Summary
We beschrijven een methode voor het verwerken en het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit aan virussen door Vero celcultuur assay. Door gebruik te maken van deze techniek, hebben we ontdekt 9 verschillende virussen van vier taxonomische families in muggen verzameld in Connecticut.
Abstract
Muggen zenden een aantal verschillende virussen waaronder belangrijke menselijke ziekteverwekkers, zoals het West-Nijlvirus, knokkelkoorts virus, en chickungunya virus. Veel van deze virussen zijn toegenomen in hun endemische reeksen en uitgebreid met nieuwe gebieden, noodzakelijk effectief toezicht en controle programma's om te reageren op deze bedreigingen. Een strategie om te virusactiviteit monitoren omvat het verzamelen van grote aantallen muggen uit endemische sites en testen ze voor virale infectie. In dit artikel beschrijven we hoe te behandelen, verwerken, en het scherm het veld verzameld muggen voor besmettelijke virus door Vero celcultuur assay. Muggen zijn gesorteerd op locatie val en soorten, en gegroepeerd in zwembaden met ≤ 50 individuen. Gepoolde monsters zijn gehomogeniseerd in gebufferde zoutoplossing met behulp van een mixer-molen en de waterige fase wordt geënt op confluente Vero celculturen (Clone E6). Celculturen worden gecontroleerd op cytopathogeen ingang van dag 3-7 na de inoculatie en virussen gekweekt in celkweek worden geïdentificeerd door de juiste diagnostische testen. Door gebruik te maken van deze benadering hebben we geïsoleerde 9 verschillende virussen van muggen verzameld in Connecticut, VS, en onder deze, 5 is bekend dat de menselijke ziekte te veroorzaken. Drie van deze virussen (West-Nijl virus, Potosi virus, en La Crosse virus) vertegenwoordigen nieuwe records voor Noord-Amerika of het New England regio sinds 1999. De mogelijkheid om een grote diversiteit aan virussen te detecteren is essentieel voor het toezicht op zowel gevestigde als opkomende virussen in de mug bevolking.
Protocol
1. Mosquito sorteren en identificatie
- De volgende procedures worden uitgevoerd op een open laboratorium bankje in een speciale bioveiligheidsniveau-2 (BSL-2) laboratorium door medewerkers die zijn opgeleid om te werken met live muggen. Een "koude keten" is gedurende de gehele procedure.
- Verdoven leven volwassen muggen door het plaatsen van mosquito collectie zak in een vriezer -20 ° gedurende 5 minuten. Overdracht opvangzak aan een geïsoleerde container met droog ijs. Sluit het deksel en bloot muggen aan koolstof-dioxide gedurende 1-3 minuten om te zorgen voor een volledige knock-down.
- Tik onder narcose muggen op een pre-gekoelde pan geplaatst op een bed van droog ijs. Afzonderlijke individuele vrouwelijke muggen met fijn pincet en plaats in plastic bekers gedeelte. Dek af met deksel en plaats bekers op nat ijs.
- Identificeer muggen tot de soorten die met behulp van beschrijvende taxonomisch toetsen op basis van externe mug morfologie met behulp van een stereo-installatie dissectiemicroscoop (10-60X zoom) gemonteerd op een elektronische chill tafel.
- Combineer geïdentificeerd muggen soorten in poelen van ≤ 50 personen in 2 ml snap-cap flacons met een koperen BB. Injectieflacons zijn voorzien van een unieke identificatiecode.
- Na de identificatie van alle muggen, zijn flacons geplaatst in gelabelde zakken en hield in een piepschuim koelbox met droog ijs.
- Bewaar mug zwembaden in een temperatuur van -80 ° C vriezer tot virus testen.
2. Bioveiligheid overwegingen om het virus te isoleren van muggen
- De volgende procedures worden uitgevoerd in een bioveiligheidsniveau-3 (BSL-3) laboratorium door medewerkers die zijn opgeleid om te werken op dit niveau van insluiting 1. Laboratoriumfaciliteiten, apparatuur, procedures en praktijken zijn onderworpen aan de institutionele, provinciale en federale toezicht op en inspectie. Zoek de passende opleiding en goedkeuring voordat de volgende protocollen.
- Draag de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) voor elke procedure, zoals disposable jassen, handschoenen, gezicht schilden, en gasmaskers.
- Desinfecteer werken oppervlakken met 70% alcohol voor en na de voltooiing van de procedures.
- Celculturen en potentieel infectieus materiaal worden behandeld in een klasse II bioveiligheid kast (BSC).
- Mosquito zwembaden zijn gehomogeniseerd in een mixer-molen die is geplaatst in een BSC.
- Mosquito homogenaten worden gecentrifugeerd in een aerosol-strakke microcentrifuge. Als deze procedure niet kan worden uitgevoerd binnen een BSC, moet de exploitant een masker te dragen bij het bedienen van en het ophalen van monsters uit de centrifuge.
- Pipetten en pipetpunten werken met dit materiaal in de BSC (bioveiligheid kast) zijn gedrenkt in 10% bleekwater voorafgaand aan de autoclaaf. Alle laboratorium-afval wordt ontsmet door autoclaveren voorafgaand aan de beschikking.
3. Voorbereiding van de Vero-cellen
- Giet de cultuur van de media een grote weefselkweek vat (175 cm 2) van samenvloeiende Vero-cellen (Clone E6) in afval bekerglas met bleekmiddel.
- Was Vero-cellen door het toevoegen van een 5 ml van PBS en werveling over laag van cellen en langs de zijkanten van kolf en zorg ervoor dat grondig te dekken hele monolaag.
- Giet PBS in afval beker.
- Voeg 2,5 ml trypsine-EDTA en werveling over laag van cellen en zorg ervoor dat grondig te dekken hele monolaag.
- Incubeer kolf in incubator gedurende 5 minuten bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Schud en draai fles om cellen van onder het oppervlak te verwijderen. De cellen moet gemakkelijk glijden; incubeer een extra 1-5 minuten als de cellen niet gemakkelijk glijden.
- Voeg 5 ml van de Minimal Essential Media (MEM), 5% foetaal bovine serum (FBS), met behulp van een serologische pipet en pipet up-and-down 10-20 keer te breken van de klompen van de cellen.
- Voeg een extra 15 ml MEM, 5% FBS voor een totaal volume van 22,5 ml en meng goed.
- Plaats 40 kleine weefselkweekflessen (25 cm 2) rechtop in twee racks (20 flessen / rek).
- Plaats de rekken met flessen in de bioveiligheid kast en verwijder fles caps, het plaatsen van caps direct voor kolven.
- Doseer 4 ml MEM, 5% FBS in elke kolf met behulp van een serologische pipet.
- Verdeel 0,5 ml gesuspendeerd cellen in elke kolf (~ 1:06 splitsen ratio) Vervang de fles caps.
- Voeg 50 ml MEM, 5% FBS terug naar de oorspronkelijke grote weefselkweek kolf met de resterende celsuspensie (~ 2.5 km) en terug te keren kolf de incubator. Dezelfde grote weefselkweek fles kunnen opnieuw worden gebruikt tot 5 passages en vervolgens een nieuwe fles moet worden opgezet om het te vervangen.
- Plaats kleine weefselkweek kolven in stapels op de tray. Swirl de lade om ervoor te zorgen dat de media gelijkmatig de bodem van de flaks dekt.
- Plaats kleine flesjes in de incubator bij 37 ° C, 5% CO 2 en 's nachts tot 80-90% confluent groeien.
4. Voorbereiding van de mug zwembaden
- Houd muggen zwembaden koud tijdens het testen procedures. Gebruik van pre-gekoeldevriezer rekken en mixer-molen cassettes, ijskoude reagentia, en een gekoelde centrifuge bij het verwerken van mug zwembaden.
- Plaats de buisjes met muggen in een pre-gekoelde diepvries rack en voeg 1 tot 1,5 mL PBS-G aan elke buis van de muggen.
- Ophalen mixer-molen cassettes uit de vriezer. Plaats 24 buizen in elke cassette en vervolgens veilig in de mixer-molen.
- Homogeniseren de monsters gedurende 4 minuten bij 25 cycli / seconde. De mixer molen schudt de buizen met hoge snelheid en een metalen BB in elke buis verstoort de mug weefsel.
- Centrifugebuizen gedurende 6 minuten bij 7.000 tpm.
- Plaats de buisjes terug in vriezer rekken totdat geënt in Vero-cellen.
5. Inoculatie van Vero-cellen met een mug zwembad homogenaten
- Controleer ten minste een weefselkweek kolf van elke serie onder omgekeerde microscoop om een adequate confluentie en de gezondheid van de cellen te verzekeren; verwachten dat ongeveer 80-90% dekking.
- Line up 20 kleine weefselkweekflessen in een rek en een label kolven met de bijbehorende toetreding nummers van elke mug zwembad.
- Draai caps en decanteer het grootste deel van de media uit weefselkweek flessen in afval beker. Laat voldoende media in de kolf volledig vacht cel monolaag.
- Aliquot 100μL van supernatant van elke verwerkte mug zwembad in de overeenkomstige weefselkweek kolf.
- Vervang en draai cultuur fles dop.
- Leg cultuur flessen plat op shaker gedurende 5 minuten (op kamertemperatuur) op 35-40 rpm.
- Return 20 weefselkweek kolven om rechtop in een rek en plaats in de BSC.
- Ontzegeld, 3 weefselkweek flessen in een keer, afzien van 4 ml groei media in elke kolf met behulp van een serologische pipet, te vervangen caps.
- Zorg ervoor dat de pipetpunt niet de cultuur fles nek of lip contact. Verandering pipetpunten zo nodig als contact wordt gemaakt met de kolf.
- Incubeer weefselkweekflessen bij 37 ° C, 5% CO 2.
6. Screening Vero cellen voor virusgroei
- Scherm ingeënt weefselkweek flessen op tekenen van virale infectie, cytopathische effect (CPE), van 3-7 dagen na de inenting.
- Visueel op celculturen voor CPE en / of vervuiling door het kantelen van de flessen en het onderzoeken van de media die zwembaden op de bodem van de kolf. De media zal verschijnen troebel als de cellen verslechteren tijdens de CPE of als gevolg van de groei van gist, schimmel of bacteriële besmetting.
- Opnieuw te onderzoeken celculturen die troebel media vertonen onder een omgekeerde microscoop. Virussen veroorzaken cellen misvormd en breekt los van de cultuur kolven. Celculturen met zichtbare verontreinigingen, zoals gist, andere bacteriën, schimmels of zware mug puin, opnieuw worden getest door het passeren van de originele mug zwembad door middel van een injectiespuit 0.22μM filter.
- Aseptisch afzien van 1-2 ml van media van virus-positieve celculturen in gelabelde cryotubes met behulp van een serologische pipet.
- Virus culturen zijn opgeslagen bij -80 ° C tot geïdentificeerd met behulp van de juiste diagnostische testen.
7. Bereiding van reagentia
- MEM, 5% FBS. Los 37,6 g poeder MEM in een uiteindelijk volume van 4 L van dd H 2 0. Doseer-oplossing in 500 ml porties in de media flessen en autoclaaf. Als oplossing is afgekoeld, aseptisch toe te voegen 26 ml hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum, 5,2 ml L-glutamine, 5,2 ml anti-biotic/mycotic, en 10,4 ml 7,5% natriumbicarbonaat bij elke fles. Bewaren bij 4 ° C.
- PBS-G. Los 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,3 g Na 2 HPO 4, 0,4 g KH 2 PO 4, en 4 ml van 0,5% Phenol Red in 1000 mL dd H 2 0. Pas de pH op 7,1-7,4 met 2 N NaOH (indien nodig). In een aparte beker, warmte 600 ml H 2 0 aan de kook. Verwijderen uit hot-plate, voeg 10 g gelatine, en lossen. Voeg opgeloste gelatine oplossing voor de PBS-oplossing en pas uiteindelijke volume van 2 L met dd H 2 O. Doseer 100 ml van de oplossing in flessen en autoclaaf. Als oplossing is afgekoeld, voeg aseptisch 42,8 ml hitte-geïnactiveerd konijn serum en 1,4 mL anti-biotic/mycotic. Bewaren bij 4 ° C.
- PBS cel wassen. Voeg 50 ml 10x Dulbecco's PBS tot 400 ml dd H 2 O. Pas de pH op 7,1 met 2 N NaOH. Pas uiteindelijk volume van 500 ml met dd H 2 O. Filter oplossing met 0.2uM vacuümfilter unit. Doseer in 5 ml porties in 8 ml schroefdop buizen. Bewaren bij 4 ° C.
8. Representatieve resultaten
Negen verschillende virussen van vier taxonomische gezinnen werden hersteld van muggen verzameld tijdens continue bewaking gehele staat in Connecticut 1.997 tot 2.010 (tabel 1). Vijf van deze virussen is bekend dat ze ziekten bij de mens de belangrijkste pathogenen die West-Nijl virus-en Oost-equine encephalitis virus veroorzaken. Nieuwe ontdekkingen zijn onder meer: de eerste isolatie van WNV uit muggen verzameld inNoord-Amerika in 1999 2, de eerste isolatie van Potosi virus in het noordoosten van de VS in 2000 3, en de eerste isolatie van La Crosse virus in New England in 2005 4.
| Virus | Familie | Nee isoleert | Nee locaties | Nee jaren ontdekt | Ziekte van de mens | Refs. |
| West-Nijl virus | Flaviviridae | 1002 | 94 | 12 | Matige tot ernstige, koorts, encefalitis | 2,5 |
| Eastern equine encephalitis virus | Togaviridae | 292 | 41 | 10 | Ernstige, encefalitis | 6,7 |
| Highlands J virus | Togaviridae | 178 | 39 | 11 | Niet bekend | 6 |
| Jamestown Canyon virus | Bunyaviridae | 305 | 74 | 14 | Milde tot matige koorts, meningitis | 8 |
| Potosi virus | Bunyaviridae | 259 | 76 | 4 | Niet bekend | 3 |
| Cache Valley virus | Bunyaviridae | 114 | 51 | 8 | Milde tot ernstige, koorts, neurologische ziekte in twee gedocumenteerde gevallen | |
| Trivittatus virus | Bunyaviridae | 83 | 21 | 11 | Niet bekend | |
| La Crosse virus | Bunyaviridae | 1 | 1 | 1 | Matige tot ernstige, encefalitis | 4 |
| Vlaanderen virus | Rhabdoviridae | 4 | 4 | 2 | Niet bekend |
Tabel 1. Virussen gedetecteerd in het veld verzameld muggen door Vero celcultuur assay. Muggen werden verzameld tijdens de gehele staat surveillance in Connecticut 1,997 tot 2.010.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vero celcultuur-test dient als een effectieve methode om het scherm het veld verzameld muggen voor een diversiteit van virussen. Dit in tegenstelling tot moleculaire methoden die specifiek zijn gericht op een of een paar virussen van belang. Bovendien hebben we ontdekt dat Vero celcultuur-test ook is, zo niet gevoeliger dan RT-PCR 7 en biedt ons virusisolaten die in onze referentie collectie opgeslagen voor toekomstig onderzoek. Toch kan celkweek systemen niet geschikt zijn in veel gevallen. Deze aanpak maakt extra kosten en training nodig is om virussen te groeien in een BSL-3 laboratorium, maar deze kosten kan worden gecompenseerd door relatief goedkoop materiaal voor celcultuur. Het is ook vermeldenswaard dat de meeste maar niet alle muggen overgedragen virussen CPE te produceren in Vero celkweek 9,10. Dengue virus is een belangrijke uitzondering die moet worden gescreend door een andere diagnostische test. Idealiter zijn een combinatie van zowel de moleculaire en cel-cultuur methoden die worden gebruikt om te testen op virale infectie. We zijn momenteel met behulp van conventionele en kwantitatieve RT-PCR assays 4,11,12, soms in combinatie met sequencing, virussen geïsoleerd in celkweek te identificeren, en om infectie te bevestigen in de mug zwembad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij dankbaar erkennen de belangrijke bijdragen van Drs. John Anderson, Andrew Main en Shirley Tirrell aan deze studie. Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van de Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) en het Amerikaanse ministerie van Landbouw (58-6615-1-218, CONH00768, en CONH00773).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | GIBCO, by Life Technologies | 25080 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11700 | |
| 10X Dulbecco’s PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14080 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15400 | |
| Rabbit serum | GIBCO, by Life Technologies | 16120 | |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon BD | 353112 | |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon BD | 353108 | |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
- Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , American Public Health Association. 189-212 (1995).
- Karabatsos, N. International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).
- Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
- Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).
