Summary
Descriviamo un metodo per elaborare e schermo campo raccolti zanzare per una varietà di virus mediante test Vero colture cellulari. Utilizzando questa tecnica, abbiamo rilevato 9 virus diversi da 4 famiglie tassonomiche nelle zanzare raccolte nel Connecticut.
Abstract
Le zanzare trasmettono un certo numero di diversi virus tra cui importanti patogeni umani come il virus West Nile, virus dengue, virus e chickungunya. Molti di questi virus hanno intensificato nelle loro gamme endemiche e esteso a nuovi territori, che richiedono efficaci programmi di sorveglianza e di controllo per rispondere a queste minacce. Una strategia per monitorare l'attività dei virus prevede la raccolta di un gran numero di zanzare da siti endemiche e il loro test per l'infezione virale. In questo articolo viene descritto come gestire, elaborare e schermo campo raccolti per le zanzare virus infettivo mediante test Vero colture cellulari. Le zanzare sono ordinati in base alla località trappola e specie, e raggruppati in vasche contenenti ≤ 50 individui. I campioni in pool sono omogeneizzati in soluzione salina tamponata con un mixer-mulino e la fase acquosa viene inoculata in colture cellulari confluenti Vero (Clone E6). Le colture cellulari sono monitorati per effetto citopatico da 3-7 giorni post-inoculazione e qualsiasi virus coltivato in colture cellulari sono identificati dal test diagnostico appropriato. Utilizzando questo approccio, abbiamo isolato 9 virus diversi da zanzare raccolte nel Connecticut, Stati Uniti, e tra questi, 5 sono noti per causare la malattia umana. Tre di questi virus (West Nile virus, virus Potosi, e La Crosse virus) rappresentano i nuovi record per il Nord America o la regione del New England dal 1999. La capacità di rilevare un'ampia gamma di virus è fondamentale per il monitoraggio sia stabilita e virus emergenti nella popolazione di zanzare.
Protocol
1. Mosquito smistamento e identificazione
- Le seguenti procedure vengono eseguite su un banco in un laboratorio aperto dedicato biosicurezza di livello-2 (BSL-2) da personale di laboratorio che sono addestrati a lavorare con le zanzare dal vivo. Una "catena del freddo" è mantenuta per tutta la procedura.
- Anestetizzare vivono zanzare adulte mettendo borsa zanzara raccolta in un congelatore -20 ° per 5 minuti. Trasferimento sacca di raccolta in un contenitore isolato contenente ghiaccio secco. Chiudere il coperchio ed esporre le zanzare di anidride carbonica per 1-3 minuti per garantire la completa knock-down.
- Toccare le zanzare anestetizzato su un pre-raffreddata padella posta su un letto di ghiaccio secco. Separare le zanzare individuale femminile con una pinza sottile e il luogo in bicchieri di plastica parte. Coprire con coperchio e coppe posto sul ghiaccio bagnato.
- Identificare le specie di zanzare usando i tasti tassonomica descrittiva basata sulla morfologia zanzara esterno con l'ausilio di un microscopio stereo dissezione (10-60X zoom) montato su un tavolo freddo elettronico.
- Combina identificate specie di zanzare in pool di ≤ 50 persone in 2 ml con tappo a scatto fiale contenenti un BB rame. I flaconi sono etichettati con un identificatore univoco.
- A seguito di identificazione di tutte le zanzare, le fiale sono posti in sacchetti etichettati e tenuto in un dispositivo di raffreddamento di polistirolo contenente ghiaccio secco.
- Conservare piscine zanzara in un congelatore ° -80 C fino a quando le analisi virologiche.
2. Considerazioni di Biosicurezza per isolare virus zanzare
- Le seguenti procedure vengono eseguite in un biosicurezza di livello 3 (BSL-3) di laboratorio da personale che sono addestrati a lavorare a questo livello di contenimento 1. Strutture di laboratorio, apparecchiature, procedure e prassi sono soggetti al controllo istituzionali, statali e federali e di ispezione. Cercate la formazione e l'approvazione prima di provare i seguenti protocolli.
- Indossare la adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) per ogni procedimento come camici monouso, guanti, visiere e respiratori.
- Disinfettare le superfici di lavoro con il 70% di alcol prima e dopo il completamento delle procedure.
- Colture cellulari e materiale potenzialmente infetto sono trattati in II classe biosicurezza cabinet (BSC).
- Piscine zanzara sono omogeneizzati in un mixer-mulino che viene inserito all'interno di una BSC.
- Omogenati di zanzara vengono centrifugati in una tenuta di aerosol microcentrifuga. Se questa procedura non può essere eseguita all'interno di una BSC, l'operatore deve indossare un respiratore durante il funzionamento e il recupero di campioni dalla centrifuga.
- Pipette e puntali movimentazione dei materiali nel BSC (biosicurezza armadio) sono imbevuti di candeggina al 10% prima della sterilizzazione in autoclave. Tutti i rifiuti di laboratorio è decontaminati in autoclave prima dello smaltimento.
3. Preparazione di cellule Vero
- Terreni di coltura decantare da un gran fiasco coltura dei tessuti (175 cm 2) di confluenti cellule Vero (Clone E6) in coppa rifiuti contenenti candeggina.
- Lavare le cellule Vero con l'aggiunta di un'aliquota di 5 ml di PBS e agitare oltre strato di cellule e lungo i lati del pallone avendo cura di coprire accuratamente monostrato intero.
- Decantare PBS in coppa dei rifiuti.
- Aggiungere 2,5 mL di tripsina-EDTA e agitare oltre strato di cellule avendo cura di coprire accuratamente monostrato intero.
- Incubare pallone in incubatore per 5 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Scuotere e pallone turbolenza per rimuovere le cellule dalla superficie inferiore. Le cellule devono sfilare facilmente; incubare un ulteriore 1-5 minuti se le cellule non facilmente scivolare.
- Aggiungere 5 ml di Minimal Essential Media (MEM), 5% di siero fetale bovino (FBS), utilizzando una pipetta sierologica e pipetta up-and-down 10-20 volte per rompere i grumi di cellule.
- Aggiungere un ulteriore 15 ml MEM, 5% FBS per un volume totale di 22,5 ml e mescolare bene.
- Posto 40 piccole fiasche coltura dei tessuti (25 cm 2) in posizione verticale in due rack (20 palloni / rack).
- Collocare il rack contenente fiaschi all'interno dell'armadio biosicurezza e rimuovere i tappi fiasco, mettendo tappi di fronte fiaschi.
- Dispensare 4 ml di MEM, 5% FBS in ogni pallone con una pipetta sierologica.
- Dispensare 0,5 ml di cellule sospese in ogni pallone (~ 01:06 rapporto di splittaggio) Sostituire tappi pallone.
- Aggiungere 50 ml di MEM, 5% FBS nuovo al primo pallone grandi colture di tessuti contenenti la sospensione di cellule rimanenti (~ 2,5 ml) e tornare pallone per l'incubatrice. Lo stesso grande pallone di colture di tessuti possono essere riutilizzati fino a 5 passaggi e poi un pallone nuovo dovrebbe essere di set-up per sostituirlo.
- Coltura tissutale piccolo fiaschi in pile sul vassoio. Agitare il vassoio per assicurarsi che i media copre uniformemente il fondo del flaks.
- Luogo piccoli palloni in incubatrice a 37 ° C, 5% di CO 2 e crescere durante la notte fino a 80-90% confluenti.
4. Preparazione di piscine zanzara
- Tenere piscine zanzara freddo durante le procedure di collaudo. Utilizzare pre-refrigeratorack congelatore e mixer-mulino cassette, ghiacciata reagenti e una centrifuga refrigerata durante l'elaborazione di piscine zanzara.
- Tubi contenenti luogo le zanzare in una pre-raffreddata a rack freezer e aggiungere 1-1,5 ml di PBS-G a ciascuna provetta di zanzare.
- Recupera mixer-mulino cassette dal congelatore. Posto 24 tubi in ogni cassetto e poi sicuro nel mixer-mulino.
- Omogeneizzare i campioni per 4 minuti a 25 cicli / secondo. Il mulino mixer scuote i tubi ad alta velocità e un BB in metallo all'interno di ciascun tubo distrugge il tessuto zanzara.
- Centrifugare i tubi per 6 minuti a 7.000 giri al minuto.
- Provette per la schiena in rack congelatore fino inoculati in cellule Vero.
5. Inoculazione di cellule Vero con omogenati piscina zanzara
- Controllare almeno un pallone colture di tessuti di ciascuna serie e sotto microscopio invertito per assicurare un'adeguata salute confluenza e cellule; aspettare circa 80-90% di copertura.
- Allineare 20 piccole fiasche di coltura tissutale in un rack e fiaschi etichetta con i numeri corrispondenti adesione di ciascun gruppo di zanzara.
- Allentare i cappucci e decantare la maggior parte dei media da fiasche di coltura in coppa dei rifiuti. Lasciare i supporti abbastanza nel pallone in mano completamente monostrato cellulare.
- 100μL un'aliquota del surnatante di ciascun gruppo zanzara trattati nel pallone corrispondente coltura di tessuti.
- Sostituire il tappo e serrare fiasco cultura.
- Lay fiaschi cultura piatto su agitatore per 5 minuti (temperatura ambiente) a 35-40 giri al minuto.
- Ritorno 20 fiasche coltura dei tessuti in posizione verticale in un rack e posto nella BSC.
- Uncapping 3 fiasche coltura dei tessuti in una sola volta, dispensare 4 media di crescita ml in ogni pallone con una pipetta sierologica, sostituire tappi.
- Assicurarsi che la punta della pipetta non contatta il collo del matraccio cultura o delle labbra. Cambia puntali come necessario se viene a contatto con il pallone.
- Incubare cultura fiasche tessuto a 37 ° C, 5% di CO 2.
6. Screening cellule Vero per la crescita dei virus
- Schermo inoculato fiasche coltura dei tessuti per i segni di infezione virale, effetto citopatico (CPE), da 3-7 giorni dopo l'inoculazione.
- Ispezionare visivamente colture cellulari per la CPE e / o contaminazione inclinando la fiaschi ed esaminando i media che pozze sul fondo del pallone. I media appaiono torbidi come le cellule si deteriorano durante CPE oppure a causa della crescita del lievito, funghi, o di contaminazione batterica.
- Riesaminare colture di cellule che mostrano i media nuvoloso sotto un microscopio invertito. I virus si indurre le cellule a deformarsi e staccarsi dalla cultura fiaschi. Colture cellulari con contaminanti visibili, per esempio lievito, altri batteri, funghi o detriti zanzara pesanti, sono ri-testati passando la piscina zanzara originale attraverso un filtro a siringa 0.22μM.
- Asetticamente dispensare 1-2 ml di supporti da virus positivo colture cellulari in cryotubes etichettati utilizzando una pipetta sierologica.
- Culture del virus sono conservati a -80 ° C fino identificato con il test diagnostico appropriato.
7. Preparazione dei reagenti
- MEM, 5% FBS. Sciogliere 37,6 g di MEM in polvere in un volume finale di 4 L di H 2 0 gg. Dispensare soluzione in 500 ml di aliquote in flaconi media e autoclave. Quando la soluzione si è raffreddata, aggiungere asetticamente 26 inattivato al calore ml di siero fetale bovino, 5,2 mL L-Glutammina, 5,2 anti-biotic/mycotic mL e 10,4 mL di bicarbonato di sodio 7,5% per ogni bottiglia. Conservare a 4 ° C.
- PBS-G. Sciogliere 16 g di NaCl, 0,4 g di KCl, 2,3 g di Na 2 HPO 4, 0,4 g di KH 2 PO 4, e 4 mL di fenolo rosso allo 0,5% in 1000 mL gg H 2 0. Regolare il pH a 7,1-7,4 con 2 N NaOH (se necessario). In un recipiente a parte, il caldo 600 ml di H 2 0 a ebollizione. Rimuovi dalla piastra, aggiungere 10 g di gelatina, e si dissolvono. Aggiungere la gelatina sciolta soluzione alla soluzione PBS e regolare il volume finale a 2 L con dd H 2 O. Dispensare 100 ml di soluzione in bottiglie e autoclave. Quando la soluzione si è raffreddata, aggiungere asetticamente 42,8 ml di siero siero di coniglio e 1,4 anti-biotic/mycotic ml. Conservare a 4 ° C.
- PBS cellula lavaggio. Aggiungere 50 ml di PBS 10X Dulbecco a 400 ml gg H 2 O. Regolare il pH a 7,1 con NaOH 2 N. Regolare il volume finale a 500 ml con dd H 2 O. Filtro soluzione con unità 0.2uM filtro vuoto. Dispensare in 5 aliquote ml in 8 ml con tappo a vite tubi. Conservare a 4 ° C.
8. Rappresentante Risultati
Nove diversi di virus da 4 famiglie tassonomico sono stati recuperati dalle zanzare raccolti durante la sorveglianza continua in tutto lo stato del Connecticut 1997-2010 (tabella 1). Cinque di questi virus sono noti per causare la malattia umana, i patogeni più importanti sono il virus del Nilo occidentale e orientale virus dell'encefalite equina. Nuove scoperte sono: il primo isolamento del WNV nel zanzare raccolti inNord America nel 1999 2, il primo isolamento del virus Potosi nel nord-est degli Stati Uniti nel 2000 3, e il primo isolamento del virus La Crosse nel New England nel 2005 4.
| Virus | Famiglia | No. isola | No. posizioni | No. anni rilevato | Malattie umane | Refs. |
| Virus del Nilo occidentale | Flaviviridae | 1002 | 94 | 12 | Da moderata a grave, febbre, encefalite | 2,5 |
| Encefalite equina orientale virus | Togaviridae | 292 | 41 | 10 | Gravi, encefalite | 6,7 |
| Highlands J virus | Togaviridae | 178 | 39 | 11 | Non nota | 6 |
| Jamestown Canyon virus | Bunyaviridae | 305 | 74 | 14 | Da lieve a moderata, la febbre, la meningite | 8 |
| Potosi virus | Bunyaviridae | 259 | 76 | 4 | Non nota | 3 |
| Cache Valley virus | Bunyaviridae | 114 | 51 | 8 | Da lieve a grave, la febbre, la malattia neurologica in due casi documentati | |
| Trivittatus virus | Bunyaviridae | 83 | 21 | 11 | Non nota | |
| La Crosse virus | Bunyaviridae | 1 | 1 | 1 | Da moderata a grave, l'encefalite | 4 |
| Fiandre virus | Rhabdoviridae | 4 | 4 | 2 | Non nota |
I virus Tabella 1. Rilevato in campo raccolti zanzare mediante test di coltura cellulare Vero. Le zanzare sono stati raccolti durante la sorveglianza in tutto lo stato in Connecticut dal 1997-2010.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Test su cellule Vero cultura serve come un metodo efficace per lo screening sul campo raccolte zanzare per una varietà di virus. Questo contrasta con metodi molecolari che specificamente di mira uno o alcuni virus di interesse. Inoltre, abbiamo trovato che il Vero saggio coltura cellulare è altrettanto se non più sensibile di RT-PCR 7 e ci fornisce isolati di virus che sono memorizzati nella nostra collezione di riferimento per studi futuri. Tuttavia, i sistemi di coltura cellulare non può essere opportuno in molti casi. Questo approccio comporta spese aggiuntive e la formazione necessaria per crescere virus in un laboratorio BSL-3, tuttavia, questi costi possono essere compensati da materiali relativamente economici per colture cellulari. E 'anche interessante notare che la maggior parte ma non tutte trasmesse dalle zanzare virus producono CPE nelle cellule in coltura Vero 9,10. Virus della dengue è una notevole eccezione, che dovrebbero essere vagliate da un altro test diagnostico. Idealmente, una combinazione di entrambi i metodi di coltura cellulare e molecolare vengono utilizzati per verificare l'infezione virale. Attualmente stiamo utilizzando convenzionali e RT-PCR quantitativa saggi 4,11,12, a volte in collaborazione con sequenziamento, per identificare i virus isolati in coltura cellulare, e di riconfermare l'infezione in piscina zanzara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Noi riconosciamo con gratitudine gli importanti contributi di Drs. John Anderson, Andrew principale e Shirley Tirrell a questo studio. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni provenienti dal Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) e il Dipartimento dell'Agricoltura degli Stati Uniti (58-6615-1-218, CONH00768 e CONH00773).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | GIBCO, by Life Technologies | 25080 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11700 | |
| 10X Dulbecco’s PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14080 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15400 | |
| Rabbit serum | GIBCO, by Life Technologies | 16120 | |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon BD | 353112 | |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon BD | 353108 | |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
- Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , American Public Health Association. 189-212 (1995).
- Karabatsos, N. International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).
- Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
- Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).
