Summary
Se describe un método para procesar y la pantalla de campo recogidos mosquitos para una diversidad de virus mediante el ensayo de cultivo de células Vero. Mediante el empleo de esta técnica, hemos detectado nueve virus distintos de 4 familias taxonómicas de mosquitos recogidos en Connecticut.
Abstract
Los mosquitos transmiten una serie de virus distintos incluyendo importantes patógenos humanos, tales como virus del Nilo Occidental, el virus del dengue y el virus de chickungunya. Muchos de estos virus se han intensificado en sus rangos endémica y se expandió a nuevos territorios, que requieren de programas efectivos de vigilancia y control para responder a estas amenazas. Una estrategia para controlar la actividad del virus consiste en recolectar una gran cantidad de mosquitos de los sitios endémicos y ponerlos a prueba para la infección viral. En este artículo se describe cómo manipular, transformar, y la pantalla de campo recogidos por los mosquitos del virus infeccioso por el ensayo de cultivo de células Vero. Los mosquitos son ordenados por ubicación trampa y especies, y se agrupan en las piscinas que contienen ≤ 50 personas. Muestras agrupadas se homogeneizan en solución salina usando un mezclador de molino y la fase acuosa se inocula en cultivos de células Vero confluentes (clon E6). Los cultivos celulares son monitoreados por efecto citopático a partir de 3-7 días después de la inoculación y cualquier tipo de virus en cultivos celulares son identificados por los ensayos de diagnóstico apropiadas. Mediante la utilización de este enfoque, hemos aislado nueve virus distintos de los mosquitos recolectados en Connecticut, EE.UU., y entre ellos, 5 son conocidos por causar enfermedades humanas. Tres de estos virus (virus del Nilo Occidental, el virus de Potosí y La Crosse virus) representan nuevos registros para América del Norte o de la región de Nueva Inglaterra desde 1999. La capacidad de detectar una amplia variedad de virus es fundamental para control establecidos y los virus de reciente aparición en la población de mosquitos.
Protocol
1. Mosquito clasificación e identificación
- Los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un banco de laboratorio abierto en una dedicada nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) de laboratorio por personal capacitado para trabajar con los mosquitos viven. Una "cadena de frío" se mantiene durante todo el procedimiento.
- Anestesiar a vivir los mosquitos adultos mediante la colocación de bolsa de recolección de mosquitos en un congelador de -20 º durante 5 minutos. Transferencia de bolsa de recolección de un recipiente aislado que contiene hielo seco. Cierre la tapa y exponer a los mosquitos a los de dióxido de carbono durante 1-3 minutos para asegurar la completa precipitación.
- Toque mosquitos anestesiados en una sartén previamente enfriado colocado sobre una cama de hielo seco. Separado los mosquitos individuales femeninos con unas pinzas finas y colóquelas en tazas de parte de plástico. Cubrir con tazas de tapa y coloque en hielo.
- Identificar los mosquitos de las especies mediante claves taxonómicas descriptivo basado en la morfología externa de mosquitos con la ayuda de un microscopio de disección estéreo (10-60X de zoom) montado sobre una mesa chill electrónico.
- Combine identificado especies de mosquitos en las piscinas de ≤ 50 personas en 2 ml tapa complemento viales que contienen una BB de cobre. Los viales están etiquetados con un identificador único.
- Tras la identificación de todos los mosquitos, los viales se colocan en bolsas etiquetadas y se mantiene en un refrigerador de espuma de poliestireno que contengan hielo seco.
- Tienda de criaderos de mosquitos en un congelador -80 ° C hasta que las pruebas del virus.
2. Bioseguridad consideraciones de aislar el virus de los mosquitos
- Los siguientes procedimientos se llevan a cabo en una de bioseguridad de nivel 3 (BSL-3) por el personal de laboratorio que están capacitados para trabajar en este nivel de contención 1. Las instalaciones de laboratorio, equipos, procedimientos y prácticas están sujetas a la supervisión institucional, estatal y federal y la inspección. Buscar la formación adecuada y aprobación antes de intentar los siguientes protocolos.
- Use el equipo de protección personal (PPE) para cada procedimiento, tales como batas desechables, guantes, protectores faciales y respiradores.
- Desinfectar las superficies de trabajo con el 70% de alcohol antes y después de completar los procedimientos.
- Cultivos celulares y el material potencialmente infeccioso se manejan en un gabinete de bioseguridad clase II (BSC).
- Criaderos de mosquitos se homogeneizan en un mezclador de molino que se coloca dentro de un BSC.
- Homogeneizados de los mosquitos se centrifugan en una microcentrífuga hermética a los aerosoles. Si este procedimiento no puede llevarse a cabo dentro de un BSC, el operador debe usar un respirador al manejar y recuperar muestras de la centrífuga.
- Pipetas y puntas de pipeta de manejo de materiales en el BSC (gabinete de bioseguridad) se sumergen en lejía al 10% antes de la esterilización en autoclave. Todos los desechos de laboratorio es descontaminado en autoclave antes de su eliminación.
3. Preparación de las células Vero
- Los medios de comunicación decantar la cultura de un frasco grande de cultivo de tejidos (175 cm 2) de las células Vero confluentes (clon E6) en el vaso los residuos que contengan lejía.
- Lavar las células Vero mediante la adición de una alícuota de 5 ml de PBS y agitar sobre la capa de células ya lo largo de los lados del frasco, asegurándose de cubrir bien toda la monocapa.
- PBS se decanta en el vaso de residuos.
- Añadir 2,5 ml de tripsina-EDTA y se arremolinan sobre la capa de células asegurándose de cubrir bien toda la monocapa.
- Incubar frasco en la incubadora durante 5 minutos a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Agite con cuidado y el matraz agitar para eliminar las células de la superficie inferior. Las células se deslice con facilidad; incubar un adicional de 1-5 minutos si las células no son fáciles de deslizar.
- Añadir 5 ml de medio mínimo esencial (MEM), 5% de suero fetal bovino (SFB), utilizando una pipeta serológica y pipeta hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces a disolver los grumos de células.
- Añadir otros 15 ml de MEM, 5% de SFB para un volumen total de 22,5 ml y mezclar bien.
- Lugar 40 frascos pequeños de cultivo de tejidos (25 cm 2) en posición vertical en dos bastidores (20 frascos / rack).
- Coloque los bastidores que contienen frascos dentro de la cabina de bioseguridad y de remover las tapas frasco, colocar las tapas directamente en frente de los frascos.
- Prescindir de 4 ml de MEM, 5% de SFB en cada frasco con una pipeta serológica.
- Coloque 0.5 ml de células suspendidas en cada frasco (~ 1:06 relación de división) Vuelva a colocar las tapas matraz.
- Agregar 50 ml de MEM, 5% de SFB al original frasco grande de cultivo de tejidos que contienen la suspensión de células restantes (~ 2,5 mL) y el retorno frasco a la incubadora. El mismo frasco grande de cultivo de tejidos puede ser reutilizado hasta 5 pasos y luego un nuevo frasco debe ser puesta en marcha en su lugar.
- La cultura el lugar de tejido pequeños frascos apilados en la bandeja. Remolino de la bandeja para asegurarse de que los medios de comunicación de manera uniforme cubre la parte inferior del matraz.
- Colocar frascos pequeños en la incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 y crecer durante la noche hasta el 80-90% confluente.
4. Preparación de los criaderos de mosquitos
- Mantener criaderos de mosquitos frío durante los procedimientos de prueba. El uso de pre-enfriadobastidores congelador y cassettes molino mezclador, reactivos helada, y una centrífuga refrigerada en el tratamiento de criaderos de mosquitos.
- Se colocan los tubos que contienen los mosquitos en un estante del congelador antes de la helada y añadir 1 a 1,5 ml de PBS-G a cada tubo de mosquitos.
- Recuperar molino mezclador-cassettes del congelador. Lugar 24 tubos en cada cinta y luego se asegura en el mezclador de molino.
- Homogeneizar las muestras durante 4 minutos a 25 ciclos / segundo. El molino mezclador sacude los tubos a alta velocidad y una BB de metal dentro de cada tubo altera el tejido del mosquito.
- Tubos centrífuga durante 6 minutos a 7.000 rpm.
- Se colocan los tubos de nuevo en el congelador hasta bastidores inoculados en células Vero.
5. La inoculación de células Vero con homogeneizados de pool de mosquitos
- Marcar al menos una frasco de cultivo de tejidos de cada serie en microscopio invertido para asegurar la salud adecuada confluencia y celular; esperar cerca de 80-90% de cobertura.
- Línea hasta 20 frascos pequeños de cultivo de tejidos en un rack y frascos con números de adhesión correspondientes de cada grupo de mosquitos.
- Afloje las tapas y la mayoría se decanta de los medios de comunicación de los frascos de cultivo de tejidos en el vaso de residuos. Deje suficiente material en el recipiente por completo monocapa de células abrigo.
- 100μL alícuota del sobrenadante de cada grupo de mosquitos procesados en el matraz de cultivo de tejidos correspondientes.
- Vuelva a colocar y apretar la tapa cultura matraz.
- Coloque los frascos de cultivo plano en agitador durante 5 minutos (temperatura ambiente) a 35-40 rpm.
- Retorno del 20 frascos de cultivo de tejidos a la posición vertical en un rack y el lugar en el BSC.
- Destapando tres frascos de cultivo de tejido al mismo tiempo, prescindir de cuatro medios de cultivo mL en cada frasco con una pipeta serológica, recoloque las tapas.
- Asegúrese de que la punta de la pipeta no hace contacto con el cuello del matraz la cultura o el labio. Cambie la punta de la pipeta cuando sea necesario si se hace contacto con el frasco.
- Incubar frascos de cultivo de tejidos a 37 ° C, 5% de CO 2.
6. Revisión de células Vero para el crecimiento de virus
- Pantalla inoculados frascos de cultivo de tejidos en busca de signos de infección viral, el efecto citopático (CPE), a partir de 3-7 días después de la inoculación.
- Inspeccione visualmente los cultivos celulares para la CPE y / o contaminación por la inclinación de los frascos y examinar los medios de comunicación que las piscinas en la parte inferior del frasco. Los medios de comunicación van a aparecer nubes que las células se deterioran durante el CPE o debido al crecimiento de las levaduras, hongos, o la contaminación bacteriana.
- Volver a examinar cultivos celulares que muestran los medios de comunicación nublado bajo un microscopio invertido. Los virus causan que las células se deforman y se desatará a partir de los frascos de cultivo. Cultivos celulares con contaminantes visibles, la levadura, por ejemplo, otras bacterias, hongos o restos de mosquitos pesados, son de nuevo a prueba al pasar la piscina mosquito original a través de un filtro de jeringa 0.22μM.
- Asépticamente prescindir de 1.2 mL de los medios de comunicación de virus de los cultivos celulares positivos en criotubos etiquetados con una pipeta serológica.
- Cultivos de virus se almacenan a -80 ° C hasta el momento identificados por las pruebas de diagnóstico apropiadas.
7. Preparación de los reactivos
- MEM, el 5% de SFB. Disolver 37,6 g de MEM en polvo en un volumen final de 4 litros de dd H 2 0. Prescindir de solución en 500 ml de alícuotas en frascos de medios de comunicación y autoclave. Cuando la solución se haya enfriado, añadir asépticamente 26 mL inactivado por calor suero fetal bovino, 5,2 mL L-glutamina, 5,2 anti-biotic/mycotic ml, y 10,4 ml de 7,5% de bicarbonato de sodio a cada botella. Almacenar a 4 ° C.
- PBS-G. Disolver 16 g de NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g de Na 2 HPO 4, 0,4 g de KH 2 PO 4, y 4 ml de 0,5% de rojo fenol en 1000 ml dd H 2 0. Ajustar el pH a 7,1-7,4 con NaOH 2 N (si es necesario). En un vaso separado, el calor 600 ml de H 2 0 a hervir. Eliminar de la placa caliente, agregar 10 g de gelatina y disolver. Añadir la solución de la gelatina disuelta a la solución de PBS y ajustar el volumen final de 2 L con dd H 2 O. Vierta 100 ml de solución en botellas y autoclave. Cuando la solución se haya enfriado, añadir asépticamente 42,8 ml de suero inactivado por calor conejo y 1,4 mL anti-biotic/mycotic. Almacenar a 4 ° C.
- De lavado PBS celular. Agregar 50 ml de 10X Dulbecco PBS a 400 ml dd H 2 O. Ajustar el pH a 7.1 con NaOH 2N. Ajustar el volumen final de 500 ml con dd H 2 O. Filtrar la solución con la unidad de 0.2uM filtro de vacío. Se distribuye en alícuotas de 5 ml en 8 ml con tapa de rosca tubos. Almacenar a 4 ° C.
8. Resultados representante
Nueve diferentes de virus a partir de 4 familias taxonómicas fueron recuperados de los mosquitos recolectados durante la vigilancia continua del estado de Connecticut 1997 a 2010 (cuadro 1). Cinco de estos virus causan enfermedad en humanos, los patógenos más importantes son el virus del Nilo y la encefalitis equina del este virus. Los nuevos descubrimientos son: el primer aislamiento del virus del Nilo Occidental de los mosquitos recolectados enAmérica del Norte en 1999 2, el primer aislamiento del virus de Potosí, en el noreste de EE.UU. en 2000 3, y el primer aislamiento del virus La Crosse en Nueva Inglaterra en 2005 4.
| Virus | Familia | N º cepas | No. localidades | Número de años en detectarse | Las enfermedades humanas | Refs. |
| Virus del Nilo Occidental | Flaviviridae | 1002 | 94 | 12 | Moderada a severa, fiebre, encefalitis | 2,5 |
| Equina del este virus de la encefalitis | Togaviridae | 292 | 41 | 10 | Encefalitis severa, | 6,7 |
| Highlands J virus | Togaviridae | 178 | 39 | 11 | No se conoce | 6 |
| Jamestown Canyon virus | Bunyaviridae | 305 | 74 | 14 | De leve a moderado, fiebre, meningitis | 8 |
| Potosí virus | Bunyaviridae | 259 | 76 | 4 | No se conoce | 3 |
| Cache Valley virus | Bunyaviridae | 114 | 51 | 8 | De leve a severa, fiebre, las enfermedades neurológicas en los dos casos documentados | |
| Trivittatus virus | Bunyaviridae | 83 | 21 | 11 | No se conoce | |
| La Crosse virus | Bunyaviridae | 1 | 1 | 1 | Moderada a severa encefalitis, | 4 |
| Flandes virus | Rhabdoviridae | 4 | 4 | 2 | No se conoce |
Los virus Tabla 1. Detectado en mosquitos recolectados en campo por el ensayo de cultivo de células Vero. Los mosquitos fueron colectados durante la vigilancia a nivel estatal en Connecticut 1997 a 2.010.
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Discussion
De células Vero ensayo de cultivo sirve como un método eficaz para los mosquitos pantalla de campo recogidos por la diversidad de virus. Esto contrasta con los métodos moleculares que apuntan específicamente a uno o unos pocos virus de interés. Por otra parte, hemos encontrado que la prueba de cultivo celular Vero es, si no también más sensible que la RT-PCR 7 y nos proporciona cepas de virus que se almacenan en nuestra colección de referencia para futuros estudios. Sin embargo, los sistemas de cultivo celular puede no ser apropiado en muchos casos. Este enfoque incurre en gastos adicionales y la formación necesaria para cultivar virus en un laboratorio BSL-3, sin embargo, estos costos pueden ser compensados por los suministros relativamente barato para el cultivo celular. También vale la pena destacar que la mayoría pero no todos los virus transmitido por mosquitos producen CPE en el cultivo celular Vero 9,10. El virus del dengue es una notable excepción que deben ser examinados por otra prueba de diagnóstico. Lo ideal es una combinación de ambos métodos de cultivo celular y molecular se utilizan para comprobar la infección viral. Actualmente estamos usando métodos convencionales y cuantitativas de RT-PCR 4,11,12, a veces junto con la secuencia, para identificar los virus aislado en cultivo celular, y para confirmar la infección en la piscina de mosquitos.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos la importante contribución de los Dres. John Anderson, Andrew principal y Shirley Tirrell a este estudio. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (U50/CCU116806-01-1) y el Departamento de Agricultura de EE.UU. (58-6615-1-218, CONH00768 y CONH00773).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | GIBCO, by Life Technologies | 25080 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11700 | |
| 10X Dulbecco’s PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14080 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15400 | |
| Rabbit serum | GIBCO, by Life Technologies | 16120 | |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon BD | 353112 | |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon BD | 353108 | |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
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