Summary
Wij bieden een verbeterde protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht DNA van hypersaline microbiële matten. Microbiële cellen worden gescheiden van de mat matrix voorafgaand aan de DNA-extractie en zuivering. Dit verhoogt de concentratie, de kwaliteit en de grootte van het DNA. Het protocol kan worden gebruikt voor andere vuurvaste monsters.
Abstract
Succesvolle en nauwkeurige analyse en interpretatie van metagenomic gegevens is afhankelijk van de efficiënte afzuiging van hoge kwaliteit, hoge moleculair gewicht (HMW) gemeenschap DNA. Echter, het milieu mat monsters nogal eens voor problemen op het verkrijgen van grote concentraties van hoge kwaliteit, HMW DNA. Hypersaline microbiële matten bevatten grote hoeveelheden extracellulaire polymere stoffen (EPS), een en zouten die kan remmen afgeleide toepassingen van de geëxtraheerde DNA. Direct en harde methoden worden vaak gebruikt in de DNA-extractie van vuurvaste monsters. Deze methoden worden vaak gebruikt omdat de winst per aandeel in matten, een klevende matrix, bindt DNA 2,3 in de directe lysis. Als gevolg van de hardere extractiemethoden, DNA gefragmenteerd raakt in kleine maten 4,5,6.
Het DNA wordt dus niet geschikt voor grote-insert vector klonen. Om deze beperkingen te omzeilen, hebben we een verslag van een verbeterde methodologie voor HMW DNA van goede kwaliteit en kwantiteit van hypersaline microbiële matten extract. We gebruikten een indirecte methode waarbij de scheiding van microbiële cellen van de achtergrond mat matrix door middel van het mengen en het differentieel centrifugeren. Een combinatie van mechanische en chemische procedures werd gebruikt om DNA extraheren en te zuiveren van de uitgepakte microbiële cellen. Ons protocol levert ongeveer 2 ug van HMW DNA (35-50 kb) per gram monster mat, met een A 260/280 ratio van 1,6. Bovendien is versterking van de 16S rRNA genen 7 suggereert dat het protocol in staat is te minimaliseren of te elimineren remmende effecten van verontreinigingen. Onze resultaten geven een geschikte methode voor de extractie van HMW DNA van microbiële matten voor functionele metagenomic studies en van toepassing kunnen zijn op andere milieu-monsters waaruit DNA-extractie is een uitdaging.
Protocol
1. Microbiële cel Extractie:
- Homogeniseren microbiële matten met een steriele malen stamper door het mengen grondig. Plaats ongeveer alle 30 g (nat gewicht) van gehomogeniseerd mat materiaal in steriele verpakking van de Waring blender, voeg ongeveer 100 ml 1 M NaCl (of een concentratie die specifiek zijn voor monster in gebruik) en mix drie keer op de middelste stand gedurende 1 minuut met intermitterende koeling in een -20 ° C vriezer voor 1 minuut. Breng de slurry in een 250 ml centrifuge fles en vul de resterende lege ruimte met 1 M NaCl. Bereid NaCl-oplossing in geautoclaveerd DI-water en filter steriliseren het.
- Verder los van de microbiële cellen van de matrix door schudden (150 rpm) met behulp van een vortexer (Vortex-Genie R 2) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer bij lage snelheid (500x g) gedurende 15 min bij 4 ° C. Voorzichtig overdracht het supernatant in een kolf met minimale verstoring van het sediment.
- Met behulp van het ingehulde sediment, herhaalt mengen en de stappen 1.2 en 1.3 nog vier maal met de toevoeging van verse NaCl aan elke sediment pellet aan het einde van stap 1.3. Het supernatant van elke NaCl extractie wordt overgebracht in een verse fles.
- Combineer de supernatanten van de 5 cel extracties en centrifuge in porties van 200 ml met hoge snelheid (25000 xg) gedurende 15 min bij 4 ° C. Gooi de supernatant, elke cel pellet opnieuw in suspensie in 10 ml van 2% natriumhexametafosfaat, combineren pellets en maken het volume tot 200 ml met 2% natriumhexametafosfaat. Was cellen door te schudden (150 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Aan het eind van deze stap moet u slechts een tube van cellen om door te gaan naar de volgende stap.
- Centrifugeer op hoge snelheid (25.000 xg) gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant, hersuspenderen celpellet in 200 ml van TE (50 mM EDTA), en was cellen door te schudden (150 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Centrifugeer op hoge snelheid (25.000 xg) gedurende 15 min bij 4 ° C, het supernatant, hersuspenderen in 15 ml TE (10 mM EDTA) weggooien, en op te slaan 200-pi monsters bij -80 ° C totdat ze nodig zijn voor DNA-extracties.
2. DNA-extractie en zuivering:
- Voeg 200 ul 5 M NaCl, 200 pi 10% SDS, en 100 ul 14,3 M β-mercapto-ethanol aan de 200-pi microbiële cel aliquot deel. Meng voorzichtig door het omkeren van 4-6 keer.
- Onder voorbehoud van het mengsel op drie rondes van vries-dooi door onderdompeling in vloeibare stikstof gedurende 2 minuten, gevolgd door ontdooien in een 65 ° C waterbad gedurende 5 minuten. Uit te breiden laatste ontdooien tot 10 minuten.
- Voeg 200 ul 5 M kaliumacetaat (pH 5,5) en de plaats op ijs gedurende 10 minuten. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C en breng het supernatant naar een nieuwe buis met behulp van een breed boring pipetpunt. Voeg 3 ul van RNase A en incubeer bij 37 ° C voor 1 uur.
- Voeg gelijk volume van chloroform, kort schudden door inversie, en centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
- Breng voorzichtig de bovenste laag van het supernatant in een nieuwe buis met behulp van een breed boring pipetpunt. Vermijd pipetteren de witte interface laag gelegen tussen de bovenste en onderste lagen. Herhaal de chloroform-extractie procedure.
- Voeg een gelijk volume van de gekoelde (bij -20 ° C) isopropanol aan het supernatant en incubeer op ijs gedurende 30 minuten voor het neerslaan van DNA.
- Centrifugeer bij max. snelheid (20800 xg) gedurende 10 min bij 4 ° C tot pellet DNA.
- Verwijder het supernatant en wassen DNA pellet met 1 ml gekoeld (bij -20 ° C) 70% ethanol.
- Centrifugeer bij max. snelheid (20800 xg) gedurende 10 min bij 4 ° C, gooi het supernatant, herhaal dan 70% ethanol wassen en drogen DNA pellet gedurende 10 minuten. Herhaal dit 70% ethanol te wassen.
- Resuspendeer DNA in 25 ul TE (10 mM EDTA), warm bij 65 ° C gedurende 5 minuten, te combineren in een buis als er meerdere buizen zijn gebruikt, en volume-up aan te brengen in 500 pi met TE.
- Voeg 500 ul ijskoud (of bij 4 ° C) 20% polyethyleenglycol (PEG) (opgesteld in 1,2 M NaCl). Meng voorzichtig door de inversie, incubeer op ijs gedurende 10 minuten en centrifugeer op maximale snelheid gedurende 10 min bij 4 ° C om pellet DNA. Verwijder de bovenstaande vloeistof en was het ingehulde DNA met een ml gekoelde 70% ethanol, drogen aan de lucht gedurende 10 min, en resuspendeer in 30-50 ul TE of moleculair-biologische kwaliteit water. Vergemakkelijken resuspensie van DNA door opwarming op 65 ° C gedurende 5 minuten en Store DNA bij -80 ° C.
3. DNA zuiverheid, concentratie en grootte bepalen:
- Bepaal DNA-kwaliteit door het meten van de A en A 260/280 260/230 ratio's met behulp van een Nanodrop 1000 spectrofotometer of andere geschikte instrumenten.
- Bepaal met behulp van DNA-concentratie Quant-iT dsDNA Assay kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Bepaal DNA grootte met behulp van pulse field gel elektroforese. Bereid 1% agarose gel met 0.5X TBE en gebruik de volgende parameters op de CHEF Mapper XA System; de eerste schakelaar tijd van 0,35 s, een laatste schakel tijd van 7,67 s en 120 ° ingesloten hoek voor een helling van 6,0 V / cm bij een lineaire ramping factor. Vlek gel met 1 x SYBR Green I gedurende 30 minuten. Belasting tussen 700-1000 ng totaal DNA op gel. Zie Fig. 3 voor een verkorte vorm van het volledige protocol.
Representatieve resultaten:
Cel-extractie:
Sequentiële microbiële cel extracten (supernatant) hebben aangetoond dat de troebelheid van extracten neemt af naarmate het aantal extracties te verhogen. Dit suggereert een vermindering van het aantal cellen na elke opeenvolgende cel extractie. Belangrijk om hier op te merken is dat als elke extra cel extractie stap biedt de mogelijkheid om verontreiniging introductie, het aantal van de cel extracties moet worden geminimaliseerd zodat de uiteindelijke celpellet is representatief voor de algehele microbiële gemeenschap. Andere bronnen van verontreiniging werden gecontroleerd door het aannemen van een adequate laboratorium steriele technieken. Zo werden de oplossingen bereid in geautoclaveerd DI-water en het filter gesteriliseerd. Containers werden gesteriliseerd met alcohol, autoclaaf, en behandelde onder UV-licht en ultraviolet crosslinker.
DNA-concentratie en kwaliteit bepalen:
Het protocol leverde ongeveer 2 pg van HMW DNA (35-50 kb) (afb. 4) per gram van de mat monster met een A 260/280 verhouding van 1,6, en een A 260/230 verhouding van 0,7 (Tabel 1). Hoewel de A 260/230 verhouding bleek te laag, geen remming van downstream moleculair-gebaseerde toepassing, zoals PCR-amplificatie van het 16S rRNA genen werd waargenomen in een aparte studie 7. Het is belangrijk op te merken dat DNA van hypersaline matten heeft twee belangrijke bronnen van verontreiniging, EPS en zouten. Het is dus mogelijk dat sporen van deze verontreinigingen kan de A 260/230 ratio's kunnen beïnvloeden, ondanks de enorme inspanningen om hun effecten op de downstream-toepassingen te verminderen.
DNA-size bepaling:
Pulse field gel elektroforese maakt gebruik van een pulserende stroom met intermitterende directionele switches wat resulteert in een DNA-uitstrijkje zoals weergegeven in figuur 3. Ons protocol leverde een HMW DNA van ongeveer 35 tot 50 kb. Terwijl sommige DNA grootte kleiner kan zijn dan 30 kb, is het belangrijk om een deel van het uitstrijkje boven de 35 kb gezien het feit dat fosmid klonen ~ 40 kb DNA inserts vereist en een grotere DNA-fragmenten zorgen voor een grotere toegang tot intact biosynthesewegen. In onze studies werd de DNA-uitstrijkje boven de 35 kb uitgesneden en gezuiverd voor grote-insert vector klonen en andere moleculaire toepassingen.
Figuur 1. Hypersaline microbiële mat bemonstering site (Big Pond) op Eleuthera, de Bahama's.
Figuur 2. Een dwarsdoorsnede van de extreem zoute microbiële mat gebruikt in deze studie. De microbiële mat werd verkregen uit een extreem zoute vijver gelegen aan Eleuthera, de Bahama's.
Figuur 3. Schematische weergave van de procedures die betrokken zijn bij microbiële cel extractie, cellysis, extractie en zuivering van metagenomic DNA. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Moleculair gewicht karakterisatie van geëxtraheerde DNA met behulp van pulse field gel elektroforese. Lane M is een HMW marker, en lanen 1 en 2 zijn herhalingen van metagenomic DNA geëxtraheerd uit de Eleuthera hypersaline mat met behulp van de bovenstaande protocol.
| Extractiemethode | Concentratie ng / g | Een 260/280 | Een 260/230 | |
| PEG | Rep 1 | 1806.1 | 1.64 | 0.76 |
| Rep 2 | 2010.8 | 1.61 | 0.75 |
Tabel 1. Meting van de concentratie en de kwaliteit van het DNA geëxtraheerd uit microbiële hypersaline mat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gezien het feit dat de totale cel verwijdering uit complex en zeer diverse microbiële mat monsters niet praktisch is, de primaire zorg is hoe goed de uitgepakte de cellen van het totale microbiële mat gemeenschap te vertegenwoordigen. In een eerdere studie, PCR-DGGE analyse van microbiële 16S rRNA genen toonde aan dat de vijf cel verwijderen van de stappen in dit protocol gebruikte cellen die representatief zijn voor de totale microbiële mat gemeenschap 7 extracten. Het werkelijke aantal cel-extractie stappen die nodig zijn om een cel pellet die representatief is voor de totale microbiële gemeenschap zal waarschijnlijk veranderen afhankelijk van het type monster te bieden. Voor een optimale protocol ontwikkelen voor de verschillende monsters, is een kleinschalige pilot-studie werd aanbevolen, waarin empirisch testen van de herstelde microbiële rijkdom na elke cel extractie stap is in vergelijking met de rijkdom van de oorspronkelijke gemeenschap.
Fosmid het klonen van DNA vereist HWM van 35-40 kb voor de kloon bibliotheek constructie 8. Ons protocol leverde DNA met maten variërend 35 tot 50 kb (afb. 4) en werd met succes gebruikt om een fosmid-based metagenomic bibliotheek (niet gepubliceerde resultaten) te genereren. Andere protocollen die worden gebruikt in de DNA-extractie van EPS-producerende mariene bacteriën leverde ~ 23 KB 4. In functionele metagenomic studies, grote DNA-fragmenten zorgen voor een grotere toegang tot een breed scala van genen die coderen voor biosynthesewegen als voor functionele gedrag 9,10. Zo, HMW DNA is een belangrijke voorwaarde voor metagenomic studies. Het genereren van grote-insert metagenomic bibliotheken van milieu-monsters zal de kansen van het ontdekken van nieuwe biosynthetische routes die kunnen leiden tot de ontdekking van nieuwe genen. Dit protocol kan worden gebruikt om DNA halen uit andere vuurvaste milieu monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation Environmental Program Genomics (Grant No EF-0723707).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Promega Corp. | V3011 | 20% in 1.2 M NaCl |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | Fisher Scientific | |
| Quant-iT dsDNA Assay kit | Invitrogen | Q33130 | |
| RNase | Epicentre Biotechnologies | MRNA092 | |
| Sodium Chloride | VWR | BDH8014 | Appropriate conc. |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | 03-500-509 | 10% in water |
| sodium hexametaphosphate | EMD Millipore | SX0583-3 | 2% in water |
| TBE | Fisher Scientific | BP1333-1 | |
| CHEF Mapper XA System | Bio-Rad | 170-3670 | |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ND-1000 | |
| Vortexer | Scientific Industries Inc. | ||
| Ultraviolet Crosslinker | UVP Inc. | ||
| Waring blender | Waring Laboratory | LB10S |
References
- Decho, A. W. Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).
- Dupraz, C., Visscher, P. T. Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats. Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).
- Steffan, R. J., Goksoyr, J., Boj, A. K., Atlas, R. M. Recovery of DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2908-2915 (1988).
- Lee, Y. K., Kim, H. W., Liu, C. L., Lee, H. K. A simple method for DNA extraction from marine bacteria that produce extracellular materials. J. Microbiol. Methods. 52, 245-250 (2003).
- Roose-Amsaleg, C. L., Garnier-Sillam, E., Harry, M. Extraction and Purification of Microbial DNA from Soil and Sediment Samples. Appl. Soil Ecol. 18, 47-60 (2001).
- de Lipthay, J. R., Enzinger, C., Johnsen, K., Aamand, J., Sørensen, S. J. Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gel electrophoresis. Soil Biol. Biochem. 36, 1607-1614 (2004).
- Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats. Biotechniques. 49, 631-640 (2010).
- Kakirde, S. K., Parsley, L. C., Liles, M. R. Size does matter: Application-driven approaches for soil metagenomics. Soil Biology & Biochemistry. 42, 1911-1923 (2010).
- Rodon, M. R., August, P. R., Bettermann, A. D., Brady, S. F., Grossman, T. H., Liles, M. R., Loiacono, K. A., Lynch, B. A., MacNeil, I. A., Minor, C., Tiong, C. L., Gilman, M., Osburne, M. S., Clardy, J., Handelsman, J., Goodman, R. M. Cloning the Soil Metagenomic: A Strategy for Accessing the Genetic and Functional Diversity of Uncultured Microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 66, 2541-2547 (2000).
- Beja, O., Aravind, L., Koonin, E. V., Suzuki, M. T., Hadd, A., Nguyen, L. P., Jovanovich, S. B., Gates, C. M., Feldman, R. A., Spudich, J. L., Spudich, E. N., DeLong, E. F. Bacterial Rhodopsin: Evidence for a New Type of Phototrophy in the Sea. Science. 289, 1902-1906 (2000).
