Summary
نحن تصف طريقة لعملية وشاشة الميدانية التي تم جمعها. البعوض لمجموعة متنوعة من الفيروسات من خلال فحص خلايا فيرو الثقافة من خلال استخدام هذه التقنية ، وقد اكتشفنا 9 فيروسات مختلفة من الأسر التصنيفية 4 في البعوض التي تم جمعها في ولاية كونيتيكت.
Abstract
أنواع البعوض أن تنقل عددا من الفيروسات متميزة بما في ذلك مسببات الأمراض البشرية الهامة مثل فيروس غرب النيل ، وفيروس حمى الضنك ، وفيروس chickungunya. وقد كثفت العديد من هذه الفيروسات في نطاقاتها المتوطنة وتوسيعها لمناطق جديدة ، مما يستدعي المراقبة والسيطرة الفعالة برامج للرد على هذه التهديدات. استراتيجية واحدة لمراقبة نشاط فيروس ينطوي على جمع أعداد كبيرة من البعوض من المواقع الموبوءة واختبارها للعدوى الفيروسية. في هذه المقالة ، ونحن تصف كيفية التعامل معها ، والعملية ، والشاشة التي تم جمعها ميدانيا البعوض عن الفيروسات المعدية التي فيرو الخلية مقايسة الثقافة. يتم فرز حسب الموقع البعوض وأنواع الشرك ، وتجميعها في أحواض تحتوي على ≤ 50 فردا. والمتجانس العينات المجمعة مخزنة في المياه المالحة باستخدام خلاط ، مطحنة ، وتحصين المرحلة المائية متكدسة على الثقافات الخلية فيرو (استنساخ E6). ويتم رصد مزارع الخلايا لتأثير الاعتلال الخلوي من الأيام المحددة 3-7 بعد التلقيح وأي فيروسات نمت في الثقافة الخلية المقايسات التشخيصية المناسبة. باستخدام هذا النهج ، ونحن عزل 9 فيروسات مختلفة من البعوض التي تم جمعها في ولاية كونيتيكت ، الولايات المتحدة الأمريكية ، وبين هؤلاء ، ومن المعروف أن تسبب المرض 5 الإنسان. ثلاثة من هذه الفيروسات (فيروس غرب النيل ، وفيروس بوتوسي ، ولوس انجليس لفيروس كروس) تمثل سجلات جديدة لأمريكا الشمالية أو منطقة نيو إنجلاند منذ عام 1999. القدرة على الكشف عن تنوع واسع من الفيروسات أمر بالغ الأهمية لرصد كل من أنشأ والفيروسات الناشئة حديثا في أسراب البعوض.
Protocol
1. الفرز وتحديد البعوض
- يتم تنفيذ الإجراءات التالية على مقاعد البدلاء في مختبر مفتوح مخصص للسلامة الأحيائية من المستوى 2 المختبرات (BSL - 2) من قبل الموظفين الذين تم تدريبهم للعمل مع البعوض تعيش. ويحتفظ "سلسلة التبريد" في جميع أنحاء الداخلي.
- تخدير يعيش البعوض البالغ البعوض عن طريق وضع كيس جمع في الثلاجة ° -20 لمدة 5 دقائق. نقل حقيبة جمع إلى حاوية تحتوي على الثلج الجاف المعزولة. إغلاق الغطاء وفضح البعوض إلى ثاني أكسيد الكربون عن 1-3 دقائق لضمان استكمال تدق إلى أسفل.
- اضغط على البعوض تخدير مقلاة المبردة قبل وضعها على سرير من الثلج الجاف. إناث البعوض منفصلة الفردية باستخدام ملقط وغرامة مكان في أكواب جزء من البلاستيك. مع تغطية غطاء الكؤوس ومكان على الجليد الرطب.
- شنت التعرف على أنواع البعوض باستخدام مفاتيح التصنيف الوصفي على أساس مورفولوجيا البعوض الخارجية بمساعدة مجهر تشريح ستيريو (10 - 60X تكبير) على جدول البرد الإلكترونية.
- الجمع بين أنواع البعوض التي تم تحديدها في برك من الأفراد في 50 ≤ 2 قارورة الإضافية سقف مل تحتوي على أكواد النحاس. وصفت قنينات مع معرف فريد.
- بعد التعرف على كل أنواع البعوض ، توضع في أكياس عبوة وصفت والذي عقد في برودة الستايروفوم تحتوي على الثلج الجاف.
- برك تخزين البعوض في الثلاجة حتى -80 درجة مئوية اختبار الفيروس.
2. اعتبارات السلامة الأحيائية لعزل الفيروس من البعوض
- يتم تنفيذ الإجراءات التالية في مستوى السلامة الحيوية في المختبرات - 3 (BSL - 3) من قبل الموظفين الذين تم تدريبهم للعمل في هذا المستوى من الاحتواء 1. مرافق المختبرات والمعدات والإجراءات والممارسات وتخضع لرقابة المؤسسات ، والدولة ، والحكومة الفدرالية والتفتيش. يسعى التدريب المناسب والموافقة عليها قبل محاولة البروتوكولات التالية.
- ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) لكل إجراء مثل العباءات القابل للتصرف ، والقفازات ، ودروع لحماية الوجه ، وأجهزة التنفس.
- تطهير أسطح العمل مع الكحول 70 ٪ قبل وبعد استكمال الإجراءات.
- يتم التعامل مع الثقافات الخلية والمواد التي قد تكون معدية في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية (BSC).
- والمتجانس تجمعات البعوض في طاحونة خلاط التي يتم وضعها داخل ش.
- وطرد البعوض الخليط في الهباء microcentrifuge محكم. إذا لا يمكن أن يتم تنفيذ هذا الإجراء ضمن BSC ، يجب على المشغل ارتداء جهاز تنفس صناعي عند التشغيل واسترداد عينات من أجهزة الطرد المركزي.
- هي غارقة Pipets ومناولة المواد الماصة نصائح في BSC (السلامة مجلس الوزراء) في المبيض بنسبة 10 ٪ قبل التعقيم. هو تطهير جميع النفايات بواسطة التعقيم المختبر قبل التخلص منها.
3. إعداد خلايا فيرو
- صب سائل الإعلام من ثقافة واحدة كبيرة الأنسجة قارورة ثقافة (175 سم 2) من خلايا فيرو متموجة (استنساخ E6) في دورق النفايات المحتوية على مواد التبييض.
- غسل خلايا فيرو بإضافة قسامة 5 مل من خلال برنامج تلفزيوني ودوامة طبقة من الخلايا وعلى طول جانبي قارورة التأكد من تغطية شاملة أحادي الطبقة بأكملها.
- صب برنامج تلفزيوني في دورق النفايات.
- إضافة 2.5 مل من التربسين - EDTA ودوامة أكثر من طبقة من الخلايا مع التأكد من تغطية شاملة أحادي الطبقة بأكملها.
- احتضان القارورة في الحاضنة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2.
- يهز بلطف وقارورة دوامة لإزالة الخلايا السطحية من القاع. وينبغي أن الخلايا الشريحة قبالة بسهولة ؛ احتضان إضافي 1-5 دقائق إذا الخلايا لا تنزلق بسهولة.
- إضافة 5 مل من وسائل الإعلام الأساسية الدنيا (MEM) ، و 5 ٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، وذلك باستخدام الماصة المصلية والماصة حتى ونزولا 1-20 مرات لتفريق كتل من الخلايا.
- إضافة 15 مل MEM إضافية ، و 5 ٪ عن حجم FBS الاجمالية 22.5 مل وتخلط جيدا.
- 40 مكان زراعة الأنسجة الصغيرة قوارير (25 سم 2) في اثنين من الرفوف تستقيم (20 قوارير / الرف).
- وضع رفوف تحتوي على قوارير داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية وإزالة قبعات القارورة ، ووضع القبعات مباشرة أمام القوارير.
- الاستغناء عن 4 مل من MEM ، FBS 5 ٪ في كل قارورة باستخدام الماصة المصلية.
- الاستغناء عن 0.5 مل الخلايا علقت في كل قارورة (~ تقسيم نسبة 1:6) استبدال قبعات القارورة.
- إضافة 50 مل من MEM ، 5 ٪ FBS العودة إلى الأصل قارورة كبيرة نسيج الثقافة التي تحتوي على خلية تعليق المتبقية (~ 2،5 ملل) والعودة إلى الحاضنة القارورة. قد تكون هي نفسها زراعة الأنسجة دورق كبير إعادة استخدام ما يصل الى 5 الممرات ثم قارورة الجديدة يجب ان تكون انشاء ليحل محله.
- ثقافة مكان في قوارير صغيرة الأنسجة كدسات على الدرج. دوامة الدرج للتأكد من أن وسائل الإعلام بشكل موحد يغطي الجزء السفلي من flaks.
- مكان قوارير صغيرة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5 ٪ (2) وتنمو بين عشية وضحاها حتى متموجة 80-90 ٪.
4. إعداد تجمعات البعوض
- إبقاء تجمعات البعوض الباردة خلال إجراءات الاختبار. قبل استخدام المبردرفوف الثلاجة والمسجلات وخالط طاحونة والكواشف الجليد الباردة ، وأجهزة الطرد المركزي المبردة عند معالجة تجمعات البعوض.
- مكان الأنابيب التي تحتوي على البعوض الحامل في الثلاجة قبل المبردة وإضافة 1 -- على كل من البعوض أنبوب 1.5 مل PBS - G.
- استرداد خلاط طاحونة شرائط من الفريزر. 24 مكان الأنابيب في كل كاسيت ثم أمنا في طاحونة خلاط.
- التجانس العينات لمدة 4 دقائق في 25 دورة / ثانية. الطاحونة خلاط يهز أنابيب في سرعة عالية وBB المعدنية داخل أنبوب يعطل كل الأنسجة البعوض.
- أنابيب الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في 7000 دورة في الدقيقة.
- أنابيب المكان مرة أخرى إلى رفوف الثلاجة حتى تلقيح في خلايا فيرو.
5. تلقيح خلايا فيرو مع الخليط تجمع البعوض
- الاختيار واحد على الأقل قارورة زراعة الأنسجة من كل مجموعة تحت المجهر المقلوب أن أؤكد الصحية الملائمة confluency والخلية ، ونتوقع تغطية حوالي 80-90 ٪.
- يصطف 20 قوارير صغيرة زراعة الأنسجة في رفوف وقوارير التسمية مع انضمام أعداد مماثلة من كل تجمع البعوض.
- القبعات وتخفيف صب معظم وسائل الإعلام من قوارير زراعة الأنسجة في دورق النفايات. ترك ما يكفي من وسائل الاعلام في القارورة إلى معطف تماما المونولاير الخلية.
- 100μL قسامة من طاف من كل تجمع البعوض المصنعة في نسيج الثقافة قارورة المقابلة.
- استبدال ثقافة وتشديد غطاء القارورة.
- إرساء ثقافة مسطحة على قوارير شاكر لمدة 5 دقائق (درجة حرارة الغرفة) في 35-40 دورة في الدقيقة.
- عودة 20 قوارير زراعة الأنسجة لموقف تستقيم في رفوف ومكانته في ش.
- Uncapping 3 قوارير زراعة الأنسجة في وقت واحد ، 4 وسائط النمو الاستغناء مل في كل قارورة باستخدام ماصة المصلية ؛ استبدال القبعات.
- تأكد من أن الطرف ماصة لا اتصال الرقبة قارورة الثقافة أو الشفة. تغيير نصائح ماصة عند الضرورة إذا تم الاتصال مع القارورة.
- احتضان قوارير زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2.
6. فحص خلايا فيرو للنمو الفيروس
- الشاشة تلقيح قوارير زراعة الأنسجة لعلامات العدوى الفيروسية ، وتأثير الاعتلال الخلوي (CPE) ، 3-7 أيام بعد التلقيح.
- تفقد البصر الثقافات الخلية و / أو التلوث بواسطة CPE إمالة القوارير وفحص وسائل الاعلام ان تجمعات في الجزء السفلي من القارورة. وسوف تظهر وسائل الإعلام وغائما الخلايا التدهور خلال CPE أو نتيجة لنمو الخميرة والفطريات ، أو التلوث الجرثومي.
- إعادة النظر في الثقافات الخلية الذي يحمل وسائل الإعلام غائم تحت مجهر مقلوب. والفيروسات التي تسبب الخلايا لتصبح مشوهة ، وسوف كسر فضفاضة من قوارير الثقافة. والثقافات الخلية مع الملوثات مرئية ، مثل الخميرة ، والبكتيريا الأخرى ، والفطريات أو الثقيلة الحطام البعوض ، وإعادة اختباره من قبل تمرير تجمع البعوض الأصلي من خلال مرشح 0.22μM المحاقن.
- الاستغناء عن جو معقم و مطهر 1-2 تراخيص وسائل الإعلام من الفيروسات الإيجابية في الثقافات الخلية المسمى cryotubes باستخدام ماصة المصلية.
- يتم تخزين الثقافات الفيروس في -80 درجة مئوية حتى تحديدها باستخدام فحوصات التشخيص المناسب.
7. إعداد الكواشف
- م ، 5 ٪ FBS. حل 37،6 غراما من مسحوق MEM في الحجم النهائي من 4 لتر من H 2 0 د. الحل في الاستغناء عن 500 مل aliquots في زجاجات وسائل الإعلام والأوتوكلاف. عندما حل قد بردت ، إضافة جو معقم و مطهر للحرارة 26 المعطل مل مصل بقري جنيني ، 5.2 مل L - الجلوتامين ، anti-biotic/mycotic 5.2 مل ، و 10.4 مل بيكربونات الصوديوم 7.5 ٪ على كل زجاجة. المحل في 4 درجات مئوية.
- PBS - G. حل 16 ز كلوريد الصوديوم ، 0.4 غرام بوكل ، 2.3 ز نا 2 هبو 4 ، 0.4 غرام KH 2 ص 4 ، و 4 مل من الفينول الأحمر 0.5 ٪ إلى 1000 ه د مل 2 0. ضبط الرقم الهيدروجيني ل7،1-7،4 مع هيدروكسيد الصوديوم N 2 (إذا لزم الأمر). في دورق منفصل ، والحرارة 600 مل من H 2 0 ليغلي. إزالته من لوحة الساخنة ، إضافة 10 غرام الجيلاتين ، وتذوب. إضافة محلول الجيلاتين المذاب في حل برنامج تلفزيوني وضبط الحجم النهائي إلى 2 لتر مع 2 د O. H الاستغناء عن 100 مليلتر من المحلول في زجاجات والأوتوكلاف. عندما حل قد بردت ، إضافة جو معقم و مطهر 42.8 مل مصل الأرنب الحرارة المعطل و 1.4 مل anti-biotic/mycotic. المحل في 4 درجات مئوية.
- PBS الخلية يغسل. إضافة 50 مل 10X Dulbecco في برنامج تلفزيوني و 400 مل د O. 2 H ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.1 مع هيدروكسيد الصوديوم N 2. ضبط الحجم النهائي الى 500 مل مع 2 د O. H تصفية حل مع 0.2uM فراغ وحدة التصفية. في الاستغناء عن 5 مل aliquots في 8 الأنابيب الحلزونية سقف مل. المحل في 4 درجات مئوية.
8. ممثل النتائج
تم انتشال تسع مختلفة من الفيروسات من الأسر التصنيفية 4 من البعوض التي تم جمعها خلال المراقبة المستمرة على مستوى الولاية في ولاية كونيتيكت 1997-2010 (الجدول 1). عرف عن خمس من هذه الفيروسات تسبب الأمراض التي تصيب البشر ، ومسببات الأمراض أهمها فيروس غرب النيل وفيروس التهاب الدماغ الخيلي الشرقي. الاكتشافات الجديدة ما يلي : الأول من العزلة WNV من البعوض التي تم جمعها فيأمريكا الشمالية في عام 1999 2 ، وأول عزل فيروس بوتوسي في شمال شرق الولايات المتحدة في 2000 (3) ، وعزل الأول من الفيروس لا كروس في نيو انغلاند في 2005 4.
| فيروس | عائلة | رقم يعزل | رقم المواقع | الكشف عن رقم سنة | مرض الإنسان | الحكام. |
| فيروس غرب النيل | الفيروسات المصفرة | 1002 | 94 | 12 | معتدلة إلى حادة والتهاب الدماغ والحمى | 2،5 |
| فيروس التهاب الدماغ الخيلي الشرقي | الفيروسات الطخائية | 292 | 41 | 10 | حادة والتهاب الدماغ | 6،7 |
| المرتفعات J الفيروس | الفيروسات الطخائية | 178 | 39 | 11 | لا يعرف | 6 |
| جيمستاون كانيون الفيروس | الفيروسات البنياوية | 305 | 74 | 14 | خفيفة الى معتدلة ، والحمى ، والتهاب السحايا | 8 |
| بوتوسي الفيروس | الفيروسات البنياوية | 259 | 76 | 4 | لا يعرف | 3 |
| ذاكرة التخزين المؤقت وادي الفيروس | الفيروسات البنياوية | 114 | 51 | 8 | معتدلة وحادة ، والمرض ، حمى العصبية في اثنين من الحالات الموثقة | |
| Trivittatus الفيروس | الفيروسات البنياوية | 83 | 21 | 11 | لا يعرف | |
| لا كروس الفيروس | الفيروسات البنياوية | 1 | 1 | 1 | معتدلة الى الدماغ ، وشدة | 4 |
| فلاندرز الفيروس | Rhabdoviridae | 4 | 4 | 2 | لا يعرف |
الجدول 1. الكشف عن الفيروسات في الميدان البعوض التي جمعتها الخلية فيرو مقايسة الثقافة. وقد تم جمع البعوض خلال المراقبة على مستوى الولاية في ولاية كونيتيكت 1997-2010.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فيرو مقايسة خلية ثقافة بمثابة وسيلة فعالة للبعوض الشاشة الميدانية التي تم جمعها لمجموعة متنوعة من الفيروسات. هذا يتناقض مع الأساليب الجزيئية التي تستهدف على وجه التحديد واحد أو عدد قليل من الفيروسات الفائدة. علاوة على ذلك ، وجدنا أن فيرو مقايسة ثقافة الخلية بنفس القدر إن لم يكن أكثر حساسية من RT - PCR (7) ويوفر لنا مع الفيروسات المعزولة التي تم تخزينها في جمع مرجعنا للدراسات المستقبلية. ومع ذلك ، قد نظم زراعة الخلايا قد لا يكون مناسبا في حالات كثيرة. هذا النهج يتكبد نفقات إضافية والتدريب اللازم للنمو الفيروسات في مختبر BSL - 3 ، ولكن يمكن تعويض هذه التكاليف عن طريق امدادات رخيصة نسبيا للثقافة الخلية. ومن الجدير بالذكر أيضا أن معظم ولكن ليس كل الفيروسات التي تنتقل عن طريق البعوض انتاج التعليم المهني المستمر في الثقافة خلية فيرو 9،10. فيروس حمى الضنك هو استثناء واحد لافتا أن لا بد من فحص اختبار تشخيصي آخر. من الناحية المثالية ، يتم استخدام مزيج من الأساليب الثقافة على حد سواء الجزيئية والخلوية لاختبار للعدوى الفيروسية. نحن نستخدم حاليا التقليدية والكمية RT - PCR المقايسات 4،11،12 ، وأحيانا بالاشتراك مع تسلسل ، إلى التعرف على الفيروسات المعزولة في خلية ثقافة ، وإعادة تأكيد الإصابة في تجمع البعوض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نحن نعترف بامتنان بالمساهمات الهامة من الدكاترة. جون أندرسون ، واندرو شيرلي Tirrell الرئيسية لهذه الدراسة. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (U50/CCU116806-01-1) وزارة الزراعة الأمريكية (58-6615-1-218 ، CONH00768 وCONH00773).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16140 | |
| Anti-biotic/mycotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | GIBCO, by Life Technologies | 25080 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | GIBCO, by Life Technologies | 11700 | |
| 10X Dulbecco’s PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14080 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 15400 | |
| Rabbit serum | GIBCO, by Life Technologies | 16120 | |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 | |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon BD | 353112 | |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon BD | 353108 | |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 | |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 | |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
References
- Chosewood, L. C., Wilson, D. E. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5 edn, U.S. Government Printing Office. (2007).
- Anderson, J. F. Isolation of West Nile virus from mosquitoes, crows, and a Cooper's hawk in Connecticut. Science. 286, 2331-2333 (1999).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Main, A. J. Isolations of Potosi virus from mosquitoes (Diptera: Culicidae) collected in Connecticut. J Med Entomol. 42, 875-881 (2005).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. A new genetic variant of La Crosse virus (Bunyaviridae) isolated from New England. Am J Trop Med Hyg. 75, 491-496 (2006).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Vossbrinck, C. R., Main, A. J. Epidemiology of West Nile virus in Connecticut, USA: a five year analysis of mosquito data 1999-2003. Vector Borne Zoonotic Dis. 4, 360-378 (2004).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Tirrell-Peck, S. J. Multiple isolations of eastern equine encephalitis and highlands J viruses from mosquitoes (Diptera: Culicidae) during a 1996 epizootic in southeastern Connecticut. J Med Entomol. 35, 296-302 (1998).
- Armstrong, P. M., Andreadis, T. G. Eastern equine encephalitis virus in mosquitoes and their role as bridge vectors. Emerg Infect Dis. 16, 1869-1874 (2010).
- Andreadis, T. G., Anderson, J. F., Armstrong, P. M., Main, A. J. Isolations of Jamestown Canyon virus (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) from field-collected mosquitoes (Diptera: Culicidae) in Connecticut, USA: a ten-year analysis, 1997-2006. Vector Borne Zoonotic Dis. 8, 175-188 (2008).
- Lennette, E. H., Lennette, D. A., Lennette, E. T. Chapter 11. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial, and Chlamydial Infections. , American Public Health Association. 189-212 (1995).
- Karabatsos, N. International Catalogue of Arboviruses Including Certain Other Viruses of Vertebrates. , American Society of Tropical Medicine and Hygiene. (1985).
- Lanciotti, R. S. Rapid detection of west nile virus from human clinical specimens, field-collected mosquitoes, and avian samples by a TaqMan reverse transcriptase-PCR assay. J Clin Microbiol. 38, 4066-4071 (2000).
- Lambert, A. J., Martin, D. A., Lanciotti, R. S. Detection of North American eastern and western equine encephalitis viruses by nucleic acid amplification assays. J Clin Microbiol. 41, 379-385 (2003).
