品和A 二百三十〇分之二百六十○0.7的比例（见表1） 。虽然出现了一个二百三十分之二百六比例要低，没有抑制下游分子为基础的应用程序，如在另一项研究中 7中观察到的16S rRNA基因的PCR扩增。重要的是要注意从盐湖垫DNA有两个主要的污染来源; EPS和盐。因此，这些污染物的痕迹，尽管作出了巨大努力，以减少对下游应用的影响可能会影响的一个二百三十分之二百六十零比率。
DNA大小的决心：
脉冲场凝胶电泳在DNA检查，如在图3所示的间歇性定向交换机采用了脉动电流流。我们的协议产生了一个约35-50 kb的高分子量的DNA。虽然一些DNA的大小可能会小于30 KB，重要的是要涂抹上述35 KB fosmid克隆〜40 kb的DNA插入和较大的DNA片段，提供了更大的获得完整的生物合成途径的一部分。在我们的研究中，上述35 KB的DNA涂抹被切除大型插入载体克隆和其他分子应用纯化。
图1。盐湖微生物垫采样点（大池）位于伊柳塞拉，巴哈马。
图2：横截面在这项研究中所使用的高盐度的微生物垫。从伊柳塞拉，巴哈马位于盐湖池塘微生物垫。
（三）涉及微生物细胞提取细胞裂解液，提取，和宏基因组DNA的纯化过程示意图代表性。点击这里查看一个较大的图像。
图4。使用脉冲场凝胶电泳对提取的DNA分子量表征。巷M是一种高分子量的标记，泳道1和2的宏基因组DNA的提取使用上述协议的伊柳塞拉盐湖垫复制。
| 提取方法 | 浓度纳克/克 | 一个260/280 | 一个二百三分之二百六十〇 | |
| 聚乙二醇 | 精华1 | 1806.1 | 1.64 | 0.76 |
| 精华2 | 2010.8 | 1.61 | 0.75 |
表1。提取的DNA的浓度和质量的测量微生物盐湖垫。
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Discussion
鉴于总细胞去除复杂和高度多样化的微生物垫样品是不实际的，首要关注的是如何提取的细胞代表的整体微生物垫界。在以前的研究中，微生物16S rRNA基因的PCR - DGGE技术分析显示，5个细胞去除在本议定书中所使用的步骤提取细胞，微生物席的整体社会7代表。细胞提取的实际步骤，需要提供一个整体的微生物群落的代表可能会改变取决于样品类型的细胞沉淀。对于不同样品的最佳协议发展，一个小规模的试点研究建议，其中回收的微生物丰富的实证检验后，每个细胞提取的步骤是比较丰富的原社会。
Fosmid克隆需要HWM的DNA克隆库建设8 35-40 KB。我们的协议取得了35-50 KB（图4）大小不等的DNA，并已成功用于生成一个fosmid基于宏基因组库（未公布结果）。 〜23 KB 4产生的EPS生产的海洋细菌的DNA提取使用的其他协议。大的DNA片段在功能的宏基因组研究，提供更多的机会获得广泛的编码基因生物合成途径以及 9,10功能的行为。因此，高分子量的DNA是宏基因组研究的一个重要要求。从环境样品中产生的大量插入宏基因组库，发现新的生物合成途径，可能会导致新基因的发现将增加机会。该协议可用于从其他耐火材料环境样品中提取DNA。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国家科学基金会环境基因组计划（批准号：EF - 0723707）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega Corp. | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre Biotechnologies | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | VWR | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Millipore | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP Inc. | ||
| Waring blender | Waring Laboratory | LB10S |
References
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