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Immunology and Infection

베로 세포 배양 분석하여 필드 수집 모기에서 감염성 바이러스의 검출

Published: June 9, 2011 doi: 10.3791/2889
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Center for Vector Biology and Zoonotic Diseases, Department of Environmental Sciences, The Connecticut Agricultural Experiment Station

Summary

우리는 처리 방법을 설명하고 화면의 필드 수집 베로 세포 배양 분석에 의해 바이러스의 다양성을 위해 모기. 이 기술을 채용함으로써, 우리는 코네티컷에서 수집한 모기 4 taxonomic 가정에서 9 가지 바이러스를 감지했습니다.

Abstract

모기는 웨스트 나일 바이러스, 뎅그열 바이러스 및 chickungunya 바이러스와 같은 중요한 인간 병원균을 포함하여 별개의 바이러스의 숫자를 전송. 이 바이러스의 대부분은 자신의 발병 범위의 강화와 새로운 영역을 확장, 이러한 위협에 대응하는 효과적인 감시 및 제어 프로그램을 necessitating 있습니다. 바이러스 활동을 모니터링하는 한 가지 전략은 발병 사이트 모기의 대규모 번호를 수집하고 바이러스 감염을 테스트 포함됩니다. 이 문서에서는, 우리는 처리하는 방법을 과정을 설명하고, 베로 세포 배양 분석하여 전염성 바이러스에 모기를 현장 수집 화면. 모기가 트랩 위치와 수종별로 분류하고, ≤ 50 개인가 들어있는 수영장으로 분류됩니다. 풀링 표본은 믹서 - 공장 및 수성 단계가 합류 베로 세포 배양 (복제 E6)에 주사됩니다를 사용하여 버퍼 호수에 균질하고 있습니다. 세포 배양은 3-7 이후 접종 및 세포 배양 재배 바이러스가 적절한 진단 assays에 의해 식별됩니다 시절부터 cytopathic 효과에 대한 모니터링입니다. 이 방법을 이용하여, 우리는 코네티컷, 미국에서 수집한 모기에서 9 가지 바이러스를 격리 있고,이 중에서 5 인​​간의 질병을 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 바이러스의 세 (웨스트 나일 바이러스, 포토 바이러스와 라 크로스 바이러스) 북미 또는 1999 년 이후 뉴잉글랜드 지역에 대한 새로운 기록을 나타냅니다. 바이러스의 광범위한 다양성을 감지하는 능력은 모두 모기가 인구에 설립하고 최근 새로운 바이러스 모니터링하는 것이 중요합니다.

Protocol

1. 모기 분류 및 식별

  1. 다음 절차는 라이브 모기와 함께 작동하도록 훈련 직원 전용 biosafety 레벨 2 (BSL - 2) 실험실에서 열린 실험실 벤치에서 수행됩니다. "차가운 체인은"절차를 통해 유지됩니다.
  2. 5 분 -20 °의 냉장고 안에 모기 수집 봉투를 배치하여 성인 모기에 살고 마취. 드라이 아이스가 들어있는 절연 컨테이너로 전송 수거 봉투. 뚜껑을 닫고 노크 다운 완료 확인으로 1-3 분 탄소 이산화탄소로 모기를 노출.
  3. 드라이 아이스의 침대에 배치 미리 차게 냄비에 anesthetized 모기를 누릅니다. 좋은 포셉 및 플라스틱 부분 컵에서 개최를 사용하여 별도의 개별 여성 모기. 서부 유럽 표준시 얼음 덮개 및 장소 컵을 함께 커버.
  4. 스테레오 해부 현미경 (10 - 60X 줌)의 도움으로 외부 모기 형태에 따라 설명 taxonomic 키를 사용하여 수종으로 모기를 적어 전자 진정 테이블에 장착.
  5. 구리 BB를 포함하는 두 ML 스냅 캡 튜브 안에 ≤ 50 개인 수영장에 모기 종을 확인 결합합니다. 튜브는 고유 식별자로 표시됩니다.
  6. 모든 모기의 식별 다음, 유리병이 표시 봉지에 배치하고 드라이 아이스가 들어있는 스티로폼 쿨러에서 개최.
  7. 바이러스 검사 전까지 -80 ° C 냉동고에 모기 풀을 저장합니다.

2. 모기로부터 바이러스를 분리하기 위해 Biosafety 고려 사항

  1. 다음 절차는 억제 1이 수준에서 작동하도록 훈련 직원에 의해 biosafety 레벨 3 (BSL - 3) 실험실에서 수행됩니다. 연구소 시설, 장비, 절차 및 관행, 제도적 주, 그리고 연방 정부 감독 및 검사에 따라 달라질 수 있습니다. 다음과 같은 프로토콜을 시도하기 전에 적절한 교육 및 승인을 추구합니다.
  2. 일회용 가운, 장갑, 얼굴 방패, 그리고 호흡기 등 각 절차에 대해 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오.
  3. 작성 절차 이전과 이후 70 %의 알코올로 작업 표면을 소독.
  4. 세포 문화와 잠재적으로 전염성이 자료는 클래스 II biosafety 캐비닛 (BSC)에 처리됩니다.
  5. 모기 수영장은 BSC 안에있는 믹서 - 공장에서 균질하고 있습니다.
  6. 모기 homogenates는 에어로졸 - 꽉 microcentrifuge에 centrifuged 있습니다. 이 절차는 BSC 내에 수행할 수없는 경우에는 원심에서 샘플을 운영하고 검색할 때 연산자는 인공 호흡기를 착용해야합니다.
  7. Pipets과 BSC (biosafety 캐비닛)의 자료를 처리 pipet 팁 전에 autoclaving 10 %의 표백제에 배어있다. 모든 실험실 폐기물은 처리하기 전에 autoclaving하여 소독합니다.

3. 베로 세포의 준비

  1. 표백제를 포함하는 폐기물의 비커에 합류 베로 세포 (클론 E6) 중 하나 큰 조직 문화 플라스크 (175cm 2)에서 가만히 따르다 문화 미디어.
  2. 5 ML의 PBS의 나누어지는과 세포의 층 이상의 철저하게 전체 monolayer를 커버해야하고 플라스크의 면을 따라 소용돌이를 추가하여 베로 세포를 씻으십시오.
  3. 폐기물 비커에 가만히 따르다 PBS.
  4. 2.5 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) ML 철저 전체 monolayer를 커버해야하는 세포의 층 이상의 소용돌이를 추가합니다.
  5. 37 5 분 배양기에서 술병을 품어 ° C, 5 % CO 2.
  6. 천천히 바닥 표면의 세포를 제거하는 흔들 소용돌이 술병. 세포는 쉽게 밀어해야한다 세포가 쉽게 밀어하지 않으면 추가 1~5분을 품어.
  7. 5 최소 에센셜 미디어 ML (멤) 5 % 태아 소 혈청 (FBS), serological pipet을 사용하고 pipet 추가 위쪽 및 다운 세포의 대단히 짧은 시간을 해산시키기 위해 평균의 10 배에서 20 배를.
  8. 22.5 ML 총 볼륨에 대한 추가 15 ML 멤 5 % FBS를 추가하고 잘 섞는다.
  9. 직립이 랙 (20 flasks / 랙)에 넣어 40 작은 조직 문화 flasks (25cm 2).
  10. biosafety 캐비닛 내부 flasks가 들어있는 랙에를 놓고 직접 flasks 앞에서 모자를 배​​치, 플라스크의 뚜껑을 제거합니다.
  11. serological pipet을 사용하여 각 플라스크에 멤 5 % FBS 4 ML 하는걸.
  12. 각 플라스크 (~ 1시 6분 분할 비율) 플라스크의 뚜껑을 교체로 0.5 ML 정지 세포를 분배.
  13. 나머지 세포 현탁액 (~ 2.5 MLS)를 포함하는 원래 큰 조직 문화 플라스크로 5 % FBS를 멤 50 ML를 추가하고 배양기에 술병을 반환합니다. 같은 큰 조직 문화 플라스크 5 구절까지 다시 사용할 수 있습니다 그리고 새로운 플라스크 그것을 대체하는 설정해야합니다.
  14. 플레이스 작은 조직 문화는 트레이에 스택에 flasks. 미디어 균일 flaks의 바닥을 커버 있는지 확인 소용돌이 트레이.
  15. 37 보육 작은 flasks를 삽입 ° C, 5 % CO 2 80~90%의 합류하기 전까지 밤새 성장.

4. 모기 수영장의 준비

  1. 시험 절차 동안 모기 수영장 감기 유지. 사전 냉장 사용냉동고 랙에 및 믹서 - 밀 카세트, 얼음처럼 차가운 시약 및 냉장 원심 분리기 모기 수영장 처리.
  2. 플레이스 튜브는 미리 냉장 냉동고 걸이에 모기가 포함된 추가 1 - 1.5 ML PBS - G를 모기 각 튜브 수 있습니다.
  3. 냉동고에서 믹서 - 밀 카세트를 검색합니다. 믹서 - 공장에서 안전하게 다음 각 카세트로 24 튜브를 삽입합니다.
  4. 25 사이클 / 초 4 분 동안 샘플을 균질. 믹서 밀 모기 조직을 방해 각 관 내부에 고속 및 금속 BB에서 튜브를 쉐이크.
  5. 7,000 RPM 6 분 튜브를 원심 분리기.
  6. 다시 냉동실 랙에에 플레이스 튜브는 베로 세포에 주사까지.

5. 모기 수영장 homogenates와 베로 세포의 접종

  1. 적절한 confluency과 세포의 건강을 보장하기 위해 거꾸로 현미경으로 각 시리즈에서 하나 이상의 조직 문화 플라스크를 확인, 80~90% 보도에 대해 기대하고 있습니다.
  2. 서 각 모기 수영장에서 해당 가입 번호와 랙 및 레이블 flasks 20 작은 조직 문화 flasks합니다.
  3. 모자 및 폐기물 비커에 조직 문화 flasks에서 미디어를 가만히 따르다 대부분을 풀어. 완전히 외투 세포 monolayer에 술병 충분한 미디어를 둡니다.
  4. 해당 조직 문화 플라스크에 각각의 처리 모기 수영장에서 뜨는의 나누어지는의 100μL.
  5. 교체 및 문화 술병 뚜껑을 조입니다.
  6. 35-40 RPM에서 5 분 (실온)에 대한 쉐이크에 문화 flasks는 평평하다.
  7. BSC의 랙과 장소에 수직으로 위치 20 조직 문화 flasks를 반환합니다.
  8. 한 번에 세 조직 문화 flasks을 Uncapping, serological 피펫을 사용하여 각 플라스크에 4 ML 성장 미디어를 분배, 모자를 교체하십시오.
  9. 피펫 팁의 문화 술병 넥이나 입술에 문의하지 있는지 확인하십시오. 연락이 술병으로 만든 경우 필요에 따라 피펫 팁을 변경합니다.
  10. 37 품어 조직 문화 flasks ° C 5 % CO 2.

6. 바이러스 성장 베로 세포 검사

  1. 화면 3-7일 이후 접종에서 바이러스 감염의 징후, cytopathic 효과 (CPE)에 대한 조직 문화 flasks을 주사.
  2. 시각 틸팅 flasks로 CPE 및 / 또는 오염 물질에 대한 세포 문화를 검사하고 미디어를 검사 술병의 하단에있는 수영장. 세포 CPE 동안 저하 또는 효모, 균류, 또는 세균 오염의 증가로 인해 같은 미디어 뿌연 나타납니다.
  3. 거꾸로 현미경 흐림 미디어를 전시 셀 문화를 다시 확인합니다. 바이러스는 세포가 변형되기와 문화 flasks에서 풀어 휴식합니다 발생할 것입니다. 눈에 보이는 오염 물질, 예를 들어 효모, 다른 박테리아, 균류 또는 무거운 모기 부스러기와 세포 문화는 0.22μM 주사기 필터를 통해 원래 모기 풀을 통과하여 다시 테스트합니다.
  4. 무균 serological 피펫을 사용하여 레이블 cryotubes에 바이러스 양성 세포 배양에서 미디어 1-2 MLS 하는걸.
  5. 바이러스 문화가 -80에 저장됩니다 ° C 적절한 진단 assays를 사용하여 확인하기 전까지.

7. 시약의 준비

  1. 멤 5 % FBS. DD H 2 0 4 패의 최종 볼륨 가루 멤의 37.6 g을 디졸브. 미디어 병 및 압력솥 500 ML aliquots에 솔루션을 분배. 솔루션 냉각되면, 무균 각 병 26 ML 열 - inactivated 태아 소 혈청, 5.2 ML L - 글루타민, 5.2 ML의 anti-biotic/mycotic, 그리고 10.4 ML 7.5 % 나트륨 중탄산염를 추가합니다. 4 스토어 ° C.
  2. PBS - G. 16g NaCl, 0.4 g KCl 2.3 g 나 2 HPO 4 0.4 g KH 2 PO 4, 0.5 % 페놀 레드의 4 ML 1000 ML DD H 2 0으로를 해산. 2 N NaOH (필요한 경우)을 7.1-7.4로 산도를 조정합니다. 별도의 비이커에서 물에 H 2 0 열 600 ML. 핫 플레이트에서 제거, 10g 젤라틴을 추가하고, 디졸브. PBS 용액에 녹아 젤라틴 솔루션을 추가하고 DD H 2 O. 2 L로 최종 음량을 조절 병 및 압력솥으로 솔루션의 100 ML 하는걸. 솔루션 냉각되면, 무균 42.8 ML 열 inactivated 토끼 혈청과 1.4 ML의 anti-biotic/mycotic를 추가합니다. 4 스토어 ° C.
  3. PBS 셀 씻으십시오. 400 ML DD H 2 O. 50 ML 10X Dulbecco의 PBS를 추가 2 N NaOH와 7.1 산도를 조정합니다. DD H 2 O. 500 ML에 마지막으로 볼륨을 조정 0.2uM 진공 필터 유닛으로 필터 솔루션입니다. 8 ML 나사 캡 튜브 5 ML aliquots로 분배. 4 스토어 ° C.

8. 대표 결과

4 taxonomic 가정에서 바이러스의 아홉 가지는 1997년에서 2010년까지 (표 1)에서 코네티컷에서 지속적인 감시를 통해 수집된 주 내의 모기로부터 복구되었습니다. 이러한 바이러스의 다섯 인간 질병, 웨스트 나일 바이러스와 동부 에콰인 뇌염 바이러스되고있는 가장 중요한 병원체를 일으키는 것으로 알려져 있습니다. 새로운 발견은 다음과 같습니다 수집 모기에서 WNV의 첫 절연을1999 2 북미, 2005 4 2000 3 북동부 미국의 포토 바이러스 첫 분리 및 뉴잉글랜드에 라 크로스 바이러스의 첫 고립.

바이러스 가족 번호 격리 번호 위치 번호 년이 감지 인간 질병 심판.
웨스트 나일 바이러스 Flaviviridae 1002 94 12 심한, 발열, 뇌염을 검토 2,5
동부 에콰인 뇌염 바이러스 Togaviridae 292 41 10 심한, 뇌염 6,7
히글란즈 J 바이러스 Togaviridae 178 39 11 알 수없는 6
제임스 타운 캐년 바이러스 Bunyaviridae 305 74 14 중간에 가벼운, 발열, 수막염 8
포토 바이러스 Bunyaviridae 259 76 4 알 수없는 3
캐쉬 밸리 바이러스 Bunyaviridae 114 51 8 이 문서의 경우 심한, 발열, 신경 질환에 약한
Trivittatus 바이러스 Bunyaviridae 83 21 11 알 수없는
라 크로스 바이러스 Bunyaviridae 1 1 1 심각한, 뇌염을 검토 4
플랜더스 바이러스 Rhabdoviridae 4 4 2 알 수없는

표 1. 바이러스는 베로 세포 배양 분석하여 현장 수집 모기에서 발견했습니다. 모기는 1997년부터 2010년까지에서 코네티컷에있는 주 내의 감시 수집된되었습니다.

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Discussion

베로 세포 배양 분석은 바이러스의 다양성을위한 화면 필드 수집 모기에 효과적인 방법으로 제공하고 있습니다. 이것은 구체적으로 목표 하나 또는 관심있는 몇 가지 바이러스 분자 방법 대조를 이룹니다. 또한, 우리는 베로 세포 배양 분석이 똑같이 RT - PCR 7보다 민감한 경우가 아니므로 미래 연구를위한 참조 컬렉션에 저장된 바이러스 격리 우리에게 제공하는 것으로 나타났습니다. 그럼에도 불구하고, 세포 배양 시스템은 많은 경우에 적합하지 않을 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 추가적인 비용과 BSL - 3 실험실에서 바이러스를 성장하는 데 필요한 훈련을 incurs 있지만, 이러한 비용은 세포 배양에 대해 상대적으로 저렴한 공급에 의해 상쇄 수 있습니다. 그것은 또한 대부분의 전부는 아니지만 모기가 전파되는 바이러스가 베로 세포 배양 9,10의 CPE를 생산 협조할 것입니다. 뎅그열 바이러스는 다른 진단 검사에 의해 검사를해야 하나 주목할만한 예외입니다. 이상적으로, 분자 및 세포 모두 문화 방식의 조합은 바이러스 감염 검사하는 데 사용됩니다. 현재 세포 배양에서 분리된 바이러스를 식별하고, 모기 수영장에서 감염을 재확인하기 위해 시퀀싱과 함께 때로는 종래와 양적 RT - PCR의 assays 4,11,12를 사용하고 있습니다.

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Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

우리는 기꺼이 DRS의 중요한 기여를 인정합니다. 존 앤더슨, 앤드류 메인이 공부 셜리 티렐. 이 작품은 질병 통제 및 예방 (U50/CCU116806-01-1)와 농업의 미국학과 (58-6615-1-218, CONH00768 및 CONH00773)의 센터에서 교부금에 의해 부분적으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies 16140
Anti-biotic/mycotic GIBCO, by Life Technologies 15240
Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. GIBCO, by Life Technologies 25080
L-Glutamine 200mM 100x GIBCO, by Life Technologies 25030
Powdered minimal essential medium (MEM) GIBCO, by Life Technologies 11700
10X Dulbecco’s PBS GIBCO, by Life Technologies 14080
Trypsin-EDTA GIBCO, by Life Technologies 15400
Rabbit serum GIBCO, by Life Technologies 16120
Vero Cells (Clone E6) ATCC CRL-1586
Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 Falcon BD 353112
Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 Falcon BD 353108
Copper-coated BB’s, 4.5 mm Crosman 0767
Mixer Mill Retsch MM300
Isopack freezer racks Eppendorf 022510240

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References

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면역학 제 52 모기 매개로 바이러스 모기 세포 배양 감시
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Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Finan, S. L., Shepard, J. J., Thomas, M. C. Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay. J. Vis. Exp. (52), e2889, doi:10.3791/2889 (2011).

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