Summary
Biz süreci için bir metodu tanımlar ve ekran alanında toplanan Vero hücre kültürü yöntemi ile virüs bir çeşitliliğe sivrisinekler. Bu tekniği kullanılarak, Connecticut toplanan sivrisinek 4 taksonomik ailelerden gelen 9 farklı virüsler tespit ettik.
Abstract
Sivrisinekler Batı Nil virüsü, dang virüs ve chickungunya virüs gibi önemli insan patojenleri de dahil olmak üzere bir dizi farklı virüsler iletir. Bu virüslerin çoğu endemik aralıklarında yoğunlaştı ve yeni bölgeler için genişletilmiş, bu tehditlere yanıt vermek için, etkin bir gözetim ve kontrol programları gerektiren var. Virüs etkinliğini izlemek için bir strateji endemik sitelerinden çok sayıda sivrisinek toplama ve viral enfeksiyon için test içerir. Bu makalede, biz nasıl işleneceğini süreci tanımlamak ve Vero hücre kültürü yöntemi ile bulaşıcı bir virüs için sivrisinek alanında toplanan ekran. Sivrisinekler tuzak konumu ve türlerine göre sıralanır ve ≤ 50 bireyler içeren havuza gruplandırılmıştır. Pooled örnekleri karıştırıcı değirmen ve sulu faz konfluent Vero hücre kültürlerinde (Klon E6) üzerine inoküle kullanarak tamponlu salin içinde homojenize edilir. Hücre kültürleri 3-7 sonrası aşılama ve hücre kültüründe yetişen herhangi bir virüs uygun tanı testleri tarafından belirlenen gün sitopatik etki izlenir. Bu yaklaşımın kullanılması, Connecticut, ABD toplanan sivrisinekler 9 farklı virüsler izole var, ve bunlar arasında, 5 insan hastalığa neden olduğu bilinmektedir. Bu virüsler Üç (Batı Nil virüsü, Potosi virüs ve La Crosse virüsü), Kuzey Amerika ya da 1999 yılından bu yana New England bölgesi için yeni kayıtlar temsil eder. Geniş bir çeşitlilik virüs tespit yeteneği hem sivrisinek nüfus yılında kurulan ve yeni çıkan virüslere izlenmesi için kritik öneme sahiptir.
Protocol
1. Sivrisinek sıralama ve kimlik
- Aşağıdaki prosedürler canlı sivrisinek ile çalışmak için eğitilmiş personel tarafından adanmış bir biyogüvenlik seviye-2 (BSL-2) laboratuar açık bir laboratuvar tezgahı üzerinde yapılmaktadır. "Soğuk zincir" prosedür boyunca korunur.
- 5 dakika boyunca -20 ° C derin dondurucuda sivrisinek toplama torbası koyarak erişkin sivrisinek canlı anestezisi. Kuru buz içeren bir izolasyonlu konteyner Transfer toplama torbası. Kapağını kapatın ve knock-down tam emin olmak için 1-3 dakika boyunca karbon dioksit sivrisinek maruz.
- Kuru buz bir yatağın üzerine yerleştirilen bir ön-soğutulmuş tavada üzerine anestezi sivrisinek dokunun. Plastik kısmı su bardağı ince forseps ve yerinde kullanarak birbirinden ayrı dişi sivrisinekler. Kapak ve ıslak buz üzerinde yer bardak ile kaplayın.
- Stereo diseksiyon mikroskobu (10-60X zoom) yardımı ile dış sivrisinek morfolojisi dayalı açıklayıcı taksonomik tuşlarını kullanarak türlerin sivrisinek tanımlamak elektronik bir soğuk masaya monte edilebilir.
- Bakır BB içeren 2 ml ek kapaklı şişeleri ≤ 50 bireylerin havuza sivrisinek türü tespit birleştirin. Şişeler, benzersiz bir tanımlayıcı ile etiketlenir.
- Tüm sivrisinekler belirlenmesini takiben, şişeleri etiketli torbalara yerleştirilmiş ve kuru buz içeren plastik bir soğutucu düzenlenecek.
- Sivrisinek havuzları virüs testi kadar -80 ° C derin dondurucuda saklayın.
2. Biyogüvenlik sivrisinek virüs izole etmek için düşünceler
- Aşağıdaki işlemleri 1 çevreleme bu seviyede çalışmak için eğitilmiş personel tarafından bir biyogüvenlik seviye-3 (BSL-3) laboratuvar yapılmaktadır. Laboratuvar olanakları, ekipman, prosedür ve uygulamaları, kurumsal, eyalet ve federal gözetim ve denetimine tabidir. Aşağıdaki protokoller denemeden önce uygun eğitim ve onay isteyin.
- , Tek kullanımlık önlük, eldiven, yüz kalkanları ve solunum gibi her bir işlem için uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin.
- Çalışma yüzeyleri tamamladıktan prosedürler öncesinde ve sonrasında% 70 alkol ile dezenfekte edin.
- Sınıf II Biyogüvenlik kabini (BSC) hücre kültürleri ve potansiyel olarak bulaşıcı malzeme ele alınır.
- Sivrisinek havuzları bir BSC içine yerleştirilen bir karıştırıcı değirmen homojenize.
- Sivrisinek homojenatlarında sıkı bir aerosol mikrosantrifüj santrifüj. Bu yordamı BSC içinde gerçekleştirilir mümkün değilse işletme ve santrifüj örnekler alınırken, operatör bir maske takmalıdır.
- Pipetler ve BSC (biyogüvenlik kabini) malzeme taşıma pipetlemeyin ipuçları önce otoklav% 10 çamaşır suyu ile ıslatılmış. Tüm laboratuar atık bertarafına kadar önce otoklavlanarak dekontamine.
3. Vero hücrelerinde hazırlanması
- Çamaşır suyu içeren atık behere konfluent Vero hücreleri (Klon E6) büyük bir doku kültürü balonuna (175 cm 2) Durusu kültür ortamı.
- 5 ml PBS kısım ve hücre tabakası üzerinde ve tüm tek tabaka iyice karşılamak için emin olun balonun kenarları boyunca girdap ekleyerek Vero hücreleri yıkayın.
- Durusu PBS atık behere.
- 2,5 ml tripsin-EDTA ve tüm tek tabaka iyice karşılamak için emin olun hücre tabakası üzerinde girdap ekleyin.
- 37 5 dakika boyunca inkübatörde balon ° C'de,% 5 CO 2.
- Alt yüzeyindeki hücreleri çıkarmak için yavaşça sallamak ve girdap şişesi. Hücreleri kolayca kaydırarak; hücreleri kolayca kaydırarak yoksa ek bir 1-5 dakika inkübe edin.
- 5 Minimal Essential Medya mL (MEM),% 5 fetal sığır serumu (FBS), serolojik pipetlemeyin kullanarak ve pipetlemeyin ekle yukarı ve aşağı hücre kümeleri break up için 10-20 kez.
- Toplam hacmi 22.5 mL için ek bir 15 mL MEM,% 5 FBS ekleyin ve iyice karıştırın.
- 40 küçük doku kültürü şişeleri (25 cm 2) dik iki rafları (20 şişeler / raf) olarak yerleştirin.
- Biyogüvenlik kabini içinde şişelerin bulunduğu raflara yerleştirin ve şişe kapakları önünde yerleştirerek, şişesi kapakları kaldırmak.
- MEM,% 5 FBS serolojik pipetlemeyin kullanarak her balona 4 mL koyun.
- Her balona (~ 01:06 bölme oranı) şişesi kapakları değiştirin 0.5 mL askıya hücreleri koyun.
- Geri kalan hücre süspansiyonu (~ 2.5 mL) içeren orijinal büyük doku kültürü şişesi,% 5 FBS MEM, 50 ml ekleyin ve inkübatör şişeyi geri. Aynı büyük doku kültürü şişesi 5 pasajlar yeniden kullanılabilir ve daha sonra yeni bir balon değiştirmek için set-up olmalıdır.
- Yığınlar halinde tepsiye yerleştirin küçük doku kültürü şişeleri. Medya düzgün flaks alt kapsadığını emin olmak için Swirl tepsi.
- 37 kuvöz küçük şişeler ° C,% 5 CO 2 ve% 80-90 konfluent kadar bir gecede büyümek yerleştirin.
4. Sivrisinek havuzları hazırlanması
- Sivrisinek havuzları test işlemleri sırasında soğuk tutun. Önceden soğutulmuş kullanın.rafları ve dondurucu karıştırıcı değirmen kasetleri, buz reaktifler ve soğutmalı santrifüj sivrisinek havuzları işleme.
- Yeri tüpler önceden soğutulmuş dondurucu raf sivrisinek içeren ve 1 - 1,5 ml PBS-G sivrisinekler, her tüp.
- Dondurucu karıştırıcı değirmen kaset al. Sonra her kaset içine koyun ve 24 tüplü karıştırıcı değirmen güvenli.
- 4 dakika 25 devir / saniye örnekleri homojenize. Mikser değirmen sivrisinek dokuyu bozan, yüksek hız ve her tüp içinde bir metal BB tüpler sallar.
- 7,000 rpm hızında 6 dakika için borular santrifüjleyin.
- Dondurucu raflar yerleştirmek tüpler Vero hücre içine inoküle kadar.
5. Sivrisinek havuzu homojenatlarında Vero hücreleri Aşılanması
- Yeterli confluency ve hücre sağlığını sağlamak için her bir serinin en az bir doku kültür şişelerinde inverted mikroskop altında kontrol edin;% 80-90 kapsama alanı hakkında bekliyoruz.
- Hat kadar her sivrisinek havuzu karşılık gelen üyelik numaraları ile bir raf ve etiket şişeler 20 küçük doku kültürü şişeleri.
- Kapaklar ve atık behere doku kültürü şişeleri medya süzün en gevşetin. Balonuna yeterli medya tamamen kat hücre tek tabaka bırakın.
- Ilgili doku kültürü balona her işlenmiş sivrisinek havuzu süpernatant kısım 100μL.
- Kültür şişesi kapağı yerine takın ve sıkın.
- 35-40 rpm'de 5 dakika (oda sıcaklığı) çalkalamalı kültür şişeler düz yatırın.
- 20 doku kültürü şişeleri BSC bir raf ve yerinde dik pozisyona dönün.
- Bir seferde 3 doku kültürü şişeleri Sır, serolojik bir pipet kullanarak her bir balona 4 mL büyüme ortamı dağıtmak; kapakları yerine.
- Pipet ucu kültür şişelerinde boyun veya dudak temas etmediğinden emin olun. Temas şişesi ile yapılır, gerektiğinde pipet uçları değiştirin.
- 37 inkübe doku kültürü şişeleri ° C,% 5 CO 2.
6. Vero hücreleri virüs büyüme Eleme
- Ekran, 3-7 gün sonrası aşılama, viral enfeksiyon belirtileri, sitopatik etki (CPE), doku kültürü şişeler inoküle.
- Görme şişeler bükerek, CPE ve / veya kirlenme hücre kültürleri incelemek ve medya inceleyerek balonun altındaki havuzları. Hücrelerin CPE sırasında bozulabilir ya da büyüme, maya, mantar, veya bakteriyel kontaminasyon nedeniyle medya bulutlu görünecektir.
- Ters bir mikroskop altında bulutlu medya sergi hücre kültürleri yeniden inceleyin. Virüsler hücreleri deforme olmaya ve kültür şişeler düşebileceği neden olacaktır. Görünür kirleticiler, örneğin maya, diğer bakteri, mantar ya da ağır sivrisinek enkaz, hücre kültürleri 0.22μM şırınga filtresi sayesinde orijinal sivrisinek havuzu geçerek yeniden test edilmektedir.
- Aseptik serolojik bir pipet kullanarak etiketli cryotubes virüs pozitif hücre kültürleri medya 1-2 mL dağıtılıp.
- Virüs kültürler -80 saklanan ° C uygun tanı testleri ile tespit kadar.
7. Reaktiflerin hazırlanması
- MEM,% 5 FBS. 4 L gg H 2 0 son bir hacmi 37.6 gr toz MEM eritin. Çözüm medya şişe ve otoklavda 500 ml alikotları içine koyun. Çözüm soğuduğunda, aseptik her bir şişe 26 ml ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu, 5.2 mL L-Glutamine, 5.2 ml anti-biotic/mycotic ve 10.4 ml% 7.5 sodyum bikarbonat ekleyin. 4 ° C saklayınız
- PBS-G. 16 g NaCl, 0,4 g KCI, 2.3 g Na 2 HPO 4, 0.4 g KH 2 PO 4, ve% 0.5 fenol Red 4 ml, 1000 ml dd H 2 0 içine çözülür . 2 N NaOH (gerekirse) 7,1-7,4 pH ayarlayın. Ayrı bir beher, ısı 600 kaynamaya H 2 0 ml. Hot-plate çıkar, 10 gr jelatin ekleyin ve çözülür. PBS çözüm çözünmüş jelatin solüsyonu ekleyin ve 2 L dd H 2 O. ile son ses seviyesini ayarlamak 100 ml solüsyon şişeleri ve otoklav içine koyun. Çözüm soğuduğunda, aseptik olarak 42.8 mL ısı ile inaktive edilmiş tavşan serumu ve 1.4 mL anti-biotic/mycotic ekleyin. 4 ° C saklayınız
- PBS hücre yıkayın. 400 mL gg H 2 O. 50 ml 10X Dulbecco'nun PBS 2 N NaOH ile pH 7.1 'e ayarlayın. Dd H 2 O. ile 500 mL son ses seviyesini ayarlayın 0.2uM vakum filtre ünitesi ile filtre çözüm. 5 ml alikotları 8 ml vidalı kapaklı tüpler içine koyun. 4 ° C saklayınız
8. Temsilcisi Sonuçlar
4 taksonomik ailelerden gelen virüslerin Dokuz farklı 1997-2010 (Tablo 1) Connecticut eyalet çapında sürekli gözetim sırasında toplanan sivrisinekler kurtarıldı. Bu virüsler Beş insan hastalığı, Batı Nil virüsü ve doğu at ensefaliti virüsü olan en önemli patojenlerin neden olduğu bilinmektedir. Yeni keşifler toplanan sivrisinekler WNV ilk izolasyonKuzey Amerika, 1999 2 2005 4 2000 3 kuzeydoğu ABD'de Potosi virüsün ilk izolasyon, ve New England'da La Crosse virüsünün ilk izolasyon.
| Virüs | Aile | No izole | No yerlerde | No yıl denetliyor | Insan hastalığı | Refs. |
| Batı Nil virüsü | Flaviviridae | 1.002 | 94 | 12 | Orta şiddetli, ateş, ensefalit | 2,5 |
| Doğu at ensefaliti virüsü | Togaviridae | 292 | 41 | 10 | Şiddetli, ensefalit | 6,7 |
| Highlands J virüsü | Togaviridae | 178 | 39 | 11 | Bilinmiyor | 6 |
| Jamestown Kanyon virüsü | Bunyaviridae | 305 | 74 | 14 | Hafif ve orta şiddette, ateş, menenjit | 8 |
| Potosi virüs | Bunyaviridae | 259 | 76 | 4 | Bilinmiyor | 3 |
| Cache Valley virüs | Bunyaviridae | 114 | 51 | 8 | Iki belgelenmiş durumda şiddetli, ateş, nörolojik hastalık Hafif | |
| Trivittatus virüs | Bunyaviridae | 83 | 21 | 11 | Bilinmiyor | |
| La Crosse virüsü | Bunyaviridae | 1 | 1 | 1 | Orta şiddetli, ensefalit | 4 |
| Flanders virüs | Rhabdoviridae | 4 | 4 | 2 | Bilinmiyor |
Tablo 1. Virüsler Vero hücre kültürü yöntemi ile alanında toplanan sivrisinekler algılandı. Sivrisinekler 1997-2010 Connecticut eyalet çapında gözetim sırasında toplanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vero hücre kültürü testi virüs bir çeşitlilik için ekran alan toplama sivrisinekler için etkili bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Bu özellikle hedef bir veya bir kaç ilgi virüslerin moleküler yöntemler tezat. Ayrıca, Vero hücre kültürü tahlil eşit değilse, RT-PCR 7 daha hassas ve gelecek çalışmalar için referans koleksiyonu saklanır virüs izolatları ile bize sunuyor bulduk . Bununla birlikte, hücre kültürü sistemleri, birçok durumda uygun olmayabilir. Bu yaklaşım, ek masraf ve BSL-3 laboratuvar virüslerin büyümesi için gerekli eğitim oluştuğunda; Ancak, bu maliyetler, hücre kültürü için nispeten ucuz kaynakları tarafından mahsup edilebilir. Aynı zamanda en tümünü değil, sivrisinek yoluyla bulaşan virüsler Vero hücre kültürü 9,10 CPE üretmek fazlalaştı . Dang virüsü Bir istisna dışında başka bir tanı testi ile taranmalıdır. İdeal olarak, hem moleküler ve hücre kültürü yöntemleri bir arada viral enfeksiyon için test etmek için kullanılır. Şu anda hücre kültürü izole virüsleri tespit etmek ve sivrisinek havuzda enfeksiyon teyit, bazen sıralama ile bağlantılı olarak, konvansiyonel ve kantitatif RT-PCR testleri 4,11,12 kullanıyorsunuz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz minnetle, Dr önemli katkılar kabul. John Anderson, Andrew Ana ve bu çalışmanın Shirley Tirrell. Bu çalışma Merkezleri Hastalık Kontrol ve Önleme (U50/CCU116806-01-1) ve ABD Tarım Bakanlığı (58-6615-1-218, CONH00768 ve CONH00773) hibe kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | GIBCO, by Life Technologies | 25080 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11700 | |
| 10X Dulbecco’s PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14080 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15400 | |
| Rabbit serum | GIBCO, by Life Technologies | 16120 | |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon BD | 353112 | |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon BD | 353108 | |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
- Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , American Public Health Association. 189-212 (1995).
- Karabatsos, N. International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).
- Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
- Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).
